Введение

Протеолиз — это ферментативное расщепление белков и пептидов, играющее ключевую роль в поддержании белкового баланса (протеостаза) в клетке и организме человека. Он осуществляется с участием различных ферментативных систем, важнейшими из которых в эукариотических клетках являются убиквитин-протеасомная и лизосомная/аутофагическая системы. Эти системы действуют как активные регуляторы клеточного цикла, сигнальной передачи, ответа на стресс и регуляции гомеостаза [1, 2]. Протеолитические системы организма человека представляют собой комплексы ферментов и механизмов, обеспечивающих расщепление белков путем гидролиза пептидных связей, что имеет фундаментальное значение для поддержания гомеостаза и регуляции биологических процессов как на клеточном, так и на организменном уровне [3]. Убиквитин-протеасомная система является основным механизмом селективной деградации растворимых белков внутри клетки. Белки, подлежащие удалению, сначала маркируются убиквитином — небольшим (8—9 кДа) полипептидом, который присоединяется каскадом ферментов E1, E2 и E3, — а затем направляются в 26S протеасому, микросомальную протеазу, где расщепляются до коротких пептидов. Этот процесс обеспечивает не только удаление поврежденных белков и белков с нарушенной конформацией, но и контролируемую деградацию активных, короткоживущих регуляторных белков, включая регуляторы клеточного цикла, сигнальные компоненты и проапоптотические белки [2, 4]. Считается, что этот процесс играет важную роль в поддержании протеостаза, регуляции клеточного цикла, репарации ДНК и иммунного ответа, а его нарушения (например, в системе E3-лигаз) связаны с онкологическими, неврологическими заболеваниями, а также с заболеваниями иммунной системы [4, 5]. Лизосомная система включает катепсины и механизмы аутофагии. Лизосомы расщепляют крупные структуры, которые не могут быть удалены системой убиквитина, включая долгоживущие белки, макромолекулярные комплексы, клеточные органеллы и большие белковые агрегаты. При макроаутофагии элементы цитоплазмы окружены мембраной аутофагосомы и направляются к слиянию с лизосомой, где расщепляются протеолитическими ферментами, преимущественно катепсинами [6, 7].

Значение протеолитических систем в диагностике и прогнозе течения нейродегенеративных заболеваний: нейрофибриллярная деменция и болезнь Альцгеймера

Нейрофибриллярная деменция представляет собой патологический механизм заболевания, включающий внутриклеточные структуры (нейрофибриллярные клубки), состоящие из гиперфосфорилированного белка тау. В нормальном нейроне тау стабилизирует микротрубочки. При чрезмерном фосфорилировании и неправильной пространственной укладке он теряет эту функцию и начинает образовывать агрегаты, формируя парные спиралевидные филаменты. Это приводит к дефициту аксонального транспорта и, в конечном итоге, к синаптической дисфункции и гибели нейронов [8, 9]. Количество и распределение нейрофибриллярных клубков коррелируют со степенью и типом деменции [10], но не полностью ее объясняют. Болезнь Альцгеймера является причиной нейрофибриллярной деменции. Болезнь Альцгеймера гетерогенна с точки зрения как патологии, так и клинических симптомов [11, 12]. Дифференциация подтипов основывается на распределении патологии белка тау в головном мозге и степени атрофии. Типичный подтип характеризуется одновременным наличием изменений в гиппокампе и ассоциативной коре. Кроме того, выделяют лимбический подтип с доминирующей патологией в лимбической системе, подтип с сохранением гиппокампа и подтип с минимальной атрофией [11, 12]. Существует также второй патологический механизм, основанный на накоплении нейротоксического β-амилоида в виде отложений, нарушающих нейрональную коммуникацию и вызывающих дегенерацию. Структуры β-амилоида в мозге пациента с болезнью Альцгеймера формируют смесь разветвленных и неразветвленных фибрилл и протофиламентов, расположенных параллельно и в виде сетей, тогда как патологические структуры белка тау представляют собой однородные, неразветвленные филаменты, сгруппированные в кластеры со структурными вариациями в зависимости от субклеточной локализации [13]. Наличие нейрофибриллярных клубков тау без значительной β-амилоидной патологии характеризует первичную, связанную с возрастом таупатию, и у некоторых пожилых людей такие изменения наблюдаются при относительно сохраненных когнитивных функциях или легких нарушениях; это означает, что деменция может как развиться, так и не развиться [14, 15]. Эти пациенты отличаются от больных болезнью Альцгеймера с β-амилоидной патологией прежде всего меньшей частотой аллеля APOE ε4 [16]. Амилоидогенный процесс начинается с патологического влияния на белок-предшественник амилоида (APP) ферментами β- и γ-секретазами, что приводит к образованию Aβ-пептидов (особенно Aβ1-42), которые агрегируют в олигомерные и фибриллярные формы и откладываются вне клетки в виде амилоидных бляшек. Следовательно, это нарушение баланса между продукцией и клиренсом Aβ. Накопление Aβ приводит к активации киназ и нарушениям нейрональной сигнализации, вызывая дисфункцию рецепторов, окислительный стресс и нарушение ионного гомеостаза, что является причиной синаптической нейротоксичности [17]. Модуляторы киназ и фосфатаз, регулирующих фосфорилирование белка тау, играют ключевую роль в формировании патологических структур белка тау. Чрезмерная активность киназ (серин-треониновая киназа GSK-3β, CDK5 и p38 митоген-активируемая протеинкиназа — MAPK) и сниженная активность фосфатаз приводят к гиперфосфорилированию белка тау, его диссоциации от микротрубочек и внутриклеточной агрегации в нейрофибриллярные клубки [18]. Существует патологическая синергия между двумя путями. Конформационные изменения белка тау и β-амилоида, т.е. структурные переходы от мономерных, растворимых форм к организованным патологическим структурам, имеют фундаментальное значение для их агрегации, токсичности и распространения патологии в ЦНС [19]. Фрагменты Aβ и белка тау демонстрируют прямое конформационное взаимодействие в гетерогенных олигомерах [20]. В ходе прогрессирования заболевания эта неблагоприятная синергия проявляется таким образом, что агрегаты Aβ создают среду, в которой патологические формы белка тау быстро пролиферируют и формируют различные типы агрегатов [21]. При болезни Альцгеймера особенно важны следующие сигнальные пути, связанные с обработкой белков в нейронах: путь Ras-ERK, являющийся частью каскада киназ MAPK (регулирующего пролиферацию, дифференцировку и апоптоз), влияет на нейрональный клеточный цикл, и его активация как амилоидом, так и белком тау способствует нейродегенерации. Путь PI3K/AKT/mTOR, входящий в сигнальную сеть роста и выживания клеток, модулирует аутофагию и апоптоз, влияя как на патологию амилоида, так и на белок тау. Пути JNK (также связанные с MAPK) и GSK-3β способствуют апоптозу и фосфорилированию тау, в то время как путь BDNF/TrkB/CREB, отвечающий за синаптическую пластичность и выживание нейронов, противодействует токсичности обоих типов агрегатов [22, 23]. Основным клинически используемым биомаркером болезни Альцгеймера является снижение уровня Aβ1-42 в цереброспинальной жидкости в сочетании с повышенными уровнями фосфорилированного белка тау и общего белка тау [24, 25]. Также было замечено, что ферментативное расщепление APP β-секретазой (BACE1) и γ-секретазой приводит к образованию Aβ-пептидов, поэтому активность BACE1 в цереброспинальной жидкости также может служить биомаркером [26]. Эффективные биомаркеры были также выявлены в сыворотке периферической крови. Более низкое соотношение Aβ1-42/Aβ1-40 и более высокие концентрации фосфорилированного tau181 (p-tau181), глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) и легкой цепи нейрофиламента (NfL) соответствуют наличию патологии Aβ и связаны с прогрессирующим снижением конгнитивных функций [27]. Сильными сывороточными биомаркерами также являются концентрация фосфорилированного tau217 (p-tau217) и соотношение p-tau217 к Aβ1-42 [28].

Болезнь Паркинсона и другие нейродегенеративные заболевания

Белок α-синуклеин (α-син) играет центральную роль в патогенезе болезни Паркинсона. Это эндогенный нейрональный белок, особенно обширно представленный в пресинаптических терминалях, выполняющий физиологическую функцию поддержания динамики синаптических везикул и нейротрансмиссии. Патологическим феноменом является его интранейрональное агрегирование в форме телец Леви и нейритов Леви [29], поэтому дисфункция протеолитических систем имеет определяющее значение при данном заболевании. Убиквитин-протеасомная система отвечает за деградацию растворимых форм α-сина, тогда как система аутофагии-лизосом устраняет более крупные олигомеры и агрегаты этого белка [30]. Мутации в гене SNCA (кодирующем α-син), такие как A53T, A30P и др., способствуют конформационным изменениям белка и ускоряют агрегацию и формирование структур, богатых β-складчатыми слоями [31]. Белок α-син обладает конформационной подвижностью, и его структура зависит от молекулярного окружения — взаимодействий с другими белками и липидами [32]. Накопление α-сина ограничивается убиквитин-протеасомной и аутофагической-лизосомной системами, поэтому их дисфункция коррелирует с накоплением аномальных белков и действует как нейродегенеративный стрессор. Измененная активность протеасомы и повышенные уровни убиквитинированных белков в клетках и периферической крови пациентов указывают на то, что измерение функции UPS или маркеров, связанных с убиквитинированием α-сина, может иметь диагностическое или прогностическое значение при этом заболевании [33—35]. Биомаркеры также включают α-син и его различные формы (включая агрегаты и фосфорилированную форму) в цереброспинальной жидкости и крови, сниженные уровни антиоксидантного белка DJ-1 (PARK7) в цереброспинальной жидкости и потенциально в сыворотке крови, NfL и измерения лизосомальных ферментов или других белков, связанных с деградацией. Кроме того, изучаются сигнальные, оксидативные и генетические биомаркеры (мутации LRRK2, SNCA), а также молекулы, обнаруженные в экзосомальных везикулах [36—38]. При лобно-височной дегенерации нейропатология в основном основана на накоплении специфических белков в нейронах и глиальных клетках. Доминирующий тип патологической белковой конформации определяет клиническую классификацию заболевания. Агрегаты белка тау могут присутствовать в телах нейронов, их отростках, а также в глиальных клетках. Подтипы тау-включений различаются в зависимости от того, содержат ли они изоформы тау с тремя (3R) или четырьмя (4R) повторами [39]. Второй тип заболевания включает белок, связывающийся с ДНК, массой 43 кДа (TDP-43), в качестве преобладающего патологического белка. В этой группе агрегаты TDP-43 появляются как цитоплазматические включения нейронов, а различные подтипы можно отличить по их распределению [40]. Четвертый, редкий вариант содержит включения из ассоциированных агрегатов белка FUS (FUsed in Sarcoma) [41]. Эти патологии проявляются не только в нейронах, но и в глиальных клетках, включая астроциты. Астроглиальная патология способствует нейродегенерации через отложение аномальных белков (GFAP, тау, TDP-43) в астроцитах, нарушающее их функции поддержки нейронов [42]. Формой лобно-височной дегенерации является болезнь Пика, при которой доминирующие патологические тау-изоформы — изоформы с тремя повторами, связывающими микротрубочки (3R-тау), формирующими характерные округлые цитоплазматические включения (тельца Пика) [43]. Для обеих патологических форм концентрации убиквитинированных и протеасомных белков в цереброспинальной жидкости и сыворотке крови, а также маркеры аутофагии/митофагии рассматриваются как потенциальные индикаторы нарушения процессов деградации белков при этом заболевании. Кроме того, рассматриваются мутации в генах (VCP и CHMP2B), которые модулируют убиквитин-протеасомную систему и аутофагию, как возможные маркеры [44, 45]. При прогрессирующем надъядерном параличе основным нейропатологическим механизмом является накопление патологических агрегатов тау-белка, особенно изоформы тау с четырьмя повторами, связывающими микротрубочки (4R-тау) [46]. Помимо преобладания 4R-тау над 3R-тау в нейрональных включениях [46], наблюдаются гиперфосфорилирование белка тау (посттрансляционная модификация, снижающая сродство тау к микротрубочкам и способствующая агрегации) [47], формирование прямолинейных филаментных структур в нейронах [48], а также присутствие 4R-тау в различных типах клеток мозга (нейроны, астроциты, олигодендроциты), включая характерные «пучкообразные» астроциты [49]. Протеомные исследования цереброспинальной жидкости выявили изменения в уровнях различных белков, включая ATP6AP2 и LAMP2 (связанных с лизосомной функцией и протеолитическими процессами), а также нейрофиламент средней цепи (NEFM), что позволяет предполагать, что нарушения в путях деградации белков, связанных с лизосомами и протеостазом, при этом заболевании открывают путь к созданию профиля биомаркеров [50]. При кортикобазальной дегенерации пучкообразные астроциты не наблюдаются; вместо них присутствуют специфические астроцитарные включения, известные как астроцитарные бляшки (патологические скопления гиперфосфорилированного белка тау) [51]. Доминирующей таупатией также является 4R-тау [52]. В дополнение к биомаркерам, рассматриваемым для прогрессирующего надъядерного паралича, перспективными биомаркерами при кортикобазальной дегенерации могут быть белки, отражающие дисфункцию убиквитин-протеасомной системы [53].

Заключение

Основное значение протеолитических систем в патогенезе описанных заболеваний заключается в возможности определения диагностических и прогностических показателей, поскольку их активность и продукты взаимодействия с разными метаболитами служат постоянным источником биомаркеров. К ним относятся: уровни компонентов и активности убиквитин-протеасомной и аутофагической-лизосомной систем в биологических жидкостях; продукты расщепления, образующиеся под действием секретаз и отражающие наличие токсичных фрагментов предшественников белков; профили экспрессии и активности протеаз — особенно матриксных металлопротеиназ, участвующих в ремоделировании тканей и структурной дестабилизации; а также сериновых протеаз и их субстратов во внеклеточной среде. В случае нейродегенеративных заболеваний такие маркеры могут выполнять как диагностическую, так и прогностическую функцию.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.