Введение

Хронические неинфекционные заболевания (ХНИЗ) — это обширная категория нозологий с медленно прогрессирующим длительным течением, связанных с множеством факторов риска. Патогенез многих ХНИЗ связан с хроническим вялотекущим (низкоинтенсивным) воспалением, причины, механизмы и поиск релевантных биомаркеров которого до сих пор являются предметом исследований и обсуждения [1, 2]. Одним из важнейших механизмов развития и поддержания воспаления является активация системы протеолиза, вовлеченного в регулирование биологических процессов посредством посттрансляционной модификации белков, т.е. гидролиза одной или нескольких пептидных связей в белках и полипептидах, который катализируется в основном клеточными ферментами — протеазами. Протеолитические ферменты, а также их промоторы, ингибиторы, субстраты, кофакторы, рецепторы и связывающие белки, составляя >2% протеома человека, образуют протеазные системы, которые являются важными регуляторами биологических механизмов. Примером сложности протеолиза может служить система гемостаза с протеолитической регуляцией каждого этапа гемокоагуляции [3—5].

Полный арсенал протеаз, присутствующих в организме или ткани, определяется как «протеазный деградом» и в настоящее время составляет 588 протеаз, объединенных в пять классов в соответствии с их каталитическим механизмом действия: аспарагиновые, цистеиновые, металлопротеиназы, сериновые и треониновые протеазы [6, 7]. Эластазы — общее название группы протеаз, принадлежащих к классу ферментов сериновых, аспарагиновых, цистеиновых и металлоэндопептидаз. К настоящему времени идентифицировано 20 эластаз из различных видов клеток, включая полиморфно-ядерные лейкоциты, моноциты, макрофаги, гладкомышечные клетки, фибробласты [8].

Обладая эластазолитической активностью с различной специфичностью к белкам-субстратам, эластазы способны гидролизовать коллагены различных типов, протеогликаны, гистоны, основной белок миелина, ламинины, гемоглобин и широкий спектр белков плазмы крови [9, 10]. Показано, что аберрантная экспрессия эластаз способствует развитию и прогрессированию ряда ХНИЗ, включая атеросклероз, эмфизему легких, хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ), рак молочной железы, легких, предстательной железы и толстой кишки [8, 11]. Одним из клинически значимых ферментов класса эластаз является нейтрофильная эластаза (НЭ) — протеолитический фермент семейства сериновых протеаз, входящий в суперсемейство химотрипсина (КФ 3.4.21.37). Данный фермент характеризуется неспецифической протеолитической активностью, которая тщательно контролируется несколькими механизмами, основной из них связан с ограничением активности НЭ посредством эндогенных ингибиторов [12, 13].

Цель исследования — провести анализ отечественных и зарубежных публикаций об изучении взаимосвязи НЭ с ХНИЗ и перспективах использования НЭ в качестве биомаркера воспаления низкой интенсивности при этих заболеваниях.

Материалы и методы

Поиск материалов для обзора осуществлен в электронных базах данных eLIBRARY.ru и PubMed по ключевым словам на русском и английском языках: «нейтрофильная эластаза» (neutrophil elastase), «биомаркеры» (biomarkers), «методы анализа циркулирующих биомаркеров» (circulating biomarker analysis methods), ХОБЛ (COPD), «бронхиальная астма» (asthma), «атеросклероз» (atherosclerosis), «болезнь Альцгеймера» (Alzheimer's disease). Глубина поиска составила 15 лет, включая фундаментальные работы по теме и оригинальные исследования, описывающие методы определения уровня и активности НЭ.

Результаты

Биохимия нейтрофильной эластазы

Нейтрофильная эластаза представляет собой гликопротеид с молекулярной массой 29,5 кДа, состоящий из 218 аминокислот, локализованный в активной форме в азурофильных гранулах нейтрофилов. Известно, что НЭ является продуктом гена ELANE, который расположен в терминальной области короткого плеча хромосомы 19 в точке p13.3 и состоит из 5 экзонов и 4 интронов. Активность НЭ обусловлена каталитической триадой: Asp102, His57 и Ser195 в третичной структуре белка, которая представлена двумя гомологичными β-структурами и C-концевой α-спиралью [12].

Нейтрофилы рассматриваются как основные эффекторные клетки врожденной иммунной системы и являются самой многочисленной группой клеток крови, инициирующих и координирующих ответ организма на внедрение патогена и повреждение. При инфекции активированные цитокинами, хемокинами или бактериальным эндотоксином нейтрофилы используют следующие механизмы противомикробной защиты: фагоцитоз, дегрануляцию, а также нейтрофильные внеклеточные ловушки (Neutrophil Extracellular Traps — NETs), структуры, состоящие из хроматина, противомикробных пептидов и белковых гранул, которые связывают и уничтожают микроорганизмы. Доминирующим клеточным источником активной НЭ являются нейтрофилы. Активация нейтрофилов цитокинами, хемокинами или бактериальным эндотоксином проявляется умеренным высвобождением НЭ из цитоплазмы. Значительное количество фермента поступает в кровоток во время интенсивного или нарушенного фагоцитоза, когда клиренс макрофагов апоптотических нейтрофилов либо нарушен, либо неадекватен из-за чрезмерного притока нейтрофилов в ткани, например при ХОБЛ [14]. При некрозе нейтрофилов происходит разрыв клеточной мембраны, что приводит к попаданию содержимого их цитоплазмы в очаг воспаления и способствует дальнейшему усилению воспалительной реакции [15]. Длительное воспаление может приводить к избыточной выработке NETs, деградация которых нуклеазами патогенов влечет за собой выход «агрессивных» компонентов в кровоток. Высокая концентрация NETs в свою очередь способствует аутоиммунным реакциям, системным васкулитам, метаболическим нарушениям, тромбозу и активации канцерогенеза [16].

В физиологических условиях НЭ в организме оказывает бактерицидное и бактериостатическое действие как внутриклеточно, так и внеклеточно с помощью NETs, обеспечивая одну из функций врожденного иммунитета. Уровень протеолиза в крови, вызываемого ферментом, определяется балансом активности НЭ и ее эндогенных ингибиторов, основным из которых является α1-антитрипсин (α1-АТ) — гликопротеид, белок острой фазы воспаления, относящийся к суперсемейству ингибиторов сериновых протеаз (SERPIN), который синтезируется главным образом в гепатоцитах и обладает рядом модулирующих эффектов, включая участие в противовоспалительном ответе [17, 18].

Внеклеточная протеолитическая активность НЭ проявляется в регуляции воспаления и тканевого гомеостаза, протеолитическом процессинге цитокинов семейства интерлейкина (ИЛ)-1, деградации эластина и белков внеклеточного матрикса (коллагена, фибронектина, ламинина, протеогликанов), факторов свертывания крови и фибринолиза, иммуноглобулинов классов IgG, A, M, компонентов комплемента C3 и C5, модификации активности других протеаз и ряда их ингибиторов, содержащихся в гранулах нейтрофилов, а также в процессе хемотаксиса и миграции нейтрофилов за счет протеолитической деградации молекул адгезии в местах клеточных контактов [19, 20].

Роль нейтрофильной эластазы в патологических процессах

Патофизиология НЭ тесно сопряжена с функциями нейтрофилов в иммунном ответе при заболеваниях, когда хроническое воспаление является основным патогенетическим механизмом и характеризуется постоянным притоком этих клеток, а такие процессы, как фагоцитоз, дегрануляция, продукция активных форм кислорода и образование NETs, способствуют активному высвобождению НЭ и усилению ферментативной атаки на белки-мишени.

Согласно данным клинических и лабораторных исследований, НЭ вовлечена в патогенез заболеваний легких, таких как муковисцидоз, ХОБЛ, бронхоэктазы и бронхолегочная дисплазия и бронхиальная астма [21—24]. При бронхолегочных заболеваниях НЭ реализует свою протеолитическую активность путем усиления экспрессии гена одного из основных муцинов (MUC5AC), деградации внеклеточного матрикса, повреждения эпителиальных клеток, активации провоспалительных сигнальных путей и деградации антимикробных белков, чем нарушает врожденные и адаптивные иммунные механизмы [12].

Нейровоспаление — один из важных патологических признаков нескольких нейродегенеративных заболеваний, связано со структурными изменениями гематоэнцефалического барьера и повышенной проницаемостью сосудов. Болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, рассеянный склероз, ишемия головного мозга — все эти заболевания характеризуются неконтролируемой гибелью нейронов. Из иммунных клеток участие нейтрофилов при воспалительных заболеваниях является основным, так как они способны повреждать гематоэнцефалический барьер, а затем проникать в центральную нервную систему, повышая проницаемость сосудов после адгезии к эндотелиальным клеткам и вызывая ишемические явления при распаде NETs и высвобождении НЭ, миелопероксидазы и катепсина G, других окислителей и протеаз. Так, у пациентов с болезнью Альцгеймера экспрессия НЭ и катепсина G обнаружена в культивируемых клетках микроглии и цереброспинальной жидкости, а активность НЭ и катепсина G — в плазме крови, например при ишемическом инсульте и травматическом повреждении мозга [25—27].

Одним из механизмов патогенеза атеросклероза является хроническое низкоинтенсивное воспаление, в регуляцию которого вовлечена НЭ. При сдвиге протеолитического равновесия в сторону деградации матрикса сосудистой сети НЭ активирует металлопротеиназы (MMP-2, MMP-3 и MMP-9) и инактивирует их ингибитор TIMP-1 (тканевый ингибитор металлопротеиназ), регулирует активность таких цитокинов, как ИЛ-1β, фактор некроза опухоли α (ФНО-α) и ИЛ-8, расщепляет рецептор ФНО-α и поверхностные белки T-клеток (CD2, CD4 и CD8). Помимо этого, НЭ может участвовать в модификации липопротеинов низкой плотности, что способствует их захвату макрофагами артериальной стенки, накоплению холестерина и образованию пенистых клеток [8, 28—30]. Действительно, мРНК и белок НЭ обнаружены в атеросклеротических бляшках человека, а повышенная активность НЭ плазмы крови выявлена на начальных этапах атерогенеза [31].

Изменение протеолитического равновесия в сторону повышения активности НЭ вносит вклад в индукцию эпителиально-мезенхимального перехода и инверсию микроокружения опухоли, а также в процессы пролиферации и миграции опухолевых клеток, опосредуя деградацию и ремоделирование внеклеточного матрикса. Показано, что активность НЭ повышена при различных типах опухолей, а уровни активности фермента связаны со стадией опухоли и выживаемостью пациентов. Все эти сложные и многостадийные процессы провоцируют прогрессирование новообразования и системную устойчивость к терапии при таких нозологиях, как рак молочной железы, легких, предстательной железы, толстой кишки [32].

В табл. 1 [21—24, 33—38] представлены результаты динамики показателей НЭ в некоторых клинических исследованиях, демонстрирующие статистически значимую связь между уровнем НЭ и тяжестью заболевания при ряде ХНИЗ.

Таблица 1. Показатели уровня и активности нейтрофильной эластазы по группам заболеваний

Примечание. Данные представлены в виде медианы (интерквартильного размаха) — Me (Q₂₅—Q₇₅), среднего и стандартного отклонения — M±SD. * — p<0,05 при сравнении с контролем; ^# — p<0,05 при сравнении групп с разной тяжестью заболевания. АД — артериальное давление; БА — бронхиальная астма; ГБ — гипертоническая болезнь; ИБС — ишемическая болезнь сердца; ХАИТ — хронический аутоиммунный тиреоидит; ХОБЛ — хроническая обструктивная болезнь легких.

Методы лабораторных исследований уровня и активности нейтрофильной эластазы

Участие НЭ в патогенезе ряда ХНИЗ и выраженные изменения ее уровня/активности в сыворотке крови у больных по сравнению с контрольными группами позволяет рассматривать этот фермент в качестве перспективного биомаркера риска развития этих заболеваний и их осложнений и потенциальной терапевтической мишени.

Современные лабораторные методы позволяют определять активность НЭ или концентрацию комплекса НЭ и ее ингибитора α1-АТ.

Кинетические методы определения активности фермента основаны на анализе зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата и фермента через равные промежутки времени [39]. Один из вариантов определения активности НЭ, инкубация сыворотки крови с субстратом (окрашенным эластином), выполняется на 96-луночном микропланшете в течение 24 ч с последующим фиксированием изменения оптической плотности на микропланшетном фотометре при длине волны 492 нм. Основной недостаток метода — необходимость суточной инкубации, что служит препятствием использования данного метода для экспресс-диагностики [40].

Для определения активности НЭ синтезирован ряд специфических хромогенных субстратов, большинство из которых применимо для определения активности очищенных препаратов фермента. Одним из немногих синтетических субстратов, позволяющих определять активность циркулирующей НЭ непосредственно в плазме крови, является N-терт-бутокси-карбонил-β-аланин-нитрофениловый эфир (BOC-Ala-ONp), на основе которого разработан кинетический экспресс-метод [41, 42].

В иммуноферментом анализе (ИФА) используется классическая иммунологическая концепция связывания антигена со специфическим антителом [43]. С помощью данного метода определяется концентрация циркулирующего в плазме крови комплекса НЭ с α1-АТ. В настоящее время доступно несколько коммерческих тест-систем с различными аналитическими параметрами и калибровочным диапазоном. В табл. 2 представлена сравнительная характеристика методов определения НЭ.

Таблица 2. Функциональные возможности методов определения уровня и активности нейтрофильной эластазы

Примечание. ИФА — иммуноферментный анализ; НЭ — нейтрофильная эластаза.

Каждый метод имеет свои достоинства и недостатки. Так, для проведения ИФА, несмотря на преимущества (высокие специфичность и чувствительность, возможность одновременного анализа большого количества проб, малые объемы проб), необходимо выполнить несколько этапов общей продолжительностью от 3 до 6 ч. Помимо этого, проведение ИФА сопряжено с высокой стоимостью тест-систем. Кинетический метод также высокочувствителен и специфичен, выполняется в один этап, что позволяет использовать его в качестве метода для скрининг-диагностики. Однако отсутствие в настоящее время стандартизованных тест-систем и автоматизации оценки активности НЭ кинетическим методом не позволяют проводить одновременный анализ большого количества проб и внедрить метод в клинико-диагностическую практику.

Заключение

На основании проведенного анализа данных литературы можно сделать вывод о вовлеченности нейтрофильной эластазы в патогенез ряда хронических неинфекционных заболеваний. Выраженное повышение ее уровня/активности в сыворотке крови больных, по сравнению с показателями у лиц контрольных групп, позволяет рассматривать этот фермент в качестве перспективного диагностического и прогностического маркера заболеваний и их осложнений. В этом аспекте представляется актуальной идея создания доступной для клинической и лабораторной практики тест-системы определения активности нейтрофильной эластазы в сыворотке крови как показателя интенсивности протеолиза.

Вклад авторов: концепция и дизайн исследования — Нешкова Е.А., Метельская В.А., Драпкина О.М., Тимофеев Ю.С.; сбор и обработка материала — Тимофеев Ю.С., Метельская В.А., Нешкова Е.А., Дубовская Н.И.; написание текста — Метельская В.А., Тимофеев Ю.С., Нешкова Е.А., Дубовская Н.И., Смирнова М.И.; научное редактирование — Метельская В.А., Тимофеев Ю.С., Смирнова М.И., Джиоева О.Н., Драпкина О.М.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Authors contribution: study concept and design — Neshkova E.A., Metelskaya V.A., Drapkina O.M., Timofeev Yu.S.; collection and processing of material — Timofeev Yu.S., Metelskaya V.A., Neshkova E.A., Dubovskaya N.I.; text writing — Metelskaya V.A., Timofeev Yu.S., Neshkova E.A., Dubovskaya N.I., Smirnova M.I.; scientific editing — Metelskaya V.A., Timofeev Yu.S., Smirnova M.I., Dzhioeva O.N., Drapkina O.M.