Поиск диагностических и прогностических биомаркеров иммуновоспалительных дерматозов с помощью проточной цитофлуориметрии

Иммуновоспалительные дерматозы, несмотря на их клиническое разнообразие, нередко характеризуются общими патогенетическими механизмами, в цепочке которых лежат дисфункции в различных звеньях иммунной системы, ассоциированные, поддерживаемые или индуцируемые триггерными факторами различной природы. Поиск и устранение этих факторов являются важнейшими задачами, но, к сожалению, выявить их сложно и не всегда выполнимо, а устранение триггерных факторов зачастую и вовсе невозможно. В связи с этим мы должны посмотреть на патогенез этих дерматозов изнутри, с позиций врожденного и адаптивного иммунитета, управление которым поможет нам достичь желаемых результатов и приблизиться к прерыванию порочного круга взаимодействия триггеров и иммунной системы.

Псориаз и атопический дерматит (АтД) — наиболее распространенные заболевания кожи. В целом и псориаз, и АтД являются примерами заболеваний, при которых углубленное понимание молекулярных механизмов и путей воспаления приводит к успешным терапевтическим разработкам. Несмотря на то что в патогенезе псориаза преобладает иммунный ответ типа Th17 (основанный на выделении интерлейкина (IL)-17 соответствующим подтипом T-хелперов), а при АтД — иммунный ответ типов Th2 и Th22 с общей поляризацией Th1-типа в очагах, вероятно, существуют биомаркеры, общие для этих заболеваний, позволяющие прогнозировать течение дерматоза и фармакологический эффект методов терапии [1—4].

К дерматозам сложного иммуногенеза, для которых отсутствуют как специфические биологические маркеры, так и специфическая этиопатогенетическая терапия, относятся также красный плоский лишай (КПЛ), липоидный некробиоз, инверсные акне, многоформная эритема.

IL-13 и IL-15 известны как биомаркеры синдрома Стивенса—Джонсона и токсического эпидермального некролиза. Уровни IL-13 и IL-15 в образцах плазмы, а также IL-13-позитивных клеток в образцах пораженной кожи в очагах у таких больных были значительно более высокими по сравнению с таковыми в образцах пораженной кожи при многоформной эритеме [5, 6]. Однако эти цитокины не являются специфичными для лекарственных кожных реакций. Уровень IL-13 повышен при атопическом дерматите [2—4], содержание IL-15 также повышено при буллезных заболеваниях, T-клеточной лимфоме и псориазе [2, 4].

S.M. Volkers и соавт. [7] описали клинический случай многоформной эритемы, связанной с микоплазменной инфекцией, и отметили появление CD4⁺CD8⁺-T-лимфоцитов в воспалительном экссудате (пузырной жидкости) — до 50% T-клеток и в периферической крови — 24,9% всех T-клеток до лечения и 13,4% после лечения. Применение системных препаратов привело к регрессу этой клеточной популяции. При этом эти клетки принадлежали к подгруппе CD4^lowCD8^high CD4⁺CD8⁺-T-клеток и, следовательно, могли произойти от зрелых CD8⁺-T-клеток. Кроме того, почти все CD4⁺CD8⁺-T-клетки были TCRVβ2⁺-клетками, что свидетельствует о моноклональной (или олигоклональной) их экспансии, предположительно направленной против определенного антигена. Авторы предположили, что эта популяция CD4⁺CD8⁺-T-клеток была вовлечена в патофизиологию заболевания.

В патогенезе КПЛ участвуют во взаимодействии друг с другом различные популяции T-клеток (CD4⁺, CD8⁺, Tregs), плазмоцитоидные дендритные клетки (пДК) и тучные клетки, при этом запускается сложный воспалительный каскад с повреждением базальных кератиноцитов. Стимулированные внешними агентами (лекарствами, инфекциями, контактными или неизвестными до сих пор аллергенами) пДК и кератиноциты выделяют интерфероны (IFN) 1-го типа, такие как IFN-α, что приводит к активации CD8⁺-цитотоксических T-клеток, вызывающих повреждение базальных клеток эпидермиса с помощью CD4⁺-T-хелперов. Поврежденные базальные кератиноциты привлекают еще больше CD8⁺-T-клеток, что приводит к самоподдерживаему воспалению. RANTES, выделяемый T-клетками, приводит к дегрануляции тучных клеток, выделяющих TNF-α, который, в свою очередь, повышает секрецию RANTES T-клетками, что является еще одним фактором, способствующим формированию петли положительной обратной связи. Во врожденном иммунном ответе также участвуют провоспалительные миелоидные дендритные клетки (mDCs), T-регуляторные клетки (Tregs), полифункциональные T-клетки и Toll-подобные рецепторы (TLRs) [8].

В отношении вышеперечисленных патологий продолжается поиск новых мишеней патогенетически обоснованных целевых препаратов. Выявление и определение биомаркеров для оценки тяжести течения, а также для объективизации оценки эффективности терапии крайне важно.

Цель исследования — изучение иммунофенотипа лейкоцитов периферической крови у пациентов с различными хроническими дерматозами в период рецидива и ремиссии для определения прогностических и диагностических иммунологических маркеров.

Под нашим наблюдением находились 111 больных в возрасте от 18 до 65 лет с хроническими дерматозами: аллергодерматозами (АтД — 25), дерматозами с нарушением пролиферации и дифференцировки кератиноцитов (псориаз вульгарный — 24), реактивными эритемами (многоформная экссудативная эритема — 12), дерматозами с гранулематозной реакцией (липоидный некробиоз — 11), лихеном (КПЛ — 12), заболеванием сально-волосяных фолликулов, апокриновых желез (инверсные акне — 10), бактериальными инфекциями кожи (хронический рецидивирующий фурункулез — 17). Базисная терапия в каждой группе включала традиционную наружную терапию без применения иммунобиологических препаратов.

Субпопуляционный состав лейкоцитов периферической крови определяли методом проточной цитометрии («Beckman Coulter», США) с помощью моноклональных антител к соответствующим антигенам в соответствии с инструкциями производителя в период рецидива и ремиссии заболевания.

Важным показателем состояния врожденного и адаптивного иммунитета является содержание субпопуляций лимфоцитов. У обследованных нами больных АтД в период обострения выявлено повышение процентного и абсолютного содержания CD3-лимфоцитов в периферической крови (81,98±4,15% и 1900,44±190,49 кл/мкл), снижение уровня натуральных киллеров CD45⁺CD3^–CD16/56⁺ (7,42±2,91%) на фоне повышения доли NKT-лимфоцитов (CD45⁺CD3⁺CD16/56⁺; 6,92±8,22%), а также повышение количества лимфоцитов, экспрессирующих γδ-TCR (5,53±2,85) и снижение уровня B-лимфоцитов CD19 (10,57±3,59) (табл. 1)

Таблица 1. Содержание субпопуляций лимфоцитов в периферической крови больных АтД до и после лечения (M±σ)

Примечание. Здесь и в табл. 2—7: М — среднее арифметическое, σ — стандартное отклонение. * — p≤0,05, достоверность различий показателей в группах до и после лечения (по T-критерию Уилкоксона для парных измерений).

После проведенной базисной терапии в период ремиссии у больных отмечена нормализация содержания αβ- и γδ-T-лимфоцитов.

Таким образом, в целом в клеточном составе лейкоцитов крови при АтД можно отметить увеличение доли T-лимфоцитов с небольшим относительным снижением доли B-лимфоцитов. Наблюдали увеличение доли CD4⁺-лимфоцитов со снижением доли CD8⁺-лимфоцитов, что указывает на активацию ключевого звена адаптивного иммунного ответа — T-хелперов. После лечения происходили изменения в противоположном направлении со снижением значения иммунорегуляторного индекса.

Повышалась доля лимфоцитов, экспрессирующих маркер ранней активации CD25, и снижался уровень клеток с рецептором апоптоза CD95, что отражает их увеличенную выживаемость.

Известно, что в патогенезе АтД играют роль различные факторы адаптивного и врожденного иммунитета, в том числе и T-лимфоциты, и NKT-лимфоциты, инфильтрирующие кожу в поражениях. В нашем исследовании доли тех и других в крови были увеличены. Однако если после терапии количество и процент T-клеток в крови уменьшались, то доля NKT-лимфоцитов выросла; можно предположить, что проводимое лечение не затрагивало их на уровне целостного организма.

Роль γδ-T-лимфоцитов в патогенезе АтД остается неясной. Данные об изменении уровня циркулирующих γδ-T-лимфоцитов противоречивы. Установлено снижение уровня циркулирующих NK- и γδ-T-лимфоцитов, нарушение функции которых авторы сочли патогенетическим механизмом АтД, а также повышение уровня γδ-T-лимфоцитов в крови детей с АтД, коррелировавшее с тяжестью заболевания [9].

У обследованных нами больных липоидным некробиозом в период обострения выявлено повышение процентного и абсолютного содержания лимфоцитов CD3⁺CD8⁺ в периферической крови (24,37±4,02% и 425,33±30,22 кл/мкл), снижение содержания B-лимфоцитов CD19⁺ (10,3±3%), повышение количества лимфоцитов с маркером ранней активации CD25⁺ (рецептор для IL-2) (19,13±1,51%), маркер апоптоза CD95⁺ находился на нижней границе нормы (41,5±3%), доля экспрессирующих γδ-TCR была повышена (4,37±2,71%). После проведенной базисной терапии в период ремиссии у больных отмечена нормализация содержания CD3⁺CD8⁺ (30,07±3,16%) (табл. 2).

Таблица 2. Содержание субпопуляций лимфоцитов в периферической крови больных липоидным некробиозом до и после лечения (M±σ)

Изолированное снижение количества CD8⁺-лимфоцитов может быть одним из компонентов патогенеза липоидного некробиоза (нарушение киллерной функции в отношении измененных клеток) либо проявлением смещения функции иммунной системы в сторону иных типов клеток.

КПЛ — хроническое идиопатическое воспалительное заболевание, поражающее кожу и слизистые оболочки. Согласно современным представлениям, иммунопатогенез КПЛ обусловлен клеточно-опосредованной цитотоксичностью, особенно цитотоксическими T-лимфоцитами, на активность которых дополнительно влияют оси Th1 и IL-23/Th-17 [8].

У обследованных нами больных КПЛ в период обострения выявлено повышение процентного и абсолютного содержания лимфоцитов CD3⁺CD8⁺ в периферической крови (26,45±8,38% и 411,83±123,83 кл/мкл), повышение доли NKT-лимфоцитов (6,37±5,56%), клеток с маркером ранней активации CD25⁺ (рецептор для IL-2) (16,26±2,48%), снижение уровня лимфоцитов, экспрессирующих маркер апоптоза CD95⁺ (25,3±10,23%) (табл. 3). Доля γδ-T-лимфоцитов была на верхней границе нормальных значений (3,08±1,34%). После проведенной базисной терапии в период ремиссии у больных отмечена тенденция к повышению доли CD95⁺ (32,72±7,98%) и к снижению доли CD25⁺-клеток (11,23±1,04%), что отражает снижение активации иммунного ответа и повышение готовности иммунных клеток к апоптозу.

Таблица 3. Содержание субпопуляций лимфоцитов в периферической крови больных КПЛ до и после лечения (M±σ)

У обследованных нами больных вульгарным псориазом в прогрессирующую стадию выявлено снижение абсолютного содержания лимфоцитов CD3⁺CD4⁺ в периферической крови (498,62±171,43 кл/мкл), снижение CD3⁺CD8⁺-лимфоцитов (24,93±4,78% и 387,25±128,63 кл/мкл), повышение доли лимфоцитов CD25⁺ (19,44±2,9%) и CD38⁺ (35,68±7,12%), снижение количества лимфоцитов, экспрессирующих маркер апоптоза CD95⁺ (28,33±9,03%), количество экспрессирующих γδ-TCR было немного повышено (3,69±1,6%) (табл. 4). После проведенной базисной терапии в период ремиссии у больных отмечена тенденция к нормализации содержания CD3⁺CD8⁺ по абсолютным значениям (473±123 кл/мкл).

Таблица 4. Содержание субпопуляций лимфоцитов в периферической крови больных псориазом до и после лечения (M±σ)

Псориаз — аутоиммунное заболевание, в патогенезе которого основную роль играет гиперпродукция цитокинов IL-17 и IL-23 (вызываемая дендритными клетками кожи и T-хелперами) с последующим привлечением нейтрофилов в эпидермис [10—12].

Снижение доли CD4⁺- и CD8⁺-лимфоцитов в крови может быть обусловлено предшествующей терапией псориаза и перераспределением их в очаги воспаления. Как и при других кожных воспалительных заболеваниях, обнаружено увеличение в крови доли клеток с маркерами активации и снижение — с рецептором апоптоза.

У обследованных нами больных хроническим рецидивирующим фурункулезом в период рецидива выявлено повышение относительного содержания T-лимфоцитов (CD3⁺) в периферической крови (77,6±5,83%), T-хелперов CD3⁺CD4⁺ (49,18±7,2%), снижение уровня T-киллеров CD3⁺CD8⁺ (27,51±6,13%, 429,29±137,47 кл/мкл), повышение доли CD38⁺-клеток (28,4±7,32%), снижение доли B-лимфоцитов (10,36±3,48%), клеток, экспрессирующих Fas-рецептор апоптоза CD95⁺ (22,02±15,38%) (табл. 5). Относительное количество γδ-TCR было немного повышено (4,04±1,96%). После проведенной базисной терапии в период ремиссии у больных отмечено повышение абсолютных значений CD3⁺CD8⁺.

Таблица 5. Содержание субпопуляций лимфоцитов в периферической крови больных фурункулезом до и после лечения

Помимо признаков активации иммунного ответа, таких как увеличение содержания T-хелперов и клеток с маркерами активации, можно отметить умеренное количество лейкоцитов крови, а значит, можно предположить недостаточность иммунного ответа на бактериальные патогены, в борьбе с которыми наибольшую роль играют гранулоциты.

У обследованных нами больных инверсными акне в период рецидива выявлено содержание CD3⁺CD8⁺-лимфоцитов на нижних границах нормы (31,1±6,16%), остальные показатели были в пределах нормальных значений (табл. 6). В патогенезе этой болезни, как считается, основную роль играют нарушения врожденного иммунного ответа, не находящие, вероятно, отражения в субпопуляциях T-лимфоцитов [13].

Таблица 6. Содержание субпопуляций лимфоцитов в периферической крови больных инверсными акне до и после лечения (M±σ)

У обследованных нами больных многоформной эритемой в период рецидива выявлено повышение уровня CD3⁺CD4⁺-клеток (48,68±7,08%), снижение уровня CD3⁺CD8⁺-лимфоцитов (22,65±4,27%, 308,33±98,33 кл/мкл), повышение доли NKT-лимфоцитов (9,33±4,48%), количества CD38⁺-клеток (28,38±6,73%), B-лимфоцитов (16,93±6,71%), выраженное снижение содержания лимфоцитов, экспрессирующих маркер апоптоза CD95⁺ (14,05±3,8%), количество экспрессирующих γδ-TCR-лимфоцитов было незначительно повышено (3,58±1,54%) (табл. 7). После проведенной базисной терапии в период ремиссии у больных отмечена тенденция к снижению содержания натуральных киллеров (6,27±4,02%), к повышению абсолютных значений исходно сниженного содержания CD3⁺CD8⁺ (494,4±131,52 кл/мкл).

Таблица 7. Содержание субпопуляций лимфоцитов в периферической крови больных многоформной эритемой до и после лечения (M±σ)

Сравнительный анализ патологии в период рецидива выявил, что наиболее максимальные значения CD38 были у больных АтД и псориазом, максимально высокие значения γδ-лимфоцитов наблюдали у больных АтД и чуть ниже — при липоидном некробиозе. Уровень лимфоцитов, экспрессирующих маркеры апоптоза CD95, был наиболее низким у больных АтД и многоформной эритемой, в то время как этот показатель был в норме только у больных липоидным некробиозом. Содержание B-лимфоцитов было на верхней границе нормы при многоформной эритеме, на нижней — при остальных патологиях.

При изучении особенностей иммунного ответа при рецидиве и ремиссии показано, что в группе КПЛ и липоидным некробиозом отмечено повышение уровня T-киллеров (CD3⁺CD8⁺) в ремиссию по сравнению с рецидивом, оба заболевания имеют сходный патогенез. Однако тенденция к повышению этого показателя в результате терапии отмечена и при других исследованных воспалительных патологиях, кроме инверсных акне. Повышение значений в период ремиссии заболевания, вероятно, связано с переходом иммунной системы из состояния «болезни» и гиперактивации в состояние «покоя», «дежурства».

Липоидный некробиоз характеризовался также повышением уровня лимфоцитов с маркером CD25 и значительным повышением уровня γδ-клеток, причем это единственная патология, при которой содержание лимфоцитов с маркером апоптоза CD95 было в пределах нормы. Псориаз характеризовался снижением количества T-лимфоцитов хелперов CD3⁺CD4⁺ в отличие от других патологий. При АтД в отличие от других патологий отмечено повышение доли NKT-лимфоцитов на фоне снижения доли NK-лимфоцитов, что может отражать участие NKT-клеток в патогенезе воспаления при этой болезни, и максимальными значениями γδ-лимфоцитов. При многоформной эритеме отмечено в отличие от других дерматозов повышение уровня B-лимфоцитов, а также минимальные значения CD95. При фурункулезе в отличие от других патологий отмечено повышение общего количества лимфоцитов.

По достижении ремиссии после базисной терапии при АтД отмечена нормализация содержания γδ-клеток и общего числа лимфоцитов, при КПЛ — нормализация содержания CD95 и CD25.

Поскольку биомаркеры следует оценивать неоднократно, особенно в контексте мониторинга лечения, предпочтение менее инвазивным методам перед биопсией кожи вполне резонно. Кроме того, биопсию кожи еще труднее получить в педиатрической популяции. В настоящее время уже оценивают несколько потенциальных биомаркеров крови, связанных с АтД, псориазом, в дополнение к данным физикального осмотра для определения тяжести заболевания.

Для определения потенциальной роли биомаркеров в прогнозировании и оценки эффективности лечения вышеперечисленных дерматозов крайне важны крупномасштабные клинические исследования с широкой оценкой целого спектра биомаркеров. В будущем это может привести к разработке клинического подхода с использованием их в качестве практического клинического инструмента, при котором выбор терапии этих патологий будет персонифицированным. Поиск и определение надежных и легкодоступных биомаркеров позволит внедрить прецизионную медицину при иммунозависимых дерматозах, улучшить ведение пациентов и ускорить разработку новых терапевтических средств.

Результаты изучения патогенеза иммуновоспалительных дерматозов на иммунологическом и молекулярно-клеточном уровне позволят получить новые знания о возможных терапевтических мишенях; разработка методических подходов, направленных на определение критериев степени тяжести, совершенствование методов патогенетической терапии улучшат медицинскую помощь больным иммуновоспалительными дерматозами.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Сорокина Е.В., Ахматова Э.А.

Сбор и обработка материала — Столпникова В.Н., Бишева И.В., Мишина Н.В.

Написание текста — Сорокина Е.В.,

Калиниченко Е.О.

Редактирование — Сорокина Е.В.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Authors’ contributions:

The concept and design of the study — Sorokina E.V., Akhmatova E.A.

Collecting and interpreting the data — Stolpnikova V.N., Bisheva I.V., Mishina N.V.

Drafting the manuscript — Sorokina E.V., Kalinichenko E.O.

Revising the manuscript — Sorokina E.V.