Влияние демографических факторов и основных коморбидностей на уровни циркулирующих регуляторных микроРНК у пациентов с атеросклерозом коронарных артерий и аневризмой грудной аорты: одноцентровое когортное исследование

Важную роль во всех биологических процессах в организме человека играют специфические регуляторные молекулы — микроРНК (miRNA, miR). Данные молекулы являются малыми некодирующими цепочками рибонуклеиновых кислот, оказывающими регуляторное воздействие на экспрессию других генов. Помимо внутриклеточной локализации микроРНК присутствуют в различных жидкостях организма, в том числе, в крови. Факторы, определяющие уровни циркулирующих микроРНК, такие как активная секреция или пассивное выделение вследствие разрушения клеток, а также функциональные роли этих молекул все еще находятся в стадии изучения.

Основными практическими целями исследований роли микроРНК в патофизиологических процессах являются определение мишеней для терапии, а также выявление специфических диагностических маркеров. У пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями важным является выявление предвестников сосудистых катастроф. Значимость таких исследований сложно переоценить, поскольку уровень смертности от сердечно-сосудистых причин в России сохраняется на лидирующих позициях [1].

МикроРНК активно изучают как маркеры и потенциальные мишени сердечно-сосудистых заболеваний, прежде всего, ассоциированных с атеросклерозом [2—5].

МикроРНК — относительно новый класс молекул, поэтому стоит обращать особое внимание на кажущиеся вторичными связи с различными клинико-демографическими показателями. В настоящем исследовании мы сделали акцент именно на основных демографических и клинических показателях, чтобы указать на возможные значимые факторы, влияющие на оценку уровней циркулирующих микроРНК у пациентов с рядом сердечно-сосудистых заболеваний.

Цель исследования — провести анализ ассоциаций демографических факторов и основных коморбидностей с уровнями ряда циркулирующих микроРНК, ассоциированных с повреждением сосудистой стенки у пациентов с атеросклерозом коронарных артерий (КА) и аневризмой грудной аорты (АГА).

Данная работа является обсервационным исследованием пациентов Клинического центра Первого МГМУ им. И.М. Сеченова (Университетская клиническая больница №1), разделенными на группы по ведущим нозологиям. Группу пациентов с АГА составляли больные, госпитализированные в клинику аортальной и сердечно-сосудистой хирургии для хирургического лечения. Группу КА составили амбулаторные пациенты с выявленным поражением коронарных артерий по данным мультиспиральной компьютерной томографии в рамках первичной диагностики ишемической болезни сердца. Оставшуюся группу составили амбулаторные пациенты с интактными коронарными артериями. Протокол обследования включенных пациентов, данные групп, критерии включения и невключения опубликованы ранее [5]. Спецификой настоящей работы является исследование общих для всех пациентов ассоциаций уровней циркулирующих микроРНК с рядом показателей без сравнительного группового анализа.

Протокол исследования был одобрен этическим комитетом университета (протокол 119 от 14.07.2018 г.).

Предварительный расчет выборки не проводили.

В исследование были включены 100 пациентов (67 с атеросклерозом КА, 38 с АГА, 22 пациента наблюдались с обеими нозологиями, 17 пациентов без указанных нозологий). Средний возраст составил 63,1 года. Среди включенных пациентов женщины составили 57%. В качестве клинико-демографических переменных оценивали вклад курения (22%), наличия сахарного диабета (СД) 2-го типа (6%), снижения клубочковой фильтрации (СКФ) <60 мл/мин/1.73 м², приема ингибиторов АПФ (34%), блокаторов рецепторов ангиотензина (34%), статинов (48%), ацетилсалициловой кислоты (38%) и оральных антикоагулянтов (20%).

Лабораторный контроль показателей общего и биохимического анализов крови выполнен межклинической лабораторией Клинического центра Первого МГМУ им. И.М. Сеченова.

Количественное определение микроРНК проводили с использованием полимеразной цепной реакции в реальном времени.

На основании проведенного обзора литературы были отобраны 15 циркулирующих микроРНК: hsa.miR.21.5p, hsa.miR.23a.3p, hsa.miR.29b.3p, hsa.miR.92a.3p, hsa.miR.126.3p, hsa.miR.126.5p, hsa.miR.143.3p, hsa.miR.145.5p, hsa.miR.146a.5p, hsa.miR.150.5p, hsa.miR.181b.5p, hsa.miR.195.5p, hsa.miR.205.5p, hsa.miR.223.3p и hsa.miR.451a [5]. В дальнейшем пациенты распределялись на подгруппы по отдельным клиническим и демографическим факторам, таким как пол, статус курения, наличие СД, скорости клубочковой фильтрации, прием определенных групп лекарственных препаратов.

В настоящей работе оценивали ассоциацию возраста, пола, статуса курения, наличия СД, снижения СКФ <60 мл/мин/1.73 м², а также приема ряда лекарственных препаратов (ингибиторы ангиотензин превращающего фермента, блокаторы рецепторов ангиотензина, ингибиторы 3-гидрокси-3-метилглутарил-кофермент А редуктазы (статины), ацетилсалициловая кислота и оральные антикоагулянты) с уровнями циркулирующих микроРНК в объединенной группе пациентов (КА и АГА).

Диагноз СД соответствовал критериям клинических рекомендаций [6]. СКФ рассчитывали с использованием формулы CKD—EPI [7]. Группы были разделены на основания СКФ более или менее 60 мл/мин/1.73 м².

Статистический анализ проводили с использованием программы Prism 9 (GraphPad, США). Нормальность распределения была определена с использованием теста Андерсона-Дарлинга. В случае нормального распределения использовали метод Стьюдента для сравнения групп. В качестве непараметрических методов при отсутствии нормального распределения использовали U–критерий Манна—Уитни для попарного сравнения и критерий Краскела–Уоллиса для нескольких групп с распределением, отличающимся от нормального. Для сравнения качественных переменных использовали критерий хи-квадрат. Применяли корреляционный анализ Спирмена. Значение p<0,05 считали значимым для всех анализов. Различия в уровнях микроРНК рассматривали как имеющие практическое значение при их кратности в 2 раза и более.

Корреляционный анализ уровней циркулирующих микроРНК с возрастом не показал статистически значимых изменений (табл. 1).

Таблица 1. Ассоциации уровней циркулирующих микроРНК с возрастом

Уровни miR-126-3p были выше у пациентов мужского пола, в то время как уровни miR-205-5p и –143-3p были выше у женщин, однако кратность изменений была менее 2 (табл. 2). Уровни других микроРНК не различались.

Таблица 2. Ассоциации уровней циркулирующих микроРНК с полом

Примечание. * — кратность различий в два раза и более.

Значимых ассоциаций уровней циркулирующих микроРНК со статусом курения продемонстрировано не было. Изменения на уровне тренда отмечались для miR-126-3p, которая была выше у курильщиков, и miR-205-5p, которая была выше у некурящих лиц (рисунок).

Рисунок. Уровни циркулирующих микроРНК в зависимости от статуса курения.

Учитывая критерии невключения в исследование, пациенты составляли достаточно однородную группу в отношении коморбидных состояний. Поэтому основным исследуемым клиническим фактором было наличие СД 2-го типа, а также разделение пациентов в зависимости от СКФ (менее 60 мл/мин/1,73м² и менее 45 мл/мин/1,73м²).

У пациентов с СД были значимо повышены уровни miR-21-5p (p=0,037) и miR-29b-3p (p=0,042), для остальных молекул не отмечено диагностически значимых отличий (табл. 3).

Таблица 3. Сравнительный анализ уровней циркулирующих микроРНК у пациентов с СД и без него

Примечание. * — кратность различий в два раза и более.

При оценке уровней циркулирующих микроРНК у пациентов со снижением СКФ< 60 мл/мин/1,73м² отмечалось значимое повышение miR-21-5p (p=0,0096) и miR-92a-3p (p=0,0371), однако изменения уровней последней были менее чем двукратными. Более строгий порог расчетной СКФ в 45 мл/мин/1,73м² позволил выявить большее количество циркулирующих микроРНК помимо miR-21-5p и –92a-3p, уровни которых значимо повышались у пациентов с более выраженной хронической болезнью почек. МикроРНК miR-205-5p в этих группах не анализировали ввиду большого разброса значений (табл. 4).

Таблица 4. Сравнительный анализ уровней циркулирующих микроРНК у пациентов с различными пороговыми значениями скорости клубочковой фильтрации

Примечание. * — кратность различий в два раза и более.

В качестве основных групп лекарственных препаратов рассматривали иАПФ, блокаторы рецепторов ангиотензина, статины, ацетилсалициловую кислоту и оральные антикоагулянты.

В комбинированной группе пациентов, принимавших ингибиторы АПФ и блокаторы рецепторов ангиотензина, значимое снижение экспрессии отмечали для miR-146a-5p (p=0,037) при менее чем двукратной разнице между средними значениями в группах.

Среди пациентов, принимавших статины, отмечалось более чем двукратное снижение miR-21-5p, –126-3p, –181b-5p, однако при использовании поправки Бенджамини-Хохберга статистически значимых отличий получено не было.

У пациентов, принимавших ацетилсалициловую кислоту, значимо снижался уровень miR-126-3p (p=0,037). Прием антикоагулянтов не влиял на экспрессию исследуемых микроРНК.

Популяционных исследований ассоциаций микроРНК и демографических признаков в мировой и отечественной литературе немного. Тем не менее, анализ баз данных позволил провести сравнение по некоторым показателям. Так, в исследовании Ameling S. и соавт. [8] на выборке из 363 пациентов miR-126-3p не имела значимой корреляции с полом в отличие от нашей работы, однако повышалась с возрастом (p<0,01). Обусловлено это особенностями исследуемой популяции, так как в нашей работе средний возраст был старше более чем на 10 лет. В то же время, наши данные в отношении положительной корреляции miR-143-3p и miR-205-5p с женским полом сопоставимы с результатами указанного исследования. Тренды ассоциаций miR-29b-5p и miR-92a-3p с мужским полом, а также miR-150-5p с женским полом соответствуют исследованию Ameling S. и соавт. [8]. Отсутствие значимости, возможно, связано с разницей в размерах выборки.

Несмотря на отсутствие значимых ассоциаций уровней циркулирующих микроРНК со статусом курения в нашем исследовании, анализ более крупной популяции (N=2686) пациентов показал значимое повышение miR-126-3p у курящих пациентов [9], что сходится с трендом в нашей работе (практически двукратное превышение у курящих лиц, p=0,096). Стоит отметить, что в исследовании Karabegović I. и соавт. [9] также выявлено значимое увеличение уровней miR-150-5p, –29b-5p, –126-5p, –295-5p и –23a-3p со снижением miR-92a-3p у курильщиков. В другом исследовании японской популяции отмечалось повышение уровня miR-150-5p у курильщиков, однако, как и в нашей работе, корреляций со статусом курения для miR-21-5p и –195-5p не выявлено [10]. В ранних исследованиях также предполагалось вовлечение miR-126 и miR-146a в эндотелиальный ответ на курение [11]. В исследовании Motshwari D. и соавт. [12] подтверждается ассоциация miR-126-3p со статусом курения, что согласуется с нашими результатами.

В отличие от исследований демографических показателей публикаций об особенностях экспрессии микроРНК у пациентов с ХБП и СД значительно больше.

Так, упоминавшийся систематический обзор Garmaa G. и соавт. [13] указывает на апрегуляцию miR-21-5p и снижение miR-126-3p у пациентов с хронической болезнью почек. В нашей работе концентрация miR-126-3p была практически в 4 раза выше у пациентов с СКФ <45 мл/мин/1.73 м². Однако значимой разницы в группах с СКФ более и менее 60 мл/мин/1.73 м² не выявлено. Вероятно, причиной разницы в результатах исследований стала специфика нашей популяции. Повышение остальных микроРНК (miR-21-5p, 29b-3p, –146a, –150-5p, –181b-5p и –223) у пациентов со снижением СКФ подтверждено другими авторами [14—17].

В нашем исследовании только miR-21-5p и –29b-3p показали значимую связь с СД. Данные по экспрессии miR-21-5p при СД несколько противоречивы. С одной стороны, имеются исследования о снижении уровня miR-21-5p у пациентов с СД [18, 19]. Однако другие работы указывают на повышение уровней этой микроРНК [20], чему соответствуют и наши результаты. В то же время, уровни данной микроРНК сильно связаны с различными тканями, включая корковое вещество почек, поджелудочную железу и эндотелий. Не исключено, что сочетание различных характеристик исследуемых групп, включая коморбидные состояния, является причиной различий в результатах исследований.

Семейство miR-29 исследовано в основном за счет молекулы miR-29a, однако, учитывая кардиологическую специфику исследуемой нами выборки, анализ miR-29b-3p являлся важной задачей за счет связи с сосудистым воспалением. Исследований экспрессии циркулирующих miR-29b-3p немного. Работы in vitro указывают на повышение уровня данной микроРНК у пациентов с СД и ее связь с ростом инсулинорезистентности. Интересно, что настоящее исследование первым подтвердило повышение уровня циркулирующей miR-29b-3p у пациентов с СД 2-го типа по сравнению с пациентами без СД.

Одним из наиболее значимых микроРНК-маркеров СД 2-го типа считается снижение уровней miR-126. В нашей работе, наоборот, уровни miR-126-3p и –126-5p были выше у пациентов с СД 2-го типа, но, ввиду большого разброса значений, статистической значимости эти различия не достигли. В нашей работе большой разброс уровней экспрессии miR-126 обусловлен спецификой выборки и сильным вмешивающимся влиянием атеросклероза.

Важные результаты получены при исследовании ассоциаций уровней циркулирующих микроРНК с принимаемыми лекарственными препаратами. Так, у пациентов, принимавших препараты из групп иАПФ или БРА, уровни miR-146a-5p были ниже. Полученные нами данные соответствуют результатам проспективного исследования Takahashi и соавт. [2], в котором спустя год после начала терапии эналаприлом и телмисартаном у пациентов значимо снижались уровни циркулирующих miR-146a и –146b. Интересно, что в данной работе также выявлено значимое влияние приема статинов на снижение miR-146a, а в настоящей работе хоть и отмечалось ее снижение в полтора раза, но не достигало статистической значимости. Данная микроРНК активно участвует в патогенезе различных сердечно-сосудистых заболеваний, включая ИБС, хроническую сердечную недостаточность, фибрилляцию предсердий, аневризму грудной аорты и других, поэтому наше исследование подтверждает важность приема препаратов групп иАПФ/БРА у кардиологических пациентов.

При исследовании ассоциации уровней циркулирующих микроРНК с приемом ацетилсалициловой кислоты отмечалось значимое снижение miR-126-3p. Такая динамика вполне закономерна, учитывая высокое содержание данной микроРНК в составе тромбоцитов и связь с их реактивностью.

Одной из наиболее распространенных групп препаратов, которые применяют у пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями, являются ингибиторы ГМГ-КоА редуктазы (статины). Помимо липидснижающего эффекта этих препаратов важным является защитное воздействие на эндотелий сосудов.

В нашем исследовании значимая разница в экспрессии микроРНК на фоне приема статинов была выявлена для miR-21-5p, –126-3p и –181b-5p. Уровни указанных микроРНК в группе терапии были ниже более чем в два раза. Эффект снижения экспрессии miR-21-5p на фоне терапии статинами объясняется воздействием на несколько провоспалительных биологических путей и подтверждается в ряде исследований. В то же время, при исследовании влияния статинов на экспрессию микроРНК у пациентов с нестабильной стенокардией были получены обратные результаты для miR-21-5p и miR-126.

Несмотря на значительное количество работ, указывающих на регуляторную роль miR-126 в рамках атеросклеротического процесса, работ о непосредственном влиянии статинов на уровни этих микроРНК в циркулирующей крови немного. Как уже упоминалось выше, в исследовании пациентов с нестабильной стенокардией уровни miR-126 были выше в группе терапии статинами, что также отмечалось в ряде исследований in vivo и у пациентов с СД. Однако в другой работе в группах без терапии статинами у пациентов с нестабильной стенокардией уровни данной микроРНК были значительно ниже по сравнению с пациентами без атеросклероза. Стоит отметить, что большинство работ, указывавших на повышение уровней miR-126 на фоне терапии статинами, не разделяли –3p и –5p молекулы, имеющие различные функции, в частности, miR-126-3p имеет положительную корреляцию с коронарным кальцинозом и обладает атерогенными свойствами.

Данных по непосредственному влиянию статинов на экспрессию miR-181b к настоящему времени не опубликовано. Отмечается, что данная микроРНК транспортируется в крови в составе экзосом, и снижение ее уровня в циркулирующей крови обусловлено снижением числа частиц-переносчиков, в то время как на клеточные уровни miR-181b влияния не оказывают.

Настоящее исследование демонстрирует важность дополнительной диагностики ассоциаций уровней циркулирующих микроРНК с параметрами пола, возраста, коморбидности и получаемой лекарственной терапии. Кажущиеся второстепенными отличия основных исследуемых групп при изучении микроРНК могут оказаться определяющими.

В выборке пациентов с сосудистой патологией мы показали значимые ассоциации ряда микроРНК с полом и статусом курения. Большое количество микроРНК имели значительную разницу экспрессии в зависимости от скорости клубочковой фильтрации. Влияние СД отмечалось на уровни miR-21-5p и –29b-3p. Лекарственные препараты, в частности, ингибиторы АПФ/БРА, ацетилсалициловая кислота и статины также оказывали влияние на уровни циркулирующих микроРНК.

Данная работа была профинансирована Министерством науки и высшего образования Российской Федерации в рамках государственной поддержки создания и развития исследовательских центров мирового уровня «Цифровой биодизайн и персонализированное здравоохранение» №075-15-2022-304.

От всех пациентов было получено информированное согласие. Исследование одобрено этическим комитетом Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова (протокол №0119 от 14.07.2018 г.).