Введение

Фактор роста эндотелия сосудов (vascular endothelial growth factor, VEGF) — высококонсервативный гликопротеин с молекулярной массой 45 кДа, являющийся ключевым медиатором ангиогенеза, неоваскуляризации и эмбрионального развития [1, 2].

VEGF представляет собой не один белок, а семейство факторов роста эндотелия, состоящее из семи членов, играющих регулирующую роль в различных сосудистых системах: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F и PIGF [3]. VEGF-A — наиболее сильный и специфический фактор роста сосудов, являющийся ключевым регулятором в физиологическом и патологическом ангиогенезе [4].

Экспрессия VEGF-A зависит от транскрипции и стабильности мРНК, а также от ее альтернативного сплайсинга. Например, показано, что один человеческий ген VEGF-A дает по крайней мере 8 изоформ (VEGF-121, 145, 148, 162, 165, 183, 189 и 206), чья относительная распространенность варьирует в разных тканях [5].

При этом изоформа-165 является основным продуктом гена VEGF-A в тканях человека, оказывающим проангиогенное действие, то есть стимулирующим образование и рост сосудов из ранее существовавших дифференцированных эндотелиальных клеток сосудистой сети [6, 7].

Показано, что в разных клинических ситуациях VEGF-165 может играть как положительную роль, стимулируя выживаемость и восстановление эндотелия, например, при патологии клубочков почек [8], так и отрицательную, стимулируя опухолевый рост [9].

Можно предположить, что при атеросклерозе периферических сосудов VEGF-165 также может играть двоякую роль: позитивную, стимулируя образование коллатералей, и негативную, приводя к нестабильности атеросклеротической бляшки и прогрессированию атеросклероза [10, 11].

Цель исследования — оценка экспрессии VEGF-165 в сосудистой стенке при различных стадиях атеросклероза периферических артерий и способах его хирургического лечения.

Материал и методы

В исследование были включены 25 пациентов (19 мужчин и 6 женщин) с облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей (ОААНК) III—IV ст. по классификации А.В. Покровского-Фонтейна, проходивших лечение на базе ГБУ РО «Областная клиническая больница».

Клиническая характеристика пациентов представлена в таблице. Пациенты поступали в стационар для первичного открытого оперативного вмешательства (аорто-бедренное, бедренно-подколенное, перекрестное бедренно-бедренное шунтирование и др.) или повторной артериальной реконструкции по поводу рестеноза или тромбоза в зонах исходного вмешательства на магистральных артериях нижних конечностей.

Таблица. Клиническая характеристика пациентов

Примечание. ОААНК — облитерирующий атеросклероз артерий нижних конечностей.

В качестве контроля использовали артериальные образцы без видимых признаков атеросклероза у пациентов, у которых выполняли реконструктивно-восстановительные операции. Контроль венозных образцов включал вены после флебэктомии при варикозном расширении подкожных вен нижних конечностей.

Для уточнения локализации поражения и определения дальнейшей тактики ведения пациентов до операции проводились аортоангиография, ультразвуковое дуплексное сканирование артерий нижних конечностей (УЗДС).

После подписания информированного согласия у пациентов забирался интраоперационный материал, представлявший собой все три слоя сосудистой стенки.

Образец сосуда измельчали и готовили гомогенат с помощью набора Ready PrepProtein Extraction Kit («Bio-Rad») с использованием ингибитора протеаз («Sigma») и роторного высокоскоростного гомогенизатора DIAX 900 (насадка 6G) со скоростью 24 000 об/мин в течение 60 с при температуре +4 °C. Полученный гомогенат центрифугировали при 1000 g в течение 10 мин (t +4 °C).

В полученном супернатанте определяли количество белка по методу Бредфорда с помощью Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit («ThermoScientific»).

Цитоплазматические белки (30 мкг) подвергали электрофорезу с использованием TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit («Bio-Rad») в буферной системе Laemmli («Bio-Rad»). Перед загрузкой образцы обрабатывались в соответствии с протоколом Bio-Rad. Их смешивали с равным объемом буфера для образцов Laemmli («Bio-Rad»), содержащим 50 мМ дитиотреитола («Helicon»), и нагревали до 95 °C в течение 5 мин. Гели прогоняли при 300 В в течение 30 мин.

Белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Trans-Blot Turbo Mini-Size Nitrocellulose, «Bio-Rad») с использованием Mini Trans-Blot («Bio-Rad») в течение 3 мин при 25 В и 2,5 А.

Белки на мембране блокировали 1% раствором Casein Blocker («Bio-Rad»), содержащим 0,5% Tween-20 («Sigma»), при инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре.

Детекцию белка VEGF-165 проводили с использованием первичных мышиных моноклональных антител (Monoclonal Antibody to Vascular Endothelial Growth Factor 165, MAB696Hu21, «Cloud-Clone Corp.») в концентрации 1:500 в блокирующем растворе в течение 1 ч с последующим интенсивным трехкратным (каждый раз в течение 10 мин) промыванием TBS-T («BIO-RAD»).

Визуализацию первичных антител осуществляли с использованием вторичных кроличьих поликлональных антител (Rabbit Anti-Mouse IgG Secondary Antibody, HRP, «Thermo Fisher Scientific») в разведении 1:4000 в блокирующем растворе в течение 1 ч с последующим интенсивным трехкратным (каждый раз в течение 10 мин) промыванием TBS-T («BIO-RAD»).

Молекулярная масса VEGF-165 была подтверждена путем сравнения с предварительно установленными маркерами молекулярного размера (Precision Plus Protein Standards Dual Color, «Bio-Rad»).

Белки визуализировали хемилюминесценцией с помощью Chemi Doc XRS+ («Bio-Rad»). Интенсивность полученных полос (бэндов) анализировали денситометрически с помощью программного обеспечения Image Lab («Bio-Rad»). Количество VEGF-165 оценивали относительно содержания белка домашнего хозяйства GAPDH (антитела GAPDH Loading Control Monoclonal Antibody (GA1R), «Thermo Fisher Scientific»).

Полученные результаты обрабатывали с помощью программы IBM SPSS Statistics и Microsoft Excel for MAC ver. 16.24 (ID02984.001.000001). Для оценки статистической значимости различий использовали дисперсионный анализ (ANOVA), попарные сравнения выполняли с помощью критерия Даннета. Статистически значимыми считали различия при p<0,05.

Результаты и обсуждение

В ходе исследования было показано, что в образцах артерий без видимых признаков атеросклероза экспрессия VEGF-165 на 20,8% выше значений в венах, удаленных по поводу варикозного расширения подкожных вен нижних конечностей (p=0,045).

При артериализации вены (ее использовании в качестве аутовенозного шунта) экспрессия VEGF-165 в ее стенке повышалась и достоверно не отличалась от значений в артериях без признаков атеросклероза (рис. 1).

Рис. 1. Экспрессия VEGF-165 в стенке вены.

1 — стенка артерии без видимых признаков атеросклероза (контроль); 2 — стенка вены после флебэктомии при варикозном расширении вен нижних конечностей; 3 — стенка вены после тромбоза аутовенозного бедренно-подколенного шунта. Статистическая значимость указана по сравнению с экспрессией VEGF-165 в стенке артерии без видимых признаков атеросклероза (ANOVA, тест Даннета).

Таким образом, синтез VEGF-165 в стенке артерии выше, чем в стенке вены, но при ее артериализации происходит гиперплазия эндотелия и прорастание капилляров из ложа вены с восстановлением vasa vasorum, что приводит к повышению VEGF-165 до уровня этого фактора в артериях [12].

В стенке артерий в области атеросклеротической бляшки у пациентов с ОААНК III ст. экспрессия VEGF-165 достоверно не отличалась от показателей в артериях без признаков атеросклероза, а в стенке артерии у пациентов с ОАНК IV ст. имела тенденцию к повышению на 42,8% (p=0,059) (рис. 2).

Рис. 2. Экспрессия VEGF-165 в стенке артерии.

1 — стенка артерии без видимых признаков атеросклероза (контроль); 2 — стенка артерии в области рестеноза дистального анастомоза бедренно-подколенного шунта; 3 — стенка артерии в области атеросклеротической бляшки при III ст. заболевания; 4 — стенка артерии в области атеросклеротической бляшки при IV ст. заболевания; 5 — стенка артерии в области стабильной атеросклеротической бляшки; 6 — стенка артерии в области нестабильной атеросклеротической бляшки. Статистическая значимость указана по сравнению с экспрессией VEGF-165 в стенке артерии без видимых признаков атеросклероза (ANOVA, тест Даннета).

В стенке артерий в области рестеноза дистального анастомоза синтетического бедренно-подколенного шунта экспрессия VEGF-165 достоверно не отличалась от значений контроля (артерия без видимых признаков атеросклероза).

Поскольку экспрессии VEGF-165 при разных стадиях ОААНК достоверно не отличалась от значений в артериях без видимых признаков атеросклероза, мы сгруппировали пациентов в две группы по стабильности атеросклеротической бляшки: пациенты со стабильными атеросклеротическими бляшками и больные с нестабильными бляшками по данным ультразвукового исследования.

Было показано, что при стабильных атеросклеротических бляшках экспрессия VEGF-165 достоверно не отличалась от таковых значений в артериях без видимых признаков атеросклероза, в то время как в артериях с нестабильными атеросклеротическими бляшками экспрессия VEGF-165 увеличивалась на 53,2% (p=0,022).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что наибольшее значение в повышении экспрессии VEGF-165 в стенке артерии играет не выраженность атеросклероза, а стабильность атеросклеротической бляшки. Пациенты, которые имели гетерогенную структуру атеросклеротической бляшки с преобладанием гипо- или изоэхогенного компонента по данным ультразвукового исследования, показывали более высокие уровни экспрессии VEGF-165.

VEGF-165 может повышать экспрессию металлопротеиназы-1, молекул клеточной адгезии 1 типа (VCAM-1), внутриклеточной молекулы адгезии (ICAM), тканевого фактора свертывания крови, что может способствовать дестабилизации атеросклеротической бляшки и ее разрыву [13].

Заключение

Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) представляет собой мультифункциональный цитокин, являющийся ключевым медиатором ангиогенеза, неоваскуляризации и эмбрионального развития. При сосудистой патологии он может выполнять двойную функцию, с одной стороны, стимулируя ангиогенез, что было показано нами в артериализованной вене, с другой стороны, способствовать дестабилизации атеросклеротической бляшки и развитию осложнений.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.