Влияние блокады рецептора IL-7 на продукцию IFN-γ и IL-4 CD4+-клетками памяти у больных вульгарным псориазом
Журнал: Клиническая дерматология и венерология. 2022;21(2): 194‑200
Прочитано: 942 раза
Как цитировать:
Рецидивирующее течение псориаза свидетельствует о наличии иммунологической памяти при данном заболевании. Впервые об этом заговорили после того, как трансплантация клинически здоровой кожи от пациентов с псориазом мышам с иммунодефицитом привела к развитию клинических и гистологических признаков заболевания у реципиентов [1]. Выявлено, что клинически здоровая кожа при псориазе характеризуется наличием персистирующего воспаления: гены, ассоциированные с функцией Т-лимфоцитов (LCK, TRCb1), и гены провоспалительных цитокинов (IL-17, IL-22, IFN-γ) остаются активными в течение более 3 мес после начала терапии ингибиторами TNF-α [2]. Установлено, что данный процесс поддерживается резидентными клетками памяти (Trm). Trm способны инициировать каскад воспалительных реакций, что приводит к развитию высыпаний в одних и тех же локализациях [3]. O. Gaide и соавт. [4] установили, что резидентные клетки памяти имеют общее происхождение с центральными клетками памяти (Tcm), что указывает на возможность репопуляции пула резидентных клеток памяти кожи за счет центральных Т-клеток памяти.
M. Diani и соавт. [3] в периферической крови больных псориазом выявили прямую корреляционную связь количества CD4+CCR6+-эффекторных клеток памяти (Tem) с величиной PASI и уровнем С-реактивного белка, а также обратную связь количества CD4+CXCR3+-эффекторных клеток памяти и CD4+CLA+-центральных клеток памяти с тяжестью заболевания. Кроме того, выявлена прямая корреляционная связь между количеством CD4+CCR4+-центральных клеток памяти и величиной PASI и обратная связь между количеством CCR5+-центральных клеток памяти и индексом PASI. Эти данные указывают на участие CD4+-центральных и CD4+-эффекторных клеток памяти в развитии заболевания и его рецидивов, что обусловливает необходимость исследования механизмов регуляции данных клеточных популяций при псориазе [5]. Известно, что основную роль в поддержании популяции CD4+-клеток памяти играют IL-7 (в большей степени) и IL-15 (в меньшей степени) [4].
Цель исследования — изучить у пациентов с псориазом влияние блокады IL-7Rα in vitro на продукцию IL-4 и IFN-γ CD4+-центральными и CD4+-эффекторными клеткам памяти.
Материалом для исследования служила гепаринизированная венозная кровь 8 условно здоровых доноров (контрольная группа, средний возраст 42,0±4,4 года) и 12 пациентов с псориазом (средний возраст 35,6±5,7 года, среднее значение PASI 21,06±5,48).
Критерии исключения из исследования: наличие в анамнезе больных онкологических, гематологических и других аутоиммунных заболеваний, прием системных иммуносупрессивных препаратов в течение 3 мес, предшествовавших проведению исследования. Все участники подписали добровольное информированное согласие о включении в исследование.
Выделение мононуклеаров (МНК) периферической крови осуществляли методом центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина (p=1,082 г/л). Неприлипшие клетки аккуратно собирали и использовали для последующей сортировки на CD4+-центральные и CD4+-эффекторные клетки памяти. Прилипающую фракцию получали путем культивирования выделенных МНК в чашке Петри в среде RPMI-1640 (ООО «ПанЭко») с добавлением гентамицина (50 мкг/мл), тиенама (25 мкг/мл) и 10% FCS (HyClon, США), в дальнейшем ее именовали полной культуральной средой. Культивирование осуществляли в течение 1 ч во влажной атмосфере с 5% СО2 при 37°C. Клетки прилипающей фракции собирали с поверхности чашки Петри скребком, подсчитывали цитоз в камере Горяева, затем вносили их в лунки 24-луночных планшетов (TPP, Швейцария) и культивировали в 0,5 мл полной культуральной среды с липополисахаридом (ЛПС) и без него 055:b5 (Sigma, США) в конечной концентрации 10 мкг/мл. ЛПС использовали в качестве провоспалительного фактора. Время культивирования составляло 18—20 ч, после чего клетки собирали, центрифугировали и вновь вносили в те же лунки. К ним добавляли отсортированные CD4+-центральные или CD4+-эффекторные клетки памяти в присутствии и в отсутствие IL-7 и моноклональных антител к IL-7Rα, после чего сокультивировали в течение 4 сут. На 3-й день для активации продукции цитокинов к культурам добавляли форбол-12-миристат-13-ацетат (PMA, 15 нг/мл; Sigma, США) и Ionomycin (2 мкг/мл; Sigma, США), а через 2 ч — блокатор внутриклеточного транспорта Brefeldin A (5 мкг/мл; BioLegend, США), затем инкубировали 20 ч для накопления цитокинов. На 4-й день клетки снимали, отмывали забуференным физиологическим раствором (PBS+EDTA), метили моноклональными антителами к поверхностным антигенам CD4, CD45RO, CCR7 (BioLegend, США). После этого их фиксировали и пермеабилизировали, используя набор Fixation/Permeabilization Solution Kit (BD Cytofix/Cytoperm, США), и метили моноклональными антителами к IL-4 и IFN-γ (BioLegend, США).
Популяции CD4+-центральных (CD4+45RO+ CCR7+) и CD4+-эффекторных (CD4+45RO+CCR7–) клеток памяти получали методом магнитной сортировки, используя частицы, колонки и необходимое оборудование компании Miltenyi Biotec (США). CD4+45RO+CCR7–-клетки получали с помощью негативной магнитной сортировки, CD4+45RO+ CCR7+-клетки получали в 2 этапа: сначала негативной сортировкой CD4+45RO+-клеток, затем позитивной сортировкой из них CCR7+-клеток. Чистота сортировки для CD4+-центральных клеток памяти в среднем составила 84±5%, для CD4+-эффекторных клеток памяти — 77±6,8%. Перед сокультивированием с прилипающей фракцией отсортированные клетки окрашивали витальным красителем CFSE (4 мкМ; Molecular Probes, США), чтобы оценить пролиферативный ответ клеток на IL-7. Избыток красителя удаляли путем добавления эквивалентного объема FCS и последующей отмывки.
Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Statistica 6.0 с применением методов непараметрической статистики (таких как критерий Манна—Уитни, парный критерий Уилкоксона, коэффициент корреляции Пирсона). Различия между группами считали статистически значимыми при p<0,05.
Связывание моноклональных антител с IL-7Rα достоверно снижало число пролиферирующих CD4+-Tcm и CD4+-Tem клеток как в присутствии, так и в отсутствие действия провоспалительного фактора до значений, сопоставимых с клетками культуры без стимуляции, как в группе условно здоровых доноров, так и у пациентов с вульгарным псориазом (рис. 1).
Рис. 1. Пролиферация CD4+-центральных (а) и CD4+-эффекторных (б) клеток памяти периферической крови пациентов с псориазом.
Здесь и на рис. 2: контроль — культуры клеток без стимуляции IL-7, МНК не предобработаны ЛПС; IL-7 — культуры клеток, стимулированые IL-7, МНК не предобработаны ЛПС; IL-7 + анти-CD127 — культуры клеток, стимулированные IL-7, с добавлением моноклональных антител к α-цепи рецептора IL-7 (CD127), МНК не предобработаны ЛПС; IL-7 + ЛПС — культуры клеток, стимулированные IL-7, МНК предобработаны ЛПС; IL-7 + ЛПС + анти-CD127 — культуры клеток, стимулированные IL-7, с добавлением моноклональных антител к α-цепи рецептора IL-7 (CD127), МНК предобработаны ЛПС; * — достоверное снижение пролиферации клеток по сравнению с культурами без добавления моноклональных антител к α-цепи рецептора IL-7, p<0,05.
В контрольной группе IL-7 способствовал достоверно большей продукции IFN-γ Tcm-клетками по сравнению с культурами без стимуляции IL-7. Однако блокада антителами IL-7Rα не оказывала влияния на уровень продукции IFN-γ Tcm-клетками и Tem-клетками in vitro. Достоверных различий по внутриклеточному содержанию IL-4 в обеих исследуемых субпопуляциях клеток во всех вариантах культур не выявлено. Мы ввели индекс соотношения цитокинов Th1/Th2 как частное от числа IFN-γ-позитивных клеток к числу IL-4-позитивных клеток. Блокада IL-7/IL-7Rα сигнального пути in vitro в условиях действия провоспалительного фактора способствовала снижению величины индекса Th1/Th2 в Tem-клетках относительно клеток, стимулированных IL-7. То есть в условиях воспаления in vitro воздействие антителами IL-7Rα приводило к смещению цитокинового баланса в сторону Th2 (см. таблицу).
Влияние блокады IL-7/IL-7Rα сигнального пути на продукцию IL-4 и IFN-γ CD4+-центральными и CD4+-эффекторными клетками памяти в контрольной группе и в модели воспаления in vitro (медианы и интерквартильный размах — 25—75-й процентили)
| Параметры | Tcm | Tem | ||||||||
| контроль | IL-7 | IL-7 + анти-CD127 | IL-7 + ЛПС | IL-7 + ЛПС + анти-CD127 | контроль | IL-7 | IL-7 + анти-CD127 | IL-7 + ЛПС | IL-7 + ЛПС + анти-CD127 | |
| IL-4+-клетки, % | 2,5 (1,3—4,1) | 2,8 (1,0—3,9)* | 3,0 (1,6—4,4) | 3,3 (2,0—3,5) | 3,1 (2,7—5,9) | 1,6 (0,3—4,5) | 1,6 (0,6—6,0) | 2,2 (0,8—6,1) | 1,7 (0,7—5,4) | 2,2 (1,1—6,3) |
| IFN-γ+-клетки, % | 17,7 (4,9—21,8) | 21,4 (9,1—28,4)* | 17,1 (9,4—26,8) | 18,7 (13,5—29,9) | 10,7 (5,2—25,2) | 17,9 (15,4—28,2) | 8,6 (4,6—29,6) | 25,5 (21,1—31,2) | 31,0 (21,0—39,4) | 27,0 (19,3—36,3) |
| Th1/Th2 | 3,1 (2,7—5,9) | 0,1 (2,2—20,3) | 7,8 (4,0—9,6) | 6,7 (3,6—9,3) | 4,2 (1,8—10,2) | 13,8 (3,4—59,7) | 17,9 (4,8—28,1) | 12,8 (4,5—39,0) | 21,9 (5,7—32,2) | 13,3 (4,2—19,3)** |
Примечание. Контроль — культуры клеток без стимуляции IL-7, МНК не предобработаны ЛПС; IL-7 — культуры клеток, стимулированые IL-7, МНК не предобработаны ЛПС; IL-7 + анти-CD127 — культуры клеток, стимулированные IL-7, с добавлением моноклональных антител к α-цепи рецептора IL-7 (CD127), МНК не предобработаны ЛПС; IL-7 + ЛПС — культуры клеток, стимулированные IL-7, МНК предобработаны ЛПС; IL-7 + ЛПС + анти-CD127 — культуры клеток, стимулированные IL-7, с добавлением моноклональных антител к α-цепи рецептора IL-7 (CD127), МНК предобработаны ЛПС. * — достоверные различия по сравнению с контролем без стимуляции IL-7 и ЛПС, p<0,05; ** — достоверные различия по сравнению с клетками, стимулированными IL-7, с предобработкой ЛПС прилипающей фракции МНК, p<0,05.
Эффекторные клетки памяти у пациентов с псориазом характеризовались достоверно меньшим внутриклеточным содержанием IFN-γ по сравнению с клетками контрольной группы. Значимых различий в продукции IL-4 CD4+-клетками памяти у пациентов с псориазом и у условно здоровых доноров не выявлено. При псориазе IL-7 не оказывал значимого влияния на продукцию исследуемых цитокинов. Блокада IL-7Rα в условиях действия ЛПС приводила к снижению количества эффекторных клеток памяти, продуцирующих как IFN-γ, так и IL-4, по сравнению с клетками, культивированными в условиях действия провоспалительного фактора, но без блокады сигнального пути IL-7. На центральные клетки памяти, а также на величину Th1/Th2 блокада рецептора IL-7 статистически значимого влияния не оказывала (рис. 2).
Рис. 2. Блокада α-цепи рецептора IL-7 достоверно снижает количество CD4+-эффекторных клеток памяти, продуцирующих IL-4 и IFN-γ, в условиях действия провоспалительных факторов.
При проведении корреляционного анализа выявлена обратная корреляционная связь между продукцией IL-4 CD4+-эффекторными клетками памяти и тяжестью течения псориаза (значением PASI) (рис. 3).
Рис. 3. Обратная корреляционная связь между количеством CD4+-эффекторных клеток памяти, продуцирующих IL-4, и значением PASI.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что блокада in vitro в течение 6 дней IL-7/IL-7Rα сигнального пути с помощью моноклональных антител к CD127 эффективно подавляет пролиферацию CD4+-центральных и CD4+-эффекторных клеток памяти у условно здоровых доноров и у пациентов с псориазом при стимуляции IL-7 как в присутствии, так и в отсутствие провоспалительного фактора. Блокада IL-7Rα препятствует связыванию IL-7 с рецептором, предотвращая димеризацию и транслокацию в ядро активатора транскрипции STAT-5, который регулирует экспрессию генов, ответственных за пролиферацию Т-клеток. Можно предположить, что связывание с CD127 увеличивает активность ингибитора клеточного цикла p27kip1 [6], а также активирует сигнальный путь PI3K/Akt, что также снижает скорость пролиферации Т-клеток [7]. Таким образом, анти-CD127-антитела оказывают блокирующее (не активирующее) действие на рецептор IL-7. Аналогичные данные получены при исследовании действия анти-IL-Rα-антител на клетки памяти у приматов [8]. В исследовании на мышах с сахарным диабетом 1-го типа показано отсутствие влияния блокады IL-7/IL-7RΑ сигнального пути на пролиферацию Т-клеток памяти. Это объяснялось тем, что при постоянной стимуляции Т-клеток аутоантигенами невозможно снизить пролиферацию Т-лимфоцитов. При этом введение анти-CD127 пациентам с сахарным диабетом 1-го типа приводило к снижению количества CD4+-наивных Т-лимфоцитов, а также эффекторных и центральных клеток памяти по сравнению с группой плацебо [9].
IFN-γ — цитокин иммунного ответа по типу Th1, играет важную роль во врожденном и приобретенном иммунном ответе против вирусов, внутриклеточных микрорганизмов, а также опухолевых клеток. В здоровой коже IFN-γ способствует задержке пролиферации кератиноцитов [10]. При псориазе данный цитокин является связующим звеном между Т-лимфоцитами и кератиноцитами, усиливает миграцию Т-клеток в псориатические очаги [11]. Он индуцирует синтез антиапоптотического белка BCLx и усиливает экспрессию антиапоптотических ферментов и катепсина D в коже, что способствует усилению пролиферации кератиноцитов [12]. N.O. Kurtovic и E.K. Halilovic показали, что уровень IFN-γ в сыворотке крови у пациентов с псориазом выше, чем у здоровых доноров [13], а его содержание в псориатических очагах в 10 раз выше, чем у здоровых добровольцев [14]. Кроме того, у больных псориазом установлена прямая корреляционная связь между содержанием IFN-γ в периферической крови и значением PASI [15]. В нашем исследовании установлено достоверно более низкое количество IFN-γ-продуцирующих CD4+-эффекторных клеток памяти у пациентов с псориазом по сравнению с группой контроля. Можно предположить, что эффекторные клетки, продуцирующие IFN-γ при псориазе, участвуют в репопуляции резидентных клеток памяти, что обусловливает их низкое количество в периферической крови.
IL-4 способствует дифференцировке наивных Т-лимфоцитов в Th2-клетки [16]. Мы выявили обратную корреляционную связь между количеством CD4+-эффекторных клеток памяти, продуцирующих IL-4, и тяжестью псориаза, что свидетельствует о важной роли IL-4 в развитии псориатического воспаления. IL-4 ингибирует ассоциированные с развитием псориатических высыпаний IL-8, IL-19, β-дефензины [17], а также снижает экспрессию IL-17А [18] и продукцию IL-17F [19]. Он действует непосредственно на кератиноциты, ингибируя секрецию ими IL-1β и IL-6 в псориатических очагах [20]. S.E. Jacob и соавт. [15] показали, что содержание Th2-цитокинов (IL-10) в сыворотке крови пациентов с псориазом ниже, чем в сыворотке здоровых доноров, а уровень IL-4 и IL-5 не отличается от показателей здоровых доноров. M. Hahn и K. Ghoreschi [21] установили, что экспрессия IL-4 в коже пациентов с псориазом снижена или отсутствует. Интересно отметить, что терапия псориаза топическими аналогами витамина D3 приводила к снижению продукции Т-клетками IL-17А и к увеличению продукции IL-4 [22], а лечение псориаза препаратом IL-4 сопровождалось снижением величины PASI на 50% и более [17]. В нашем исследовании блокада IL-7Rα не приводила к снижению количества CD4+-клеток памяти, продуцирующих IL-4.
Согласно полученным результатам, у пациентов с псориазом блокада IL-7Rα не приводила к сдвигу баланса Th1/Th2, что можно объяснить наличием иных механизмов регуляции. При этом в условиях действия провоспалительных факторов (ЛПС) регистрировалось снижение количества CD4+-Tem, продуцирующих одновременно IL-4 и IFN-γ.
Полученные данные позволяют предположить, что блокада IL-7Rα CD4+-клеток памяти позволит увеличить длительность ремиссии у пациентов с псориазом благодаря снижению пролиферации клеток, уменьшению количества продуцентов IL-4 и IFN-γ и отсутствию влияния на Th2-звено.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования: Е.А. Блинова, В.А. Козлов
Сбор и обработка материала: А.В. Колерова, Е.А. Блинова
Статистическая обработка данных: А.В. Колерова, Е.А. Блинова
Написание текста: А.В. Колерова
Редактирование: А.В. Колерова, Е.А. Блинова, И.Г. Сергеева
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Authors’ contributions:
The concept and design of the study: E.A. Blinova, V.A. Kozlov
Collecting and interpreting the data: A.V. Kolerova, E.A. Blinova
Statistical analysis: A.V. Kolerova, E.A. Blinova
Drafting the manuscript: A.V. Kolerova
Revising the manuscript: A.V. Kolerova, E.A. Blinova, I.G. Sergeeva
Литература / References:
Подтверждение e-mail
На test@yandex.ru отправлено письмо со ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.
Подтверждение e-mail
Мы используем файлы cооkies для улучшения работы сайта. Оставаясь на нашем сайте, вы соглашаетесь с условиями использования файлов cооkies. Чтобы ознакомиться с нашими Положениями о конфиденциальности и об использовании файлов cookie, нажмите здесь.