Некодирующие РНК как терапевтические мишени при травме спинного мозга

ТСМ — травма спинного мозга

нкРНК — некодирующие РНК

длнРНК — длинные некодирующие РНК

СМ — спинной мозг

Повреждение спинного мозга (СМ) при травме часто приводит к значительному снижению качества жизни и инвалидизации. Это связано с нарушением и утратой моторных и сенсорных функций, нарушением функции систем жизнеобеспечения — дыхательной, сердечно-сосудистой, нарушением деятельности желудочно-кишечного тракта и мочевыведения, а также связано с развитием костно-мышечных деформаций [1, 2]. Частота травмы спинного мозга (ТСМ) в мире составляет 10,5 случаев на 100 тыс. человек в год, что соответствует примерно 750 тыс. случаев ежегодно. Средний возраст пострадавших составляет 39,8 года. Мужчины получают спинальную травму в 3,37 раза чаще женщин. Таким образом, в зоне риска оказывается самая активная группа населения, что обусловливает важность разработки новых подходов к диагностике и лечению этой патологии [2].

Существует 2 основных механизма повреждения СМ: первичное механическое и вторичное, включающее воспаление, ацидоз и апоптоз, образование глиального рубца, который действует как физический и молекулярный барьер для регенерации аксонов [3—5]. К вторичным повреждениям СМ относится астроглиоз, при котором резко увеличивается количество астроцитов в зоне повреждения нейронов при травме, инфекции, инсульте или нейродегенеративном заболевании. Однако астроглиоз играет важную роль в процессах регенерации, поскольку восстанавливает гомеостаз после повреждения СМ, облегчая восстановление гематоэнцефалического барьера и подавляя процесс воспаления [6, 7]. Благоприятный эффект астроглиоза обнаружен в ранней гипертрофической фазе повреждения СМ, тогда как поздняя гиперпластическая фаза приводит к образованию плотного рубца, который затрудняет регенерацию аксонов [8, 9]. Вместе с тем показано, что апоптозу подвержены не только нейроны, но и другие клетки СМ, такие как олигодендроциты и клетки микроглии [6]. Потеря олигодендроцитов в трактах белого вещества продолжается и спустя несколько недель после повреждения СМ и может способствовать прогрессирующей демиелинизации [10, 11].

Изменение экспрессии генов играет важную роль в патогенезе вторичного повреждения СМ. Однако мало известно о механизмах, которые регулируют изменение экспрессии этих генов. Около 70—80% человеческого генома активно транскрибируется в РНК, тогда как только 2% транскрибируется в белок-кодирующие микроРНК, и это указывает на то, что количество некодирующих РНК (нкРНК) намного выше, чем количество кодирующих белок генов. В зависимости от размера транскрипта нкРНК сгруппированы в два основных класса: малые и длинные. Малые нкРНК включают хорошо описанные микроРНК, малые интерферирующие РНК (миРНК) и PIWI-взаимодействующие РНК. Так, нкРНК являются хорошими кандидатами на роль регуляторов вторичного повреждения СМ, поскольку они могут регулировать группы генов посттрансляционным способом [11—13]. Некоторые формы микроРНК играют существенную роль в эмбриональном развитии нервной системы и являются важными медиаторами нейрональной пластичности [14, 15]. Доказано участие ряда микроРНК в развитии тяжелых неврологических заболеваний, таких как синдром Туретта [16]. Некоторые исследования направлены на определение роли микроРНК в процессах нейродегенерации [17, 18]. Следует отметить, что до 40% всех известных нкРНК специфически экспрессируются в головном мозге и других отделах центральной нервной системы [19]. Это открытие показало, что длинные некодирующие РНК (длнРНК) могут участвовать в патогенезе заболеваний нервной системы. В связи с этим идентификация экспрессированных нкРНК с использованием геномных подходов откроет путь к пониманию развития заболеваний, опосредованных длнРНК. Роль нкРНК в повреждении СМ остается недостаточно изученной, несмотря на то что обнаружена экспрессия большого количества нкРНК в СМ мышей.

N. Liu и соавт. провели эксперимент на крысах с черепно-мозговой травмой, чтобы определить экспрессию микроРНК во времени [15]. Авторы смогли определить, что СМ травмированной крысы содержит приблизительно 77% (269) микроРНК, идентифицированных у здоровой крысы (350), что позволяет предположить, что СМ является богатым источником экспрессии микроРНК. Экспрессия 97 из 269 микроРНК изменилась после повреждения СМ. Экспрессия 60 из 97 микроРНК обнаружена в умеренном, высоком и очень высоком количестве. Экспрессия остальных 37 микроРНК была на низком уровне. Поскольку декомпрессия СМ является основным вариантом хирургического лечения при травме, М. Ziu и соавт. провели исследование, чтобы проанализировать пространственную и временную экспрессию различных микроРНК и их связь с продолжительностью сдавления СМ [20]. Эти исследователи смогли доказать, что экспрессия некоторых микроРНК отличается в зависимости от времени сдавления. В частности, miR-107 экспрессируется в модели длительного сдавления, в то время как ее уровень не изменяется в модели короткого сдавления. Экспрессия miR-148 повышена через 3 и 6 ч после продолжительного повреждения при сдавлении и через 6 ч при коротком сдавлении. Кроме того показано, что miR-210 активируется через 3, 6 и 24 ч в модели длительного сдавления и только через 24 часа, если сдавление имеет короткую продолжительность.

V. Sahni и соавт. провели эксперимент на мышах с повреждением СМ, чтобы определить роль костных морфогенетических белков (BMPs; bone morphogenetic proteins) и их рецепторов в астроглиозе, вторичном к повреждению СМ [9]. Эти авторы смогли выявить значительное увеличение уровней BMP4 через 4, 7 и 15 дней после травмы. Они также обнаружили умеренное повышение уровня BMP7 через 4 дня после травмы, а также возврат к исходному уровню через 7 дней. Исследователи также показали увеличение транскрипции рецептора 1a BMP (BMPR1a) и белка GFAP (glial fibrillary acidic protein) через 4 и 7 дней после повреждения. Сигнальный путь BMP включает белки SMAD (similar to mothers against decapentaplegic), и показано, что эти белки контролируют посттранскрипционный процессинг miR-21 [17]. При изучении поведения этой микроРНК они смогли продемонстрировать, что передача сигналов BMPR1a ингибирует цитоплазматический процессинг miR-21 таким образом, что обработанный конечный продукт этой микроРНК обычно ингибируется при повреждении СМ. Впоследствии O. Bhalala и соавт. провели эксперимент на мышах с целью выяснения роли miR-21 в астроцитарном ответе после повреждения СМ [21]. Авторы продемонстрировали, что после травматического повреждения СМ сверхэкспрессия miR-21 в астроцитах ослабляет гипертрофический ответ. Помимо этого они обнаружили, что ингибирование функции miR-21 сопровождается увеличением плотности аксонов в месте поражения. Авторам удалось показать новый эффект miR-21 в регуляции астроцитарной гипертрофии и прогрессии глиального рубца после повреждения СМ. B. Izumi и соавт. сосредоточились на изучении экспрессии miR-223 и смогли выявить высокую экспрессию этой микроРНК через 12 ч после повреждения СМ [22]. В отношении апоптоза G. Liu и соавт. продемонстрировали значительное изменение экспрессии некоторых микроРНК у крыс с повреждением СМ; фактически они обнаружили увеличение экспрессии Let-7a и miR-16 и снижение уровней miR-15b через 10 дней после повреждения [23].

Регенерация — способность воспроизводить точные копии утраченных анатомических структур. Это явление, наблюдаемое у некоторых видов позвоночных, таких как саламандры, аксолотли и рыбки данио, утрачено млекопитающими. Молекулярные механизмы, с помощью которых осуществляется этот процесс, все еще не ясны [24]. Исследована роль микроРНК в регенерации СМ после его повреждения у некоторых из этих видов. T. Sehm и соавт. провели эксперимент на аксолотлях и определили роль miR-196 в регенерации хвоста после его ампутации [24]. Авторы показали значительное увеличение экспрессии miR-196 в первые 14 дней после ампутации, которое впоследствии не поддерживалось. Ингибирование miR-196 приводило к существенным дефектам регенерации. Полученные данные свидетельствуют о том, что эта микроРНК играет ключевую роль на ранних стадиях регенерации хвоста, ампутированного у аксолотлей. У этого же вида J. Díaz Quiroz и соавт. обнаружили, что miR-125b необходима для функционального восстановления повреждений СМ [25]. Авторы показали, что снижение уровня miR-125b у аксолотля до уровня, отмечаемого у крыс, ингибирует регенерацию за счет регуляции гена Sema4D, который вызывает образование глиального рубца. Также изучали роль miR-133b в функциональном восстановлении после повреждения СМ Y. Yu и соавт. [26]. Для этого они использовали модель повреждения СМ у рыбок данио и выявили положительную регуляцию miR-133b в нейронах. Ингибирование miR-133b привело к изменению моторного восстановления, а также к снижению регенерации аксонов при наблюдении за регенерацией в области среза СМ.

N. Liu и соавт. проанализировали роль микроРНК после повреждения СМ при исследовании потенциальных генов-мишеней [15]. Посредством статистического анализа они продемонстрировали, что эти мишени являются генами, которые кодируют компоненты, вовлеченные в различные физиологические процессы, такие как воспаление, ацидоз и апоптоз. Гены, ингибирующие воспалительный процесс, являются потенциальными мишенями для некоторых микроРНК. К ним относятся miR-221, miR-1, miR-206, miR-152, miR-122, miR-181a, miR-411, miR-99a, miR-34a, miR-30c, miR-384-5p, miR-30b-5p и miR-214. Ряд генов, ответственных за апоптоз, являются потенциальными мишенями для микроРНК, экспрессия которых понижена после повреждения СМ (miR-127, iR-181a, miR-411, miR-34a и miR-384-5p). Результаты исследований показывают, что аномальная экспрессия микроРНК после травматического повреждения СМ может способствовать генезу вторичных повреждений. Таким образом, эти микроРНК могут быть потенциальными мишенями для лечения травмы СМ. V. Sahni и соавт. отметили, что miR-21 отрицательно регулирует реактивную гипертрофию астроцитов при повреждении СМ [9]. Но авторы пока не смогли определить мишени miR-21, которые могут повлиять на увеличение размера астроцитов. В исследовании микроРНК, связанных с апоптозом, G. Liu и соавт. показали, что увеличение экспрессии Let-7a сопровождалось увеличением экспрессии RAS (семейство генов, а также белки, которые они кодируют — так называемые малые G-белки (малые ГТФазы)) и MYC (семейство генов, которые участвуют в контроле клеточной пролиферации, дифференцировки и канцерогенеза) через 10 дней после поражения; однако через 31 день экспрессия RAS и MYC вернулась к базовым уровням, несмотря на то, что уровень Let-7a оставался повышенным [23]. С одной стороны, увеличение экспрессии микроРНК связано с повышенной экспрессией Bcl-2. С другой стороны, показано, что физические упражнения после повреждения СМ поддерживают мышечную массу в парализованных конечностях, стимулируют анатомическую и биохимическую пластичность в СМ и приводят к повышению уровня нейротрофических факторов в мышцах и в СМ [27—32]. Эти данные послужили обоснованием для изучения влияния физических упражнений на экспрессию некоторых микроРНК [23]. В этой работе G. Liu и соавт. удалось показать, что физические упражнения в течение 5 дней после повреждения СМ сопровождались значительным увеличением экспрессии miR-21, известной своим антиапоптотическим эффектом, а также значительным снижением экспрессии miR-15b [23]. Повышенная экспрессия miR-21 приводила к снижению экспрессии РНК-мессенджера PTEN (phosphatase and tensin homolog) и PDC4 (programmed cell death protein 4). Известно, что ингибирование этих белков связано с уменьшением апоптоза в раковых клетках путем ингибирования протеинкиназ B [23].

T. Sehm и соавт. изучали потенциальные цели miR-196 в отношении регенерации хвоста у аксолотля [24]. Авторы доказали, что эта микроРНК действует непосредственно на ген Pax7, подавляя уровни экспрессируемого белка, тем самым влияя на деление клеток во время регенерации и продуцируя фенотип малого хвоста. Механизм, с помощью которого этот белок продуцировал указанный фенотип, осуществлялся через петлю обратной связи с белками BMP4 и Msx1 (Msh homeobox 1), необходимыми для контроля пролиферации клеток в СМ. J. Díaz Quiroz и соавт., после определения miR-125 как важного фактора в создании среды, которая является условием регенерации, проверили эффект повышения уровня miR-125b у крыс после повреждения СМ [25]. Для этого они вводили синтетический вариант miR-125b в место поражения через 7 дней после травмы и показали снижение уровня Sema4D и образование глиальных рубцов, а также положительное влияние на функцио-нальное восстановление (улучшение передвижения у некоторых животных). В своем исследовании роли miR-133b в функциональном восстановлении после повреждения СМ Y. Yu и соавт. выявили, что эта микроРНК важна для регенерации СМ у взрослых рыбок данио, которая происходит путем снижения уровня белка RhoA (RAS homolog gene family, member A) малой ГТФазы (гуанозинтрифосфата) [26]. Изучены закономерности активации этого белка после повреждения СМ и его роль в апоптозе клеток центральной нервной системы [33]. Оба белка, происходящие из миелина, и фактор некроза опухоли непосредственно активируют Rho. Инактивация Rho C3-05 (RAS homolog gene family, member C3-05 антагонист RhoA) после повреждения СМ блокирует повышение уровня белка p75NTR (p75 neurotrophin receptor) и ингибирует апоптоз. Инактивация Rho C3-05 предотвращает апоптоз и стимулирует регенерацию. Способ, которым miR-133b вызывает это уменьшение, заключается в ее непосредственном взаимодействии с РНК-посредником RhoA. Это важный вывод, поскольку показано, что инактивация этой ГТФазы приводит к восстановлению координации между передними и задними конечностями у мышей [34].

В последнее время открываются новые характеристики дифференциально экспрессированных длнРНК при ТСМ. В частности, модуляция глиальной активации и апоптоза нейронов с помощью длнРНК стала областью интенсивного исследования.

Глия может быть активирована в течение 1 дня (активация микроглии) и сохраняться в течение месяцев или даже лет (астроглиоз) после повреждения СМ [35—37]. В модели острой контузионной ТСМ у крыс обнаружено, что уровень белка MALAT1 (metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1) значительно повышен в поврежденной области СМ [38]. MALAT1 активирует miR-199b и, следовательно, способствует выработке провоспалительных цитокинов. Ингибирование спинального MALAT1 приводило к уменьшению экспрессии микроглиального маркера Iba-1 и провоспалительных цитокинов в эпицентре контузии и к улучшению локомоторной функции задней конечности. Однако роль MALAT1 в поляризации микроглии в этом исследовании не изучалась. В другом отчете установлено, что экспрессия нкРНК lncSCIR1 постоянно снижается на 1-, 4- и 7-й день после умеренной контузионной ТСМ [39]. Количество lncSCIR1 обратно пропорционально коррелировало с экспрессией костного морфогенетического белка 7 (Bmp7) и адреномедуллина (Adm), которые способствуют формированию астроглиоза в СМ [40, 41]. Ингибирование lncSCIR1 приводило к стимулированию миграции и пролиферации культивируемых астроцитов [39]. Однако большинство функциональных исследований выполнено in vitro. Тем не менее эти исследования предоставили предварительные доказательства того, что длнРНК могут участвовать в глиогенезе после ТСМ.

Гибель нейронов является наиболее очевидным следствием повреждения спинного мозга, особенно в острой фазе. Поэтому молекулы-модуляторы апоптоза нейронов постоянно привлекают внимание исследователей. XIST (X-inactive specific transcript) идентифицировали как одну из активных длнРНК с наибольшими кратными изменениями количества молекул в модели контузионной ТСМ у мышей [42]. Ингибирование XIST оказывало значительное нейропротекторное воздействие путем активации белка (PI3K)/AKT в поврежденном СМ. Ингибирование XIST приводило к повышению экспрессии miR-494, которая затем ингибировала делецию PTEN. Снижение уровня PTEN активирует путь PI3K/AKT и защищает нейроны от апоптоза.

Роль микроРНК в повреждении СМ нуждается в дальнейшем изучении, однако появляется все больше свидетельств того, что микроРНК представляют новый класс терапевтических мишеней [43—45]. МикроРНК в центральной нервной системе снижают уровень белка посредством посттранскрипционной регуляции [16, 46]. Таким образом, ингибирование микроРНК, связанной с конкретным заболеванием, может устранить блокировку экспрессии нужного белка. Напротив, введение миметика микроРНК может стимулировать популяцию эндогенной микроРНК, которая подавляет нужный ген [47]. Некоторые модифицированные РНК могут быть использованы в качестве предварительно обработанных микроРНК или в качестве олигонуклеотидов против микроРНК [48]. Олигонуклеотиды против микроРНК являются комплементарными нуклеотидами с обратной цепью. Их стабильность и специфика улучшены химическими модификациями. Показано, что олигонуклеотиды с 2’-O-метил-модификацией являются эффективными ингибиторами нескольких клеточных линий и культивируемых нейронов [49—51]. МикроРНК имитируют небольшие, как правило, двухцепочечные, химически модифицированные олигонуклеотиды, которые можно использовать для подавления специфических белков-мишеней. Двухцепочечная структура необходима для эффективного объединения с RISC (RNA-induced silencing complex). Одна из цепей представляет собой зрелую микроРНК, а комплементарная цепочка образует комплекс с последовательностью зрелой микроРНК [51]. Хотя эти имитаторы часто используются в исследованиях сельскохозяйственных культур, пока нет данных, доказывающих их эффективность [52]. По-прежнему существует много проблем для использования микроРНК в качестве терапевтических мишеней, а именно сложное введение, возможные воздействия на другие генетические системы и обеспечение их безопасности. Однако стратегия манипулирования микроРНК in vivo для регуляции патологических процессов становится возможным терапевтическим подходом. Лучшее понимание их биосинтеза и функции, несомненно, будет способствовать развитию терапии с помощью микроРНК.

Травма спинного мозга является причиной инвалидности работоспособного населения и до настоящего времени остается серьезной клинической проблемой, для решения которой требуются интенсивные исследования. Начаты исследования некодирующих РНК при этой патологии, которые показали их важность в контроле воспаления, ацидоза, апоптоза, пролиферации и регенерации. Необходимо продолжить изучение некодирующих РНК при поражении спинного мозга, а также выявление генов-мишеней и механизмов передачи сигналов, участвующих в их неврологических эффектах. Благодаря взаимодействию с сетью кодирующих генов, некодирующие РНК участвуют в различных клеточных и тканевых изменениях на всех стадиях травмы спинного мозга. Таким образом, дерегуляция некодирующих РНК представляет новое измерение в воздействии на молекулярные механизмы при травмах спинного мозга. При этом конечной целью является разработка эффективных и безопасных терапевтических и диагностических стратегий для пациентов с повреждением спинного мозга.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — О.Б., Н.К.

Сбор и обработка материала — Ш.А., А.А., А.Б.

Анализ данных — Ш.А., А.А., А.Б.

Написание текста — И.Г.

Редактирование — О.Б., Н.К.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.