Варианты нуклеотидной последовательности в генах IL4 и TNFa у пациентов с дерматозами и ксерозом

Изменение подходов к терапии хронических дерматозов показало, что возможна трансформация клинической картины заболеваний во времени, например процесс, начавшийся как псориатический дерматит, может в последующем развиться в один из двух дерматозов — атопический дерматит (АтД) или псориаз [1]. Помимо этого, наблюдается изменение клинических проявлений заболеваний на фоне биологической терапии, например развитие фенотипа АтД у пациентов с псориазом, получающих антитела к TNFα [2].

Открытие значимости изменений в гене филаггрина (FLG) для развития АтД привело к попыткам проведения заместительной наружной терапии для профилактики развития данного заболевания, но их результат не всегда соответствует предполагаемому [3].

Возможность проведения генетических исследований у пациентов не всегда дает информацию, которую можно сопоставить с данными литературы, что приводит, с одной стороны, к затруднению интерпретации результатов тестов, а с другой — к необходимости подбора генетических биомаркеров для персонализации работы с пациентом при хронических дерматозах.

Цель исследования — сравнить варианты нуклеотидной последовательности (ВНП) в генах FLG и провоспалительных цитокинов у пациентов с дерматозами.

Методом случайного последовательного отбора среди пациентов, обратившихся за амбулаторным лечением к дерматологу в период с 2021 по 2024 г., сформирована группа из 341 пациента с ксерозом и различными дерматологическими заболеваниями. В данной группе было 125 мужчин и 216 женщин в возрасте 20 (6; 33) лет. Дополнительно в исследование включены 78 пациентов контрольной группы (16 мужчин и 62 женщины) в возрасте 30 (23; 44) лет, которые обратились на профилактический осмотр к дерматологу и не имели признаков ксероза, заболеваний кожи на момент осмотра и в анамнезе.

В рамках исследования выделены 4 основные группы наблюдений на основе диагностированных дерматологических заболеваний. В 1-ю группу вошли 154 пациента с АтД легкой и средней степени тяжести (SCORAD<50). Во 2-ю группу включены 11 пациентов с тяжелым АтД (SCORAD>50), у которых ранее наблюдали резистентность к первым линиям терапии, в результате чего они получали дупилумаб как препарат выбора. В 3-ю группу вошли 27 пациентов с псориазом, в 4-ю — 149 пациентов с хроническими кожными процессами без псориаза и АтД. Важным фактором включения пациентов в исследование было наличие сухости кожи.

Проведение работы одобрено локальным этическим комитетом Новосибирского государственного университета (протокол №2 от 22.11.2021).

Для получения материала для генетического исследования стерильным зондом производили забор эпителия слизистой оболочки щеки. Для определения ВНП использовали специфические олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентные зонды, подобранные в лаборатории фармакогеномики ИХБФМ СО РАН. При проведении ПЦР использовали методику TaqMan на амплификаторе Real-Time CFX96 Touch.

Всем пациентам определяли ВНП 2282del4 (rs558269137), R501X (rs61816761), R2447X (rs138726443) в гене FLG и генах цитокинов: интерлейкина-4 (IL4) и фактора некроза опухоли α (TNFA). Считается, что TNFA играет важную роль в развитии воспаления Th1-типа, особенно при псориазе, а IL4 имеет важное значение для развития Th2-воспаления, более характерного для АтД. При работе использовали информацию из базы OMIM.org.

Для проведения статического анализа использовали программу Statistica v. 10 для операционной системы Windows (разработчик «StatSoft», США). В целях выявления различий между исследуемыми группами применяли непараметрический U-критерий Манна—Уитни. Сравнение качественных показателей выполняли с помощью критерия Фишера. Проведена проверка соответствия распределения аллелей и генотипов равновесию Харди—Вайнберга. Оценка влияния генотипа включала расчет показателя отношения шансов (OR). Статистическую значимость различий в распределении генотипов между группами определяли при помощи критерия χ². Статистически значимым считали результат, при котором p<0,05.

В рамках начального этапа исследования проведен тест соответствия распределений аллелей полиморфных вариантов генов FLG, IL4 и TNFA закону Харди—Вайнберга, что подтвердило корректность формирования групп.

На следующем этапе была определена частота встречаемости ВНП у всех участников, включенных как в основные группы наблюдений, так и в контрольную группу (рис. 1).

Рис. 1. Варианты нуклеотидной последовательности у пациентов с АтД, псориазом и участников контрольной группы.

При сравнении групп обнаружено, что большинство пациентов с клинически значимым ксерозом не имели патогенных ВНП в гене FLG. Статистический анализ продемонстрировал ожидаемое увеличение числа пациентов с патогенными ВПН в гене FLG среди пациентов 1-й и 2-й групп, страдающих АтД. Однако значимых различий по частоте встречаемости указанных ВНП в зависимости от степени тяжести заболевания не выявлено.

Частота встречаемости патогенетически значимых ВПН в гене FLG у пациентов с псориазом на фоне ксероза и у лиц, обратившихся на профилактический осмотр, не различалась, патологические ВНП не выявлены у большинства участников этих групп — 92,6% и 94,9% соответственно. Не обнаружено значительных различий по частоте встречаемости патогенных ВНП у пациентов с разными по тяжести формами АтД и ксерозом. Только 26,6% пациентов с легкой и средней степенью тяжестью заболевания и 27,2% пациентов с тяжелым АтД имели патогенные ВПН в гене FLG.

Анализ OR показал, что носители гетерозиготной мутации в гене FLG при ксерозе кожи в 4 раза чаще оказываются в группе пациентов с АтД по сравнению с вероятностью попадания в группу пациентов с псориазом (OR 4,116 (CI 1,305—12,874), χ²=12,21, p=0,0005). Причем вероятность попадания в группу АтД с тяжелым клиническим течением еще выше (OR 5,778 (CI 1,886—17,508), χ²=6,45, p=0,0111).

Далее выполнили оценку частоты аллелей и генотипов гена IL4, гена TNFA у пациентов с заболеваниями кожи и без них (рис. 2, 3). У 63,6% пациентов с тяжелым течением АтД обнаружен генотип C/T. В этой группе больных не встречали генотип T/T. В контрольной группе и у пациентов с АтД легкой и средней степени тяжести генотип T/T выявлен лишь в 3,9% и 2,6% случаев соответственно. Максимальная частота встречаемости генотипа T/T — 11,1% выявлена среди пациентов с псориазом на фоне ксероза кожи.

Рис. 2. Распределение ВНП rs2243250 гена IL4 у пациентов с патологией кожи и участников контрольной группы.

Рис. 3. Генотипы rs1800629 гена TNFA у пациентов с дерматозами на фоне сухости кожи и участников контрольной группы.

У пациентов с тяжелым АтД на фоне сухости кожи чаще, чем в других группах, встречали наличие генотипа G/A TNFA (45,5%). Хотя у участников исследования преобладал генотип G/A(см. рис. 3).

Во всех клинических группах оценена частота встречаемости аллелей «Т» и «А» генов провоспалительных цитокинов IL4 и TNFA(рис. 4).

Рис. 4. Частота минорных аллелей «Т» гена IL4 и «A» гена TNFA.

У пациентов контрольной группы частотность минорной аллели «Т» гена IL4 составила 21,2%. Максимальная частотность данной аллели (31,8%) отмечена у пациентов с тяжелым течением АтД.

В распределении аллелей во 2-й и контрольной группах выявлены статистически значимые различия. При носительстве аллеля «T» отношение шансов иметь проявления АтД тяжелой степени тяжести составило 1,739 (CI 1,004—3,004) (χ²=4,55, p=0,0329).

При тяжелом течении АтД по сравнению с контролем обнаружена более высокая частота минорного аллеля «А» гена TNFA. По этому показателю во 2-й группе по сравнению с 1-й, 3-й, 4-й группами и группой контроля выявлены статистически значимые различия. У носителей аллеля «А» гена TNFa в 2 раза чаще наблюдают АтД тяжелой степени, чем АтД легкой и средней степени тяжести, другие дерматозы или отсутствие патологии кожи (OR 2,029 (CI 1,02—4,017), χ²=12,66, p=0,0004); OR 2,012 (CI 1,014—3,978), χ²=11,94, p=0,0006); OR 2,574 (CI 1,23—5,352), χ²=10,42, p=0,0012 соответственно), и в 3 раза чаще, чем у пациентов с псориазом (OR 3,676 (CI 1,602—8,37, χ²=5,03, p=0,0249).

В ходе исследования для пациентов 1-й и 2-й групп, у которых наиболее часто обнаруживали патоген-ассоциированный ВПН в гене FLG, проведена оценка частоты аллелей «T» гена IL4 и аллели «A» гена TNFA(рис. 5). В результате анализа установлено, что присутствие аллели «T» в гене IL4 и аллели «A» в гене TNFA в комбинации с патогенным вариантом 2282del4 гена FLG ассоциировано с повышенным риском развития тяжелого АтД. Так, для 50% обследованных лиц вероятность возникновения (OR) тяжелого АтД составила 1,739 при p=0,0329 (p<0,05). У 33% пациентов риск был еще выше: OR 2,574 (p=0,0012; p<0,05), что указывает на высокую степень корреляции между наличием указанных генетических маркеров и развитием изучаемого фенотипа. Это является отличительными характеристиками пациентов с тяжелым течением АтД, резистентного к терапии, когда требуется назначение ГИБТ.

Рис. 5. Сравнение частоты минорных аллелей «Т» и «А» генов IL4 и TNFA у пациентов с АтД и патогенными ВНП в гене филаггрина.

Возможность применения в клинической практике генетического тестирования, которая появилась у практических врачей в последнее десятилетие, привела к постановке ряда вопросов, в частности к таким: как интерпретировать полученные результаты и насколько важны и клинически значимы выявленные ВНП в генах?

Растущий интерес к персонализированной медицине, в том числе основанной на понимании значения биомаркеров для прогноза тяжести течения заболеваний или эффективности терапии, также диктует необходимость получения и анализа большого количества данных для определения эндотипов и фенотипов заболеваний, внедрения технологий искусственного интеллекта [4].

Наиболее распространенным в клинической практике является выявление патологического ВНП в гене FLG для решения вопроса о значимости генетических нарушений для развития ксероза кожи у пациентов с различными кожными заболеваниями. Исследования, проведенные в Новосибирске в 2007 г., показали, что ВНП 2282del4 в гене FLG встречается у 3,9% человек в случайной выборке [5], что сопоставимо с данными, полученными на аналогичных выборках в Шотландии и Ирландии [6]. Среди пациентов контрольной группы в нашем исследовании гетерозиготы 2282del4 составили 3,8%, что подтверждает правильность выбора контрольной группы и возможность использования полученных данных для практической работы.

По данными Ю.В. Максимовой и соавт. [7], у пациентов с АтД ВНП 2282del4 в гене FLG встречаются в 12,8% случаев, R501X — в 2,3%. В нашем исследовании, которое также выполнено среди пациентов, проживающих на территории Новосибирска, патогенный полиморфизм 2282del4 гена FLG выявлен у 24% пациентов при легкой и средней степени тяжести АтД, а также у 27,2% пациентов с резистентной к терапии тяжелой формой заболевания. Таким образом, у пациентов с сухой кожей и АтД мутации в гене FLG были выявлены примерно в 2 раза чаще, чем у пациентов с АтД без состояния сухости кожи.

Показано также, что у пациентов с сухой кожей и псориазом данный ВНП встречается в 7,4% случаев, а при других дерматозах — в 11,4% случаев. Полученные данные показывают, что, несмотря на значимость изменений в гене FLG для развития атопических состояний, в клинической практике возможна практически такая же встречаемость данных ВПН у пациентов с сухой кожей и любыми другими дерматозами, что позволяет использовать этот биомаркер как предиктор развития в большей степени ксероза, чем АтД.

Изучение ВНП в генах цитокинов показало взаимосвязь ВНП в гене IL4 с фенотипами АтД, уровнем продукции IgE [8]. В метаанализе 2020 г. проведен анализ сведений о 9579 пациентах с бронхиальной астмой и 9881 пациенте без атопических заболеваний. Показано, что наличие полиморфизма C/T в гене IL4 увеличивает риск атопического заболевания (бронхиальной астмы) у его носителей [9].

В нашем исследовании генотипов rs2243250 гена IL4 показано, что в контрольной когорте доминирует генотип C/C (60,2% пациентов). Этот же генотип также статистически значимо превалирует у пациентов всех групп, за исключением случаев тяжелого течения АтД, где наиболее часто представлен генотип C/T. У пациентов с псориазом и прочими дерматологическими заболеваниями генотип T/T наблюдали чаще, чем в контрольной группе и у пациентов, страдающих АтД.

В контрольной группе ВНП гена TNFA генотип G/G обнаружен в 82% наблюдений. Полученные данные можно сравнить с исследованиями генотипа TNFA у пациентов с другими заболеваниями, в частности у пациентов с артериальной гипертензией, у которых его выявляли в 93,1% случаев [10]. Интересно, что у пациентов с псориазом, при котором артериальная гипертензия является одним из коморбидных состояний, генотип G/G обнаружен в 85,2% случаев. Это, как мы думаем, может указывать на отсутствие важности оценки генотипа TNFA у пациентов с псориазом в качестве биомаркера развития сопутствующих болезней.

Генотип G/A гена TNFA наиболее часто (45,5%) обнаруживали у пациентов с тяжелым течением АтД. Частота его выявления была выше, чем в контрольной группе, а также у пациентов с легким и среднетяжелым течением АтД, сопровождающегося ксерозом, а также при других дерматологических заболеваниях (20,1% и 24,1% соответственно). В контрольной группе этот генотип выявлен у 15,4% обследованных, тогда как у пациентов с псориазом он присутствовал в 14,8% случаев.

С учетом многофункциональной роли цитокинов в различных биологических процессах представляется необходимым провести сравнительный анализ полученных данных не только среди пациентов с дерматологическими заболеваниями, но и среди лиц с другими патологическими состояниями. В частности, у пациентов с артериальной гипертензией и гастроэзофагеальной рефлюксной болезнью (ГЭРБ) выявлены сходные тенденции — увеличение частоты встречаемости генотипа G/A гена TNFA. Так, сочетание артериальной гипертензии и ГЭРБ наблюдали у 31% обследованных, тогда как у пациентов с изолированной артериальной гипертензией данная ассоциация отмечена лишь в 6,9% случаев [10]. Этот вопрос требует дальнейшего междисциплинарного изучения, так как, возможно, генотип G/A гена TNFA можно будет рассматривать как предиктор ряда коморбидных состояний, а не основного дерматологического/сердечно-сосудистого и другого заболевания.

Определение частоты минорных аллелей «Т» гена IL4 и «А» гена TNFA показало, что их встречаемость у лиц, обратившихся на профилактический осмотр, составляет 21,2% и 10,3% соответственно.

Наибольшая частота встречаемости этих аллелей в нашем исследовании выявлена у пациентов с резистентным к терапии течением тяжелого АтД на фоне ксероза — 31,8% и 22,7%. При других дерматозах, протекающих на фоне ксероза кожи, значимых изменений частоты встречаемости данных аллелей у пациентов не обнаружено, а у больных псориазом минорная аллель «А» в гене TNFA встречали даже несколько реже — у 7,4% пациентов.

В рамках исследования генетических ассоциаций у пациентов с АтД проведен анализ комбинаций патологического варианта делеции 2282del4 в гене FLG, а также минорных аллелей «Т» гена IL4 и «А» гена TNFA. У пациентов с тяжелым течением АтД и наличием патологического варианта в гене FLG обнаружено, что аллель «Т» присутствовала в 50% случаев, тогда как аллель «А» выявлена у 33%, что чаще, чем у пациентов с легкой и средней степенью тяжести АтД — 25% и 20% соответственно.

Полученные результаты позволяют рекомендовать проведение у пациентов с АтД и ксерозом генетических исследований на выявление ВНП в гене FLG и при обнаружении патологического ВПН 2282del4 в гене FLG далее проводить определение минорных аллелей «Т» гена IL4 и «А» гена TNFA. Необходимо продолжить исследование характера течения заболеваний у пациентов с дерматологическими патологиями и наличием минорной аллели «A» в гене TNFA для углубленного понимания связи между генетической вариабельностью и клиническими проявлениями заболеваний и возможности использования этих данных как предиктора коморбидных состояний.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Сергеева И.Г., Кох Н.В., Юрина Н.В.

Сбор и обработка материала — Сергеева И.Г., Макеенко О.А., Еремина А.А., Ковалевская-Кучерявенко Т.В., Воронина Е.Н..

Статистическая обработка данных — Еремина А.А., Кох Н.В., Юрина Н.В.

Написание текста — Сергеева И.Г., Макеенко О.А., Еремина А.А., Кох Н.В.

Редактирование — Сергеева И.Г., Кох Н.В.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Authors’ contributions:

The concept and design of the study — Sergeeva I.G., Kokh N.V., Yurina N.V.

Collecting and interpreting the data — Sergeeva I.G., Makeenko O.A., Eremina A.A., Kovalevskaya-Kucheryavenko T.V., Voronina E.N.

Statistical analysis — Eremina A.A., Kokh N.V., Yurina N.V.

Drafting the manuscript — Sergeeva I.G., Makeenko O.A., Eremina A.A., Kokh N.V.

Revising the manuscript — Sergeeva I.G., Kokh N.V.