Список сокращений

ГБ — глиобластома

ОСК — опухолевые стволовые клетки

НСК — нейральные стволовые клетки

ПК — прогениторные клетки

OPN — остеопонтин (Osteopontin)

BCRP1 — белок устойчивости к раку молочной железы

MGMT — O[6]-метилгуанин-ДНК метилтрансфераза (О[6]-MethylGuanine-DNA-MethylTransferase)

ГСК — глиальные стволовые клетки

Введение

Первичная мультиформная глиобластома (ГБ) взрослых — распространенная, быстрорастущая и очень агрессивная опухоль. Определение «мультиформная» было введено в 1926 г. по причине наличия в опухоли некрозов, кист, геморрагий [1]. Это же прилагательное можно использовать и для описания высокой степени внутриопухолевой клеточной и молекулярной гетерогенности ГБ, которая будет обсуждаться в данном обзоре. Стандартная терапия ГБ — хирургическое вмешательство с последующей радио- и химиотерапией — не удаляет опухолевые клетки полностью и обеспечивает лишь ограниченный терапевтический эффект с медианой выживаемости менее 2 лет [2].

Исходя из современной литературы, ГБ можно рассматривать как «патологический орган», состоящий по крайней мере из двух субпопуляций клеток: клетки опухоли и так называемые опухолевые стволовые клетки (ОСК). Деление последних восстанавливает опухоль и приводит к рецидивам. Точное определение ОСК пока не выработано; стандартные молекулярные маркеры отсутствуют, проводится их итеративный поиск. ОСК идентифицируют только по свойствам, которые они проявляют. Из-за наличия только операционного определения в литературе ОСК иногда называют «клетками, подобными стволовым» или «клетками, инициирующими опухоль». Кроме того, ОСК посвящен ряд книг [3—7].

Так же как и для нормальных тканей, на клеточном уровне в ГБ для различных типов клеток существует иерархия, возникающая из-за мультинаправленной дифференцировки. Как и нормальная ткань восстанавливается при делении стволовых клеток (СК), ГБ поддерживает долговременный рост с помощью ОСК, для которых характерно аберрантное самообновление и дифференцировка (рис. 1). ОСК глиомы могут продолжительное время находиться в неактивном состоянии (quiescence), а при делении вызывать рецидивы [8]. ОСК глиомы персистируют и способны мигрировать в здоровую ткань мозга; при этом они устойчивы к облучению и химическим препаратам [9]. Поэтому разработка именно целевого воздействия на ОСК обеспечит создание принципиально новых комплементарных эффективных противоопухолевых препаратов, которые закроют существующий пробел в современных стандартных видах терапии.

Рис. 1. Баланс стволовых клеток в норме и при патологии.

Уже на ранних этапах исследований стало понятно, что ОСК — прародитель опухоли, и важно некое физиологическое состояние данной клетки, которое может быть динамичным или даже обратимо изменяемым. Понимание этой новой сущности заставляет системно подходить ко всей совокупности внутри- и внеопухолевых факторов, которые определяют «стволовость» этих клеток в ГБ. Особое внимание заслуживают молекулярные механизмы глиомагенеза, детально рассмотреть которые даже для одного молекулярного маркера, так или иначе связанного с ОСК, например CD133, в небольшом обзоре невозможно. Настоящая работа ограничится только вводными замечаниями, которые будут иллюстрироваться избранными примерами последних двух лет.

Концепция ОСК объясняет почему ГБ до сих пор не излечивается. Накопление большого числа данных по структуре генома и экспрессии генов не приведет к обнаружению генов-драйверов и их транскриптов в редкой популяции ОСК на фоне гетерогенной популяции клеток опухоли. Как идентифицировать ОСК, если мы имеем уже конечную опухоль, которая мультифокальна и гетерогенна в каждом фокусе? Что является причиной, а что — последствием изменений в микроокружении конкретной опухоли или фокуса в мультифокальной опухоли? Более того, сигналы из локального окружения могут индуцировать разную степень незрелости клеток опухоли, а также разнообразную способность клеток «мимикрировать», приспосабливаться к окружению. Любое воздействие на опухоль снижает представленность опухолевых клеток, не затрагивая ОСК, при этом ее пластичность при любом воздействии позволяет «подстраиваться» под условия, производя посредством деления ОСК новые клетки-предшественники с устойчивостью к данному воздействию. Пластичность — это существенный момент в патогенезе опухоли, где фенотипический дрейф может происходить при инициации, прогрессии и селекции клонов, приводя к возникновению терапевтической устойчивости [10]. Уникальные данные по индивидуальной пластичности были получены с помощью техники баркодов [11]. Необходимо учитывать не только клональную гетерогенность, но и динамику профиля экспрессии маркеров при прогрессии ГБ [12].

Классическая «стохастическая модель» объясняет фенотипическую разницу генетических субклонов ГБ как результат накопления независимых соматических мутаций. Модель ОСК определяет их как недифференцированные клетки с двумя классическими характеристиками стволовости нормальных нейральных СК мозга (НСК), а именно: (1) самообновление, (2) мультипотентная дифференцировка прогениторных клеток (ПК), — и при этом имеет еще одну, третью характеристику: (3) потерю нормального контроля гомеостаза — поддержания баланса между этими двумя процессами. Источником опухоли могут быть НСК, перерожденные в ОСК, или ранние ПК, потерявшие правильный вектор миграции в зону «созревания» и осевшие в случайном месте мозговой ткани (рис. 2) [13, 14]. Эти 2 модели не исключают друг друга, а указывают на 2 независимых пути вариабельности, оба пути могут развиваться одновременно и вносить свой вклад в разнообразие клеток ГБ. Изучение клонального профиля образцов на определенной стадии развития опухоли пациентов, полученных сразу после операции, является одной из основных целей Биобанка. Современные методы позволяют анализировать индивидуальные клетки (single cell) пациентов.

Рис. 2. Схема направлений дифференцировки НСК и появления ОСК.

Опухоль формируется из множества субклонов с различными молекулярными и геномными изменениями [15]. При анализе суммарной опухоли разница субклонов нивелируется [16]. Гетерогенность критична для обеспечения опухолевого роста и агрессивности [17] и связана с негативным прогнозом для пациента. Различные субклоны опухоли по-разному отвечают на терапию [18].

В норме НСК активируются только по необходимости, потом они вновь переходят в неактивное состояние. Но у ОСК, в отличие от НСК, наблюдается больший пролиферативный потенциал, а у прогениторных клеток опухоли — повышенное количество симметричных делений. При этом растущая опухоль стимулирует миграцию в зону опухоли других стволовых клеток субвентрикулярной зоны. Интересно, что терапевтическое снижение числа опухолевых клеток ГБ приводит к дисбалансу и увеличению процента ОСК в опухоли, что стимулирует активную пролиферацию ОСК.

Откуда происходят ОСК? В норме плюрипотентные НСК делятся ассиметрично, в результате чего получаются НСК и мультипотентные ПК. Вследствие двух последующих симметричных делений количество ПК увеличивается, с последующим их созреванием в конечные функциональные соматические клетки: нейроны, олигодендроциты и астроциты (см. рис. 2). Таким образом, ОСК могут получиться из мутантных НСК [19] или опухоль может произойти при пролиферации мутантных ПК с арестом дифференцировки, или путем комбинаций [20, 21], что приведет к медулобластоме, олигодендроглиоме и ГБ [14, 22].

Для того, чтобы ОСК можно было идентифицировать в опухоли и сделать их хорошей терапевтической мишенью, нужно прежде всего найти для них уникальные поверхностные маркеры. Хотя представленность некоторых характеристических маркеров ОСК выше в ГБ, до сих пор нет ни единичных маркеров, ни их комбинаций, которые рекомендованы для диагностики [23].

CD133 как маркер нейральных и опухолевых стволовых клеток

CD133 (проминин-1) — мембранный белок, предполагаемый маркер НСК человека и ОСК мозга [24, 25]. Уровень экспрессии CD133 повышен в опухолях, расположенных в субвентрикулярной зоне — доноре НСК [26]. Экспрессия CD133 была обнаружена в различных популяциях примитивных клеток [27], например, в тканях фетального мозга.

Успешная попытка установления молекулярных маркеров в формате Биобанка опубликована в 2022 г. [28]. Иммуногистохимически проанализировано 30 образцов опухолей пациентов на наличие стандартных маркеров СК: CD133, Musashi, NANOG, NESTIN, OCT4, SOX2 и OPN. Уровни экспрессии CD133 и NESTIN были обратно пропорциональны выживаемости, оба маркера оказались перспективными для детального клинического изучения.

Субпопуляция клеток CD133⁺, выделенная из образцов ГБ человека, может пролиферировать и самоподдерживаться аналогично НСК, но процент клеток CD133⁺ в ней будет падать, что характерно для ассиметричного деления НСК [25, 29, 30]. Всего сотня клеток ГБ CD133⁺, трансплантированных во фронтальный кортекс взрослой иммунодефицитной мыши, дает опухоли с популяцией клеток CD133⁺ и CD133^–; так как они повторяют фенотип исходной опухоли [29], их можно рассматривать как часть популяции ОСК.

ОСК устойчивы к радио- и химиотерапии, выживают в участках ткани с гипоксией и локализуются в периваскулярных нишах [31]. ОСК оказываются даже более устойчивы к химио- и радиотерапии, чем ПК и созревающие клетки опухоли, что вызывает рецидивы ГБ. Отмечают, что подобные свойства характерны для клеток CD133⁺, которые оказались чрезвычайно резистентны к химиотерапии по сравнению с клетками CD133^—. У них повышена экспрессия генов, связанных с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) и репарацией ДНК, особенно BCRP1 и MGMT. Клетки ГБ с метилированным промотором MGMT положительно отвечают на химиотерапию, а выживание пациентов выше [32, 33]. Клетки CD133⁺ имеют повышенную экспрессию анти-апоптотических генов: FLIP, BCL-2 и BCL-X_L [32].

Наиболее эффективная терапия ГБ — это облучение, но ей препятствует радиорезистентность ОСК. После облучения первичные культуры и ксенографты ГБ были обогащены клетками CD133⁺. В этих клетках активированы контрольные точки клеточного цикла и усилена репарация ДНК [25]. Ортотопические ксенографты клеток CD133⁺ показывают повышенную радиорезистентность клеток CD133⁺ по сравнению с клетками CD133^–. По-видимому, радиорезистентность клеток опухоли определяется и ее микроокружением [34]. Клетки CD133⁺, выделенные из облученных опухолей, были более туморогенны, чем CD133^–. Возможно, именно они наиболее агрессивны при рецидивах [25].

В настоящее время нельзя утверждать, что CD133 — это доминантный маркер ОСК. Некоторые опухолевые клетки CD133^— ведут себя как ОСК: они способны самообновляться, асимметрично делиться, образовывать нейросферы, индуцировать туморогенез [35, 36] иногда даже активнее, чем клетки CD133⁺ [37]. Поэтому требуется тщательный анализ чистоты фракции клеток CD133^–.

Существуют ГБ, которые не содержат клетки CD133⁺. Видимо, этот маркер экспрессируется только в отдельных субпопуляциях ОСК определенных опухолей. Следовательно, вариации маркера CD133⁺ могут отражать как внутри-, так и межопухолевую гетерогенность [35, 38]. В работе F. Lessi и соавт. были проанализированы 3 опухоли ГБ с помощью технологии DEPArray, содержание клеток CD133⁺ оказалось: 0,4%, 0,6%, 0% [1].

Клетки CD133⁺ могут отличаться взаимодействием с микроокружением, например способностью к инфильтрации, стимуляцией ангиогенеза. В зависимости от экспрессии CD133 сигнатура из 24 генов дает 2 кластера субтипов ОСК: ОСК типа I напоминают фетальные НСК, получившие название клетки с «пронейральным» профилем транскрипции и экспрессирующие CD133⁺, EGFR⁺, PDGFRальфа⁺; ОСК типа II, схожие с НСК взрослого организма, названные клетками с «мезенхимальным» профилем транскрипции с полностью обратными характеристиками маркеров: CD133^–, EGFR^–, PDGFRальфа^– [39]. Следовательно, клетки CD133⁺ фенотипически уникальны и отличаются от клеток CD133^–, при этом они имеют клиническое значение как мишени субпопуляции клеток в субпопуляции пациентов с ГБ.

В данном обзоре не обсуждаются конфликтные данные о возможности корреляции прогноза ГБ с экспрессией CD133 [40].

Существует ряд факторов, которые существенно влияют на интерпретацию данных по CD133. Во-первых, это дезинтеграция ткани на клетки с помощью сериновых пептидаз: трипсин может расщеплять CD133 и искажать результаты тестов на белок. Во-вторых, факторы микроокружения: например, гипоксия стимулирует увеличение представленности клеток CD133⁺, и непонятно, связано ли это с выживанием ОСК CD133⁺ или увеличением представленности мембранной формы проминина-1. В-третьих, существующий набор моноклональных антител для детекции всех вариантов CD133, в том числе и его гликозилированных производных, приводит к недооценке количества CD133, а также к неполному извлечению фракции CD133⁺ из опухолевой популяции клеток [41—43].

Явной функциональной связи между CD133 и ОСК до сих пор не установлено, несмотря на множество исследований. Для идентификации ОСК начали использовать очередной молекулярный маркер — трисахарид CD15. CD15 экспрессируется совместно с CD133, но частота его детекции в первичных образцах и линейных клетках ГБ выше [44].

Заключение

Терапия будущего для ГБ, равно как и для других типов опухолей, будет использовать различные пролонгированные и специфические воздействия на 2 совершенно различные субпопуляции клеток: ОСК и клетки основной массы опухоли [30]. Причем ее эффективность будет зависеть как от природы воздействия на каждую субпопуляцию, так и от последовательности этих воздействий. ОСК станут важной мишенью, на эрадикацию которой будет направлена таргетная терапия. С помощью единичного молекулярного маркера нельзя характеризовать ОСК, что подтверждается исследованиями CD133. Необходим набор молекулярных маркеров, специфичный для данного типа клеток, а их комбинация позволит более точно определить ОСК.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (соглашение №075-15-2020-809, вн. номер 13.1902.21.0030).

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Копылов А.М., Павлова Г.В.

Сбор и обработка материала — Копылов А.М., Антипова О.А.

Написание текста — Копылов А.М.

Редактирование — Павлова Г.В.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.