Введение

Ишемическая болезнь сердца (ИБС), вызываемая атеросклеротическим поражением сосудов, остается ведущей причиной смертности во всем мире. Атеросклеротическое повреждение сосудистой стенки связано с нарушением функционирования множества генов, эпигенетическими модификациями и воздействием факторов окружающей среды [1, 2]. Транскриптомные исследования показывают, что большая часть генома человека транскрибируется в некодирующие РНК (нкРНК), которые играют важную роль в развитии заболеваний [3, 4]. К числу нкРНК относят в том числе циклические РНК (циклоРНК), которые образуются в результате неканонического сплайсинга пре-мРНК [5].

Действуя как конкурентные эндогенные РНК, циклоРНК предотвращают связывание микроРНК с сайтом распознавания в нетранслируемой области мРНК, что снижает деградацию последних и способствует трансляции. Данную ось взаимодействий можно представить как связь циклоРНК/микроРНК/мРНК, где мРНК является конечной мишенью и от кодируемого ею белка зависит атеропротективный или проатерогенный эффект конкретной циклоРНК [3]. Многочисленные циклоРНК являются перспективными диагностическими биомаркерами и терапевтическими мишенями [6—9]. Однако терапевтический потенциал циклоРНК в настоящее время ограничен недостаточным пониманием молекулярных механизмов их действия и отсутствием доказательной базы. Участие циклоРНК в известных на сегодня осях взаимодействий, преимущественно биоинформатически предсказанных и подтвержденных на моделях атеросклероза с использованием клеточных культур, требует экспериментального подтверждения на биологических материалах пациентов.

Анализ экспрессии 65 генов, связанных с метаболизмом липопротеинов высокой плотности (ЛВП) и атерогенезом, выбранных нами ранее с помощью принципов системной биологии [10], позволил выявить 28 генов, дифференциально экспрессирующихся в мононуклеарных клетках крови больных ИБС относительно контрольных пациентов [10]. С целью дальнейшего изучения роли транскриптома в механизмах функционирования генов, ассоциированных с ИБС, в мононуклеарных клетках крови пациентов с ИБС и пациентов контрольной группы с помощью обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) в реальном времени проведен анализ экспрессии циклических РНК circLDLR, circSPARC, circSMARCA5 и circTMEM181, мишенями которых являются мРНК ряда генов, участвующих в атерогенезе и метаболизме ЛВП [10]. Оси потенциальных взаимодействий исследованных циклоРНК указаны в табл. 1.

Таблица 1. Оси взаимодействий циклоРНК/микроРНК/мРНК, участвующие в развитии ИБС

Материал и методы

Сто девять мужчин 40—60 лет были разделены на две когорты: пациенты с диагнозом ИБС (n=68) и пациенты без коронарного атеросклероза (n=41). В когорту ИБС были включены пациенты с жалобами на загрудинную боль, с изменениями ЭКГ и с гемодинамически значимым стенозом >50%, по крайней мере, одной из коронарных артерий, согласно данным коронароангиографии. Пациенты без видимого стеноза или с гемодинамически незначимым (<20%) стенозом были включены в контрольную когорту. Дополнительные критерии отбора пациентов для исследования были описаны нами ранее [10].

Протокол выделения суммарной РНК из мононуклеарных клеток периферической крови пациентов, оценка ее концентрации и качества описаны нами в предыдущих исследованиях [8]. кДНК синтезировали с использованием набора RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit и Random Primer (Thermo Fisher Scientific, США), согласно рекомендации производителя.

ПЦР проводили с использованием прибора StepOnePlus (Applied Biosystems, США) в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 2 мкл к в разведении 1:6, по 5 пмоль прямого и обратного праймеров и 5 мкл 5x смеси для ПЦР-HS SYBR (ЗАО «Евроген», Россия). Протокол амплификации включал: 1) 10 мин при 95 °C; 2) 40 циклов по 15 с при 95 °C; 3) 25 с при 65 °C ; 4) 35 с при 72 °C. Каждый образец кДНК анализировали трижды. Уровень мРНК-генов глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (Gapdh), лактатдегидрогеназы А (LDHA) и 60S рибосомного белка L3 (RPL3) использовали для нормализации результатов ПЦР. Праймеры для циклоРНК были подобраны с использованием программного обеспечения OLIGO 6.31 (Molecular Biology Insights, США) и синтезированы компанией ЗАО «Евроген» (табл. 2).

Таблица 2. Характеристика праймеров для ПЦР в реальном времени

Расчеты изменения уровней экспрессии исследуемых циклоРНК проводили с помощью Relative Expression Software Tool (REST) 2009 V2.0.13 [19]. Для оценки содержания исследуемых циклоРНК относительно мРНК генов сравнения была использована формула:

E^Ct(ref)/E^Ct(tar),

где E — эффективность ПЦР-реакции, Ct(tar) — средняя величина Ct для исследуемых циклоРНК и Ct(ref) — среднее геометрическое Ct для мРНК генов сравнения (Gapdh, LDHA и Rpl3) [20].

Сравнение лабораторных и антропометрических параметров пациентов проводили по критерию Манна—Уитни при помощи программы Statistica (версия 10). При сравнении групп данных между собой статистически значимыми считали различия с вероятностью p<0,05. Вклад различий содержания липидов и возраста в вариабельность содержания циклических РНК оценивали с использованием логистической регрессии с использованием программы MedCalc Statistical Software version 22.016. Значения площади под кривой (AUC), чувствительность, специфичность и индекс Йоудена являются характеристиками точности регрессии. Для выравнивания значений переменных в двух группах использовали Z-score [21].

Результаты и обсуждение

Лабораторные и антропометрические данные для контрольной группы и пациентов с ИБС представлены в табл. 3. Уровни ХС-ЛВП, триглицеридов, апоA-I, апоB, а также коэффициент атерогенности и индекс массы тела не имели значимых различий между исследуемыми группами пациентов. Выявлено достоверно значимое снижение содержания общего холестерина и холестерина липопротеинов низкой плотности (ХС-ЛНП) в мононуклеарных клетках крови пациентов с ИБС по сравнению с контрольными пациентами. Кроме того, группа ИБС и здоровые пациенты достоверно отличались по среднему возрасту участников исследования.

Таблица 3. Лабораторные и антропометрические параметры для групп пациентов

Примечание. * – достоверно значимое отличие между группами ИБС и контроля (p<0,05).

Уровни экспрессии circLDLR, circSPARC, circSMARCA5 и circTMEM181 измеряли методом ОТ-ПЦР в реальном времени. В табл. 4 представлены результаты сравнения экспрессии циклоРНК между группами ИБС и контроль. Данные, полученные с помощью программного обеспечения REST, представлены в виде среднего значения относительной экспрессии со стандартной ошибкой в виде 68% доверительного интервала.

Таблица 4. Анализ экспрессии циклоРНК в препаратах РНК, выделенных из мононуклеарных клеток пациентов с ИБС относительно контроля

Примечание. Приведены значения изменения экспрессии и стандартной ошибки.

Включение в работу циклоРНК circLDLR и circSMARCA5 было обусловлено их возможной регуляторной ролью в экспрессии генов ABCA1 и ABCG1, кодирующих переносчики холестерина и фосфолипидов ABCA1 и ABCG1 к апобелку апоA-I и ЛВП, соответственно, в обратном транспорте холестерина [11,12, 22]. МикроРНК miR-30a-3p имеет сайты связывания с circLDLR, а также с мРНК ABCA1 [11, 23]. Можно предположить, что circLDLR (hsa_circ_0006877), участвуя в оси miR-30a-3p/ABCA1, может способствовать снижению образования пенистых клеток и усилению оттока холестерина, опосредованного ABCA1, оказывая атеропротективный эффект [11]. По результатам нескольких исследований circSMARCA5 (hsa_circ_0001445) посредством осей mir-640/IL1B и miR-208b5p/ABCG1 (см. табл. 1) проявляла атеропротективный эффект и могла быть использована в качестве биомаркера и мишени для лечения ИБС [16, 17, 24]. Однако по результатам нашего исследования уровни экспрессии circLDLR и circSMARCA5 в мононуклеарных клетках крови исследованных пациентов с ИБС и контроля достоверно не различались.

Значимое увеличение уровня экспрессии circSPARC (hsa_circ_0004104) обнаружено нами при сравнении пациентов с ИБС относительно контроля по данным REST (табл. 4). Изменение экспрессии по отношению шансов (ОШ=1,86) в логистической регрессии оставалось значимым (p=0,047) при включении в модель содержания холестерина, ХС-ЛНП, ХС-ЛВП, ТГ и возраста (табл. 5). Отметим, что модель с включенными ковариатами по параметрам уравнения регрессии (AUC, чувствительность, специфичность и Индекс Йоудена) была высокозначимой.

Таблица 5. Анализ вклада содержания липидов плазмы крови и возраста пациентов в изменение экспрессии цикло-РНК с помощью множественной логистической регрессии

Примечание. * — значимые в уравнении регрессии ковариаты

Ввиду наличия нескольких подтвержденных осей взаимодействия микроРНК/мРНК (см. табл. 1), circSPARC является перспективной мишенью для изучения роли циклоРНК в атерогенезе. Повышенный уровень экспрессии circSPARC был обнаружен ранее в сыворотке пациентов с атеросклерозом [13]. Нокдаун circSPARC подавлял апоптоз, воспалительную реакцию и окислительный стресс, вызванные ox-LDL в клеточной культуре HUVEC, и способствовал клеточной пролиферации посредством осей взаимодействий miR-942-5p/ROCK2 и miR-328-3p/TRIM14 при атеросклерозе [13, 14]. В культуре эндотелиальных клеток сосудов (VEC) в присутствии ox-LDL подавление экспрессии circSPARC способствовало клеточной пролиферации и уменьшению воспаления через ось miR-100/TNFAIP8 [15]. Опыты по сверхэкспрессии circSPARC в культуре клеток макрофагов THP-1 также выявили снижение экспрессии атеропротективного гена APOA1, что указывает на потенциальный атерогенный эффект повышенной экспрессии данной циклоРНК и ее возможное участие в патогенезе атеросклероза [25]. Таким образом, circSPARC может быть потенциальным биомаркером для диагностики ИБС и выступать в качестве мишени для лечения заболевания.

Другой циклоРНК, достоверно увеличившей уровень экспрессии в мононуклеарных клетках пациентов с ИБС относительно контроля, является circTMEM181 (circRNA104250, hsa_circ_0004587) (см. табл. 4). Изменение экспрессии по отношению шансов (ОШ=2,81) также оставалось значимым (p=0,003) при учете различий содержания холестерина, ХС-ЛНП, ХС-ЛВП, ТГ и возраста пациентов по данным множественной логистической регрессии (см. табл. 5). Посредством miR-3607-5p, circTMEM181 предположительно влияет на уровень мРНК гена IL1R1, кодирующего рецептор основных провоспалительных цитокинов [18]. IL1R1 секретируется многими типами клеток, включая гладкомышечные клетки сосудов и участвует в регуляции NF-κB-пути — важного компонента развития воспалительной реакции, клеточных пролиферации и дифференцировки [26]. Также IL1R1 способствует усилению атеросклероза и созреванию Th17-клеток путем передачи сигнала в CD4+Т-клетки [27, 28]. Оказывая влияние на IL1R1, circTMEM181 является возможным биомаркером коронарного атеросклероза и потенциальной мишенью для терапии заболевания.

Заключение

Выявленное увеличение уровня экспрессии circTMEM181 и circSPARC в мононуклеарных клетках крови пациентов с ИБС, мишенями которых являются мРНК генов, участвующих в атерогенезе и метаболизме ЛВП, подтверждает их проатерогенный эффект и позволяет предположить возможность использования данных циклоРНК в качестве биомаркеров коронарного атеросклероза и потенциальных мишеней для его лечения.

Финансирование. Работа выполнена в рамках Тематического плана НИОКР НИЦ «Курчатовский институт».

Соблюдение этических стандартов. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием животных в качестве объектов.

Исследование одобрено этическим комитетом ГБУЗ МО «Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского» (МОНИКИ), Россия (протокол № 12479/2019 от 17 февраля 2019 г.) и проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией ВМА (2004 г.). Все пациенты дали письменное информированное согласие на забор материала.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.