Редакторы оснований ДНК — перспективный инструмент для генной терапии вирусных инфекций человека

Инструмент геномного редактирования должен обладать приемлемой эффективностью, контролируемым нецелевым эффектом и отсутствием мутагенных последствий. С открытием нуклеаз TALEN и нуклеаз на основе белков, содержащих домен «цинковые пальцы» (ZFN) начались активные работы по редактированию клеточных геномов. Данные нуклеазы позволяют избирательно вносить двуцепочечные разрывы в ДНК генома. Но в случае перепрограммирования для нацеливания на другой участок необходима замена значительного аминокислотного домена белков обеих групп TALEN и ZFN. А сама оптимизация при нацеливании на конкретный участок является трудоемкой [1, 2]. Многообещающей альтернативой выступила открытая следом система редактирования CRISPR-Cas. Данная система состоит из нуклеазы Cas, которая связывается с направляющей RNA (gRNA). gRNA комплементарна участку нацеливания на ДНК или РНК в зависимости от белка Cas [3]. При перепрограммировании на другие участки задача заключается в замене небольшой по длине gRNA. Это делает систему CRISPR-Cas мобильнее по сравнению с ZFN и TALEN. К тому же CRISPR-Cas системы проще в оптимизации нацеливания на участок редактирования. Однако это не исключает нежелательные геномные перестройки вследствие двуцепочечных разрывов. Поиск безопасного инструмента геномного редактирования привел к развитию редакторов оснований ДНК, механизм действия которых заключается в точечном редактировании азотистого основания по механизму дезаминирования. При этом в ДНК клетки не вносятся двуцепочечные разрывы, что существенно снижает мутагенный эффект [4]. Для доставки редакторов оснований к месту редактирования применяют упомянутые ранее CRISPR-Cas системы. Для предотвращения двуцепочечных разрывов используют каталитически неактивные формы Cas белков, так называемые dCas изоформы [5]. Впрочем, в последних исследованиях предпочтения отдаются Cas12m белкам [6, 7]. Несомненным преимуществом данной группы Cas белков является отсутствие каталитической активности даже в диком типе и поразительно малые размеры по сравнению с другими белками Cas. MmCas12m, выделенный из Mycolicibacterium mucogenicum, состоит из 596 аминокислот [7]. Для сравнения широко применяемый SpCas9 состоит из 1368 аминокислот. Небольшие размеры Cas12m белков позволяют закодировать его в одну экспрессионную кассету вместе с редактором оснований для доставки в клетки с помощью векторов на основе аденоассоциированных вирусов (AAV), которым отдается предпочтение при генной терапии [6]. Это позволило редакторам оснований быстро найти применение в многочисленных исследованиях за последние годы.

Представленные на данный момент редакторы оснований ДНК делятся на три группы: редактор оснований цитозина (CBE), аденина (ABE) и двойные редакторы оснований, обладающие свойствами первых двух групп.

Редакторы оснований цитозина. Основой для CBE послужила группа природных цитидиндезаминаз. Способность представителей данной группы ферментов заключается в дезаминировании цитозина, что приводит к его превращению в урацил, который образует водородную связь с аденином. В таком случае воздействие CBE приводит к замене пары C-G на пару T-A после репликации.

Первый рекомбинантный ДНК-специфичный CBE был создан путем слияния крысиного APOBEC1 (rAPOBEC1) с dCas9 посредством линкера XTEN. Так был получен рекомбинантный белок, показавший 50% эффективность дезаминирования цитозина в ДНК в условиях in vitro. Впрочем, испытания in vivo продемонстрировали эффективность на уровне 0,8—7,7% [8]. Это объясняется ответной реакцией ферментов репарации на образующийся при дезаминировании гетеродуплекс U-G в ДНК. Неканоническая пара оснований, вызванная возникновением урацила в положении цитозина, приводит к активации урацил-ДНК-гликозилазы (UDG). Задача UDG заключается в удаление урацила из ДНК [9]. Дальнейшие механизмы эксцизионной репарации оснований приводят к восстановлению цитозина в окне редактирования.

Чтобы повысить эффективность защиты урацила от ферментов репарации к С-концу BE1 был присоединен ингибитор UDG бактериофага PBS1 — UGI [8]. Так возник редактор оснований второго поколения — BE2, эффективность которого была в среднем в 3 раза выше, чем при использовании BE1.

Чтобы повысить эффективность редактирования оснований сверх этого предела, были предприняты попытки инициировать репарацию неотредактированной цепи ДНК, содержащей гуанин [8]. Для этого в dCas9 был восстановлен остаток гистидина в положении 840, что привело к возможности внесения одноцепочечного разрыва в цепь ДНК, спаренной с gRNA. Внесение подобного разрыва приводит к репарации по матрице уже отредактированной цепи, в которой после редактирования располагается урацил. UGI также сохранен на С-конце белкового комплекса. Эффективность редактирования in vivo достигла 37%, что в 1,5—2 раза выше в сравнении со вторым поколением.

Дальнейшие модификации заключались в добавлении второй копии UGI к C-концу BE3. Так был получен редактор четвертого поколения — BE4 [10]. Добавление сигналов ядерной локализации (NLS) как на N-, так и на C-конец белкового комплекса (BE4max) и замена rAPOBEC-1 на оптимизированный APOBEC (AncBE4max) привела к повышению эффективности редактирования in vivo до 67% [11].

Редакторы оснований аденина. При дезаминировании аденозина образуется инозин, который воспринимается ферментами матричного синтеза как гуанин, в результате чего при синтезе дочерней цепи ДНК происходит замена пары A-T на C-G. Природные аденозиндезаминазы существуют, но субстратом для них преимущественно являются молекулы РНК. Так, например, у человека целое семейство аденозиндезаминаз, специфичных к двуцепочечной РНК, кодируются генами группы ADAR [12]. Разнообразие расширяют многочисленные аденозиндезаминазы тРНК — TadA, специфичные к одноцепочечной структуре РНК [13]. Тестирование различных природных аденозиндезаминаз на способность редактировать молекулы ДНК не показало обнадеживающих результатов [14]. С целью создания подобной аденозиндезаминазы, специфичной к ДНК, был применен подход направленной эволюции. За исходную форму для создания ДНК-специфичной аденозиндезаминазы была взята тРНК-аденозиндезаминаза Escherichia coli — ecTadA, которая преобразует аденин в инозин в одноцепочечной части антикодоновой петли тРНК-Arg [15]. Выбор был обусловлен тем, что по структуре ecTadA близка к ABOPEC [16]. Внесение мутаций A106V и D108N в ecTadA и ее слияние с nCas9 (D10A) посредством XTEN линкера привело к созданию первого редактора оснований аденозина в ДНК, названного ABE1.2. Однако эффективность редактирования целевых последовательностей ДНК посредством полученного фермента оказалось низкой — около 3,2%. Но приобретение специфичности к ДНК послужило отправной точкой к созданию различных модификаций уже с большей эффективностью и сниженным нецелевым эффектом. Полученный с помощью ряда модификаций АВЕ7.10 показал 58% эффективность редактирования в целевых локусах клеток линии HEK293 [17].

Двойные редакторы оснований ДНК. Создание единого редактора оснований, способного к дезаминированию аденина и цитозина, сделало бы систему редактирования весьма универсальной. Подобные редакторы оснований были получены путем слияния BE3 и ABE7.10 с nCas9 [18]. Анализ эффективности выявил закономерность: активность цитидиндезаминазы BE3 была значительно повышена, когда она была присоединена к N-концу ABE7.10. Добавление NLS и двух копий UGI привело к повышению эффективности редактирования до 30% в условиях in vitro.

Безусловно, подобная система, сочетающая в себе несколько функционально значимых доменов, имеет специфику, которая может являться недостатком в конкретных случаях в зависимости от цели исследователя. Во-первых, оба домена конкурируют за редактирования оснований. После того, как мишень была отредактирована одним доменом редактора, другой домен редактора оснований не будет функционировать с такой же эффективностью, поскольку теперь sgRNA не полностью комплементарна целевой последовательности ДНК. Во-вторых, большие размеры подобной системы затрудняют ее доставку в целевые ткани или органы в случае генной терапии. С целью решения данной задачи были предприняты попытки создания сверхкомпактного двойного редактора оснований. С помощью направленной эволюции TadA-8e удалось получить новый редактор оснований, обладающий одновременной способностью к дезаминированию аденина и цитозина с эффективностью 80% и 73% соответственно [11]. Новый фермент, получивший название TadDE (TadA-based dual editor), обладает компактными размерами, что может значительно упростить его доставку в клетки с помощью AAV, которым отдается предпочтение при разработке препаратов генной терапии [19].

Подобный потенциал редакторов оснований был применен для генной терапии вирусных инфекций человека. Некоторые проведенные работы показали обнадеживающие результаты.

Вирус иммунодефицита человека 1-го типа. ВИЧ-1 вызывает хроническую инфекцию с последовательным развитием синдрома приобретенного иммунодефицита [20]. Существующие препараты комбинированной антиретровирусной терапии позволяют продлить жизнь инфицированного, но не излечивают его полностью. По причине этого подобная терапия должна длиться в течение всей жизни, несмотря на различные негативные побочные эффекты. Т-клетки, несущие на своей поверхности рецептор CD4 и корецепторы CCR5 или CXCR4, являются основными клетками-мишенями для заражения ВИЧ-1 [21]. Ключевую роль при заражении играют штаммы, обладающие тропизмом к CCR5. Следовательно, инактивация гена CCR5 способна вызвать устойчивость Т-клеток к подобным CCR5-тропным штаммам ВИЧ-1. Это было подтверждено в работах по инактивации гена CCR5 с помощью нуклеаз ZFN и CRISPR-Cas систем [22, 23]. Однако внесение двуцепочечных разрывов, опосредованное этими методами, вызывает мутагенные хромосомные перестройки, такие как делеции и транслокации [24]. В работе F. Knipping и соавт. для инактивации генов CCR5 и CXCR4 применили подход на основе внесения преждевременных стоп-кодонов или мутагенеза старт-кодона посредством редакторов оснований [25]. Для инактивации генов корецепторов посредством внесения преждевременных стоп-кодонов был применен редактор оснований BE4max, слитый с SpCas9-NG. Дополнительно для инактивации гена CCR5 путем мутагенеза старт-кодона был применен редактор оснований ABE8e, слитый с SpCas9-NG. Анализ редактирования с помощью методов секвенирования нового поколения (NGS) показал, что эффективность инактивации гена CCR5 с помощью BE4max достигла около 68%. Мутагенез старт-кодона с помощью ABE8e показал эффективность около 87%. Чтобы оценить влияние инактивации генов корецепторов на защиту от ВИЧ-1, отредактированные Т-клетки подвергали заражению дефектными к репликации лентивирусами различной тропности: CCR5 или CXCR4. Эффективность защиты от инфекции достигла около 88% и 86% соответственно.

Хронический гепатит B. Хронический гепатит B остается глобальной проблемой человечества. Согласно данным всемирной организации здравоохранения, около 250 миллионов человек во всем мире инфицированы вирусом гепатита B (HBV) [26]. Геном HBV сохраняется в ядре инфицированных гепатоцитов в виде кольцевой ковалентно замкнутой ДНК (ккзДНК), которая служит для репликации вирусного генома [27]. Применение одобренных препаратов на основе аналогов нуклеотидов позволяет значительно замедлить репликацию вируса путем ингибирования вирусной обратной транскриптазы. Однако полное излечение от HBV-инфекции невозможно из-за способности ккзДНК к интеграции в геном [28]. Следовательно, необходимы лекарственные препараты, способные инактивировать как ккзДНК, так и интегрированную ДНК HBV. В работе E.M. Smekalova и соавт. в качестве инструмента геномного редактирования был взят BE4, доставляемый с помощью Cas9 [29]. С целью предварительного выявления наиболее эффективных gRNA клетки линии HepG2-NTCP заражали HBV, а затем проводили трансфекцию мРНК, кодирующих редактор оснований и различные gRNA. Две gRNA подбирались для введения преждевременного стоп-кодона в гены HBs и Precore. Было выявлено, что редактирование приводило к снижению уровня вирусных белков HBsAg, HBeAg, а также ДНК и прегеномная РНК (pregenomic RNA) HBV. Затем было смоделировано редактирование интегрированной в геном клетки-хозяина ДНК HBV. Для этого клетки линии HepG2.2.15, несущие интегрированные димерные геномы HBV, способные к репликации, были подвергнуты трансфекции мРНК, кодирующих BE4 и gRNA. На 6-й день после трансфекции наблюдалось значительное снижение уровня внеклеточного и внутриклеточного белка HBsAg в отредактированных клетках. Оценка редактирования оснований с помощью NGS показала эффективность около 60% при введении преждевременных стоп-кодонов в гены HBs и Precore. Дальнейшие испытания in vivo на линии мышей HBV minicircle, поддерживающих репликацию HBV, образование ккзДНК и экспрессию вирусных антигенов, также показало обнадеживающие результаты. Мышам внутривенно ввели липидные наночастицы, несущие мРНК редактора оснований и gRNA. Через шесть недель после начала лечения с помощью NGS было выявлено, что активность редакторов оснований обусловила введение преждевременного стоп-кодона в положении W156 гена HBs в 30% случаев, а в положении W28 гена Precore — в 42% случаев. В ходе эксперимента еженедельная оценка содержания вирусных белков HBsAg, HBeAg в крови показывала их снижение. При этом у части мышей содержание HBsAg было ниже предела обнаружения. Также было выявлено общее снижение количества вирусной ДНК в клетках печени. В совокупности показано, что редакторы оснований способны вносить мутации как в ккзДНК, так и в интегрированную ДНК HBV, подавляя репликацию HBV и экспрессию вирусных белков.

Лекарственное средство для лечения ишемии нижних конечностей стало первым препаратом генной терапии в Российской Федерации, получившим регистрационное удостоверение к применению в декабре 2011 г. В 2017 г. Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств (FDA USA) зарегистрировало первый в США препарат для генной терапии «Тисагенлеклеусел», направленный на лечение острого лимфобластного лейкоза. На сегодняшний день на сайте FDA USA опубликован список из 40 одобренных к применению препаратов генной терапии различных наследственных заболеваний. Все это свидетельствует о стремительном развитии генной терапии. Это обусловлено открытиями и модификациями инструментов геномного редактирования, среди которых многообещающими являются редакторы оснований ДНК. Эндогенные дезаминазы послужили основой для создания удобного инструмента геномного редактирования не только для фундаментальных исследований, но и для выполнения прикладных задач, например, разработки подходов генной терапии. Редакторы оснований способны точечно вносить однонуклеотидные замены в настраиваемом окне редактирования. Это позволяет не только исправлять однонуклеотидные мутации, но и инактивировать целевые гены или интегрированные провирусы. Преимуществом перед другими системами инактивации генов является отсутствие внесения двуцепочечных разрывов в ДНК при редактировании, что снижает риск нежелательных хромосомных перестроек. Различные модификации редакторов оснований, направленные на повышение эффективности, снижение нецелевого эффекта, уменьшение размеров, делают их перспективным инструментом для создания препаратов генной терапии.

Финансирование. Работа выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (Федеральная научно-техническая программа развития генетических технологий на 2019-2030 годы, соглашение №075-15-2025-526).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.