Введение

Для поддержания физиологического гомеостаза в организме ежедневно происходит обновление клеток посредством их запрограммированной гибели, называемой апоптозом [1]. В процессе апоптоза клетки претерпевают отчетливые морфологические изменения, кульминацией которых является фрагментация гибнущей клетки на более мелкие фрагменты, известные как апоптотические тельца [2]. Нарушение в регуляции клиренса апоптотических клеток способствует развитию атеросклероза, образованию аневризм сосудистой стенки, а также рестенозу зоны реконструкции [3].

Окислительный стресс, гипергликемия, гипоксия могут выступать в качестве индукторов апоптоза при атеросклерозе [4]. Вазоактивные вещества, активность которых часто изменяется при атеросклерозе, также являются регуляторами апоптоза. Метаболиты оксида азота II (NO) являются важными медиаторами вазодилатации, ингибирования адгезии и агрегации тромбоцитов, подавления пролиферации гладкомышечных клеток (ГМК) и могут оказывать как проапоптотическое, так и антиапоптотическое действие. Это обусловлено тем, что вызываемые NO эффекты зависят от точки применения и их концентрации [5].

Апоптоз осуществляется двумя разными биохимическими путями, а именно внешним и внутренним, которые в дальнейшем сходятся. Результатом этих путей является активация каспаз (протеолитические ферменты, приводящие клетку к гибели).

Белки семейства Bcl-2 являются основными представителями внутреннего пути апоптоза, участвующими в регуляции проницаемости митохондриальной мембраны и высвобождении цитохрома С. Одним из представителей данного семейства является антиапоптотический белок Bcl-2, который оказывает антиоксидантное действие на стрессовые клетки, предотвращая выброс митохондриального цитохрома C при образовании комплексов с другими проапоптотическими молекулами [6].

Взаимосвязь Fas с Fas-лигандом (FasL) является ключевой регулирующей системой, ответственной за активацию внешнего пути апоптоза в различных типах клеток артериальной стенки. Растворимая форма Fas-рецептора (sFas) образуется при взаимодействии Fas с FasL, блокируя их связывание друг с другом [7]. Было высказано предположение, что экспрессия FasL в эндотелии ограничивает рост повреждений, способствуя апоптозу ГМК интимы и уменьшая инфильтрацию Т-клетками [8]. В то же время в других исследованиях было показано, что опосредованная доставка FasL в эндотелий ускоряла развитие атеросклеротического поражения за счет усиления миграции ГМК из медии в интиму [9].

Пролиферация клеток играет не менее важную роль в формировании атеросклеротических поражений. Сильным митогеном и хемоаттрактантом для фибробластов, ГМК, эндотелиальных клеток является тромбоцитарный фактор роста ВВ (PDGF ВВ). Он облегчает синтез ДНК, способствует пролиферации и миграции клеток, регулируя образование внеклеточного матрикса. Его повышенное количество было обнаружено почти во всех типах клеток атеросклеротически измененной артериальной стенки [10].

При анализе литературы по данной тематике мы не встретили исследований, посвященных изучению взаимосвязи между маркерами апоптоза, пролиферации клеток и эндотелиальной дисфункции и их влияния на прогрессирование атеросклероза у пациентов с облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей (ОААНК). Существующие работы проведены в основном на экспериментальных моделях животных и посвящены исследованию морфологических признаков апоптоза [11—13].

На наш взгляд, изучение динамики маркеров апоптоза, пролиферации клеток и дисфункции эндотелия у пациентов с ОААНК может дать новые сведения о механизмах прогрессирования атеросклероза в послеоперационном периоде.

Исходя из вышеизложенного, была сформулирована цель исследования: оценка динамики маркеров апоптоза, пролиферации клеток и дисфункции эндотелия у пациентов с ОААНК, изучение их роли в прогрессировании атеросклеротического поражения в послеоперационном периоде.

Материал и методы

В проспективное открытое исследование включены 49 пациентов с ОААНК с IIБ—III ст. заболевания по классификации А.В. Покровского—Фонтейна. Исследование одобрено локальным этическим комитетом Рязанского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова (выписка №7 от 03.03.20). Средний возраст пациентов составил 68±5,6 года. Количество мужчин — 39 (88,6%). Критерии исключения: декомпенсированная соматическая патология, сахарный диабет, активный злокачественный процесс или период ремиссии менее 5 лет, оперативное вмешательство на магистральных артериях в анамнезе.

После дообследования пациентам было выполнено открытое оперативное вмешательство на артериях нижних конечностей. После этого пациенты были разделены на две группы: группу А — 17 пациентов, у которых через 12—15 мес произошло прогрессирование атеросклеротического поражения (увеличение процента стеноза просвета артерий атеросклеротической бляшкой на оперированной конечности выше/ниже зоны реконструкции); группу Б — 32 пациента со стабильным течением послеоперационного периода. Группы сопоставимы по возрасту и гендерному составу пациентов. Характеристика групп представлена в табл. 1.

Таблица 1. Клиническая характеристика пациентов

После получения информированного согласия были взяты образцы крови из кубитальной вены в исходных условиях (непосредственно перед вмешательством), в первые часы, в 1-е и на 7-е сутки после операции. Количество белков Bcl-2, PDGF BB, sFas в сыворотке крови определяли с помощью иммуноферментного анализа коммерческими наборами (Invitrogen Thermo Fisher, США) в соответствии с инструкциями производителя. Определение метаболитов NO в сыворотке крови проводили фотоколориметрическим методом с помощью иммуноферментного анализатора StatFax 3200 (Awareness Techolog, Inc.).

Последующее наблюдение за пациентами было проведено через 6 мес, 12 мес и 15 мес.

Статистический анализ полученных данных производили после оценки распределения показателей по критерию Шапиро—Уилка (p>0,05). В связи с нормальным распределением данные представлены как среднее арифметическое и стандартное отклонение. Для оценки взаимосвязи изучаемых показателей вычисляли коэффициент корреляции Пирсона. Для оценки статистической значимости различий внутри групп применяли дисперсионный анализ повторных измерений (ANOVA), попарные сравнения выполняли с помощью критерия Ньюмена—Кейлса. Межгрупповые различия показателей пациентов оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. При построении прогностических моделей использовали ROC-анализ и метод бинарной логистической регрессии. Критический уровень значимости (р) принимали равным 0,05.

Результаты

В ходе исследования выявлено, что у пациентов группы А в первые часы произошло снижение маркеров апоптоза sFas (p=0,0004) и Bcl-2 (p=0,0001) при незначимом изменении показателей PDGF ВВ (p=0,102) и NO (p=0,08) по сравнению с исходными значениями. В 1-е сутки наблюдали уменьшение количества NO (p=0,04), а значения PDGF ВВ (p=0,211), sFas (p=0,335) и Bcl-2 (p=0,475) значимо не отличались по сравнению со значениями в первые часы после операции. На 7-е сутки повысилось количество PDGF BB (p=0,0001) и NO (p=0,003), а количество маркеров sFas (p=0,142) и Bcl-2 (p=0,113) было сопоставимым с показателями в 1-е сутки.

У пациентов группы Б в первые часы после операции из маркеров апоптоза понизился только уровень белка Bcl-2 (p=0,0001) при незначимых изменениях показателей sFas (p=0,453), PDGF ВВ (p=0,338) и NO (p=0,254) по сравнению с исходными значениями. В 1-е сутки значимых различий по количеству маркеров PDGF BB (p=0,376), sFas (p=0,736), Bcl-2 (p=0,254) и NO (p=0,12) получено не было в сравнении со значениями в первые часы. На 7-е сутки повысилось количество маркеров NO (p=0,0001), PDGF BB (p=0,0001) и Bcl-2 (p=0,0003) по сравнению со значениями в 1-е сутки.

При сравнении исходных значений между группами А и Б по маркерам Bcl-2 (p=0,771), sFas (p=0,285), PDGF ВВ (p=0,406) и NO (p=0,459) значимых различий получено не было. В первые часы произошло более выраженное снижение количества sFas (p=0,00009) и Bcl-2 (p=0,002), а на 1-е сутки — NO (p=0,002) у пациентов группы А в сравнении с пациентами группы Б. На 7-е сутки был значимо повышен PDGF BB (p=0,000002) при сниженных значениях NO (p=0,034) и Bcl-2 (p=0,015) у пациентов группы А в сравнении с пациентами группы Б (рис. 1—4).

Рис. 1. Сравнение значений маркера sFas в послеоперационном периоде у пациентов групп А и Б.

* — статистически значимое отличие между группами А и Б (p<0,05).

Рис. 2. Сравнение значений маркера Bcl-2 в послеоперационном периоде у пациентов групп А и Б.

* — статистически значимое отличие между группами А и Б (p<0,05).

Рис. 3. Сравнение значений маркера PDGF BB в послеоперационном периоде у пациентов групп А и Б.

* — статистически значимое отличие между группами А и Б (p<0,05).

Рис. 4. Сравнение значений метаболитов оксида азота в послеоперационном периоде у пациентов групп А и Б.

* — статистически значимое отличие между группами А и Б (p<0,05).

При проведении корреляционного анализа у пациентов группы А выявлена прямая взаимосвязь между sFas и NO (r=+0,663, p=0,005), Bcl-2 и NO (r=+0,58, p=0,018) в 1-е сутки после операции. У пациентов группы Б обнаружена прямая взаимосвязь между NO и Bcl-2 (r=+0,643, p=0,0001) на 7-е сутки.

У пациентов группы А через 12—15 мес после оперативного вмешательства было выявлено прогрессирование атеросклероза по данным дуплексного сканирования и аортоартериографии нижних конечностей (табл. 2). Всем пациентам было выполнено повторное оперативное вмешательство — ангиопластика и в ряде случаев стентирование стенозированного сегмента — с положительным эффектом.

Таблица 2. Локализация поражения у пациентов группы А

ROC-анализ в отношении маркера sFas в первые часы после операции как потенциального прогностического маркера прогрессирования атеросклероза показал, что пороговое значение sFas в точке cut-off, определенное с помощью индекса Юдена, составило 0,545 нг/мл (AUC 0,822±0,063, 95% ДИ 0,699—0,945, p<0,001). При значении sFas в первые часы, которое равно точке cut-off или ниже нее, прогнозируется прогрессирование заболевания. Чувствительность и специфичность метода — 87,5% и 71,9% соответственно (рис. 5).

Рис. 5. Влияние значений маркера sFas в первые часы после операции на прогрессирование атеросклеротического поражения у пациентов группы А через 12—15 мес.

В отношении маркера Bcl-2 в первые часы после операции пороговое значение в точке cut-off составило 1,845 нг/мл (AUC 0,785±0,066, 95% ДИ 0,656—0,914, p=0,001). При значении Bcl-2 в первые часы, которое равно точке cut-off или ниже нее, прогнозируется прогрессирование заболевания. Чувствительность и специфичность метода — 87,5% и 75% соответственно (рис. 6).

Рис. 6. Влияние значений маркера Bcl-2 в первые часы после операции на прогрессирование атеросклеротического поражения у пациентов группы А через 12—15 мес.

Для NO через 1 день после операции пороговое значение в точке cut-off составило 107,75 ммоль/л (AUC 0,782±0,058, 95% ДИ 0,649—0,916, p=0,002). При значении NO через 1 день, которое равно точке cut-off или ниже нее, прогнозируется прогрессирование заболевания. Чувствительность и специфичность метода — 81,3% и 75% соответственно (рис. 7).

Рис. 7. Влияние значений маркера метаболитов оксида азота в 1-е сутки после операции на прогрессирование атеросклеротического поражения у пациентов группы А через 12—15 мес.

Для PDGF BB на 7-е сутки после операции пороговое значение в точке cut-off составило 35,65 нг/мл (AUC 0,944±0,035, 95% ДИ 0,876—1,0, p<0,001). При значении PDGF BB на 7-е сутки, которое равно точке cut-off или выше нее, прогнозируется прогрессирование заболевания. Чувствительность и специфичность метода — 93,8% и 87,5% соответственно (рис. 8).

Рис. 8. Влияние значений маркера PDGF ВВ на 7-е сутки после операции на прогрессирование атеросклеротического поражения у пациентов группы А через 12—15 мес.

Самой эффективной прогностической моделью является модель на основе оценки PDGF ВВ через 7 дней после операции, так как она имеет более высокую значимость.

Логистический регрессионный анализ показал, что пониженные значения sFas (p=0,002) и Bcl-2 (p=0,009) в первые часы, NO через 1 день (p=0,01) и PDGF ВВ через 7 дней (p=0,001) после операции являются маркерами прогрессирования атеросклероза.

Обсуждение

Система апоптоза является одной из основных составляющих процесса атерогенеза из-за потенциального воздействия на пролиферацию клеток, их дифференцировку и фенотипическое переключение.

В нашем исследовании удалось доказать, что оперативное вмешательство приводит к активации маркеров апоптоза в первые часы после вмешательства. Это может быть обусловлено как самой травмой артериальной стенки, так и развитием окислительного стресса в ответ на реперфузию, который является одним из основных индукторов апоптоза клеток.

Снижение уровня антиапоптотических маркеров двух путей апоптоза свидетельствует о гибели клеток сосудистой стенки. Так, уменьшение количества эндотелиальных клеток в результате усиленного апоптоза усугубляет эндотелиальную дисфункцию, которая обуславливает снижение количества NO к первым суткам после операции.

В нормальных условиях апоптотические клетки быстро поглощаются фагоцитами и соседними клетками (эффероцитоз), что вызывает активный противовоспалительный ответ. Когда эффероцитоз неэффективен, апоптотические клетки подвергаются вторичному некрозу, что побуждает выжившие соседние клетки сосудистой стенки высвобождать провоспалительные цитокины [14].

Усиление пролиферативного ответа в виде повышения PDGF ВВ на 7-е сутки может быть связано с несколькими механизмами. Во-первых, апоптотические клетки сами высвобождают цитокины, которые усиливают пролиферацию и миграцию соседних клеток при смене их фенотипа с сократительного на синтетический. Сам по себе апоптоз ведет к увеличению проницаемости эндотелиального монослоя и снижению ингибирующих сигналов на пролиферацию и миграцию ГМК при увеличении экспрессии молекул клеточной адгезии. Во-вторых, в низких концентрациях NO не может подавлять пролиферацию и миграцию клеток из медии в интиму. В-третьих, апоптотические клетки проявляют прокоагулянтные свойства, что усиливает ответную пролиферативную реакцию на преодоление клеточного дефицита.

В норме в ответ на операционную травму происходит гибель клеток, которая ведет к ответной пролиферативной реакции для восстановления погибших клеток. Постепенное повышение количества NO со временем приводит к ограничению как гибели клеток, так и нормализации значений белка Bcl-2, что подтверждается проведенным корреляционным анализом. NO оказывает антиапоптотический эффект на клетки сосудистой стенки посредством цГМФ-зависимых механизмов или путем S-нитрозилирования белка Bcl-2, предотвращая его деградацию [15].

Если оперативное вмешательство вызывает активацию маркеров сразу двух путей апоптоза, то это, в свою очередь, обуславливает усиленную вдвое ответную пролиферативную реакцию. При этом повышение уровня NO не может ее компенсировать [16].

К ограничениям исследования можно отнести малый размер выборки, а также небольшое количество временных точек в изучении динамики исследуемых показателей в послеоперационном периоде. На наш взгляд, необходимы продолжение данной работы и ее расширение за счет спектра маркеров апоптоза, пролиферации клеток и дисфункции эндотелия в более отдаленном периоде времени с целью выявления их прогностической роли в различных послеоперационных осложнениях.

Вывод

Сниженные значения sFas (<0,545 нг/мл) и Bcl-2 (<1,845 нг/мл) в первые часы и NO (<107,75 ммоль/л) в 1-е сутки, а также повышенные значения PDGF ВВ (>35,65 нг/мл) на 7-е сутки после оперативного вмешательства у пациентов с ОААНК ассоциированы с увеличением риска прогрессирования атеросклероза.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.