Введение
Ишемическая болезнь сердца (ИБС) является многофакторной патологией, развитие и прогрессирование которой определяется взаимодействием факторов внешней среды с эпигенетическими и генетическими факторами [1, 2]. МикроРНК представляют собой малые некодирующие тканесцецифичные РНК, которые являются важнейшими регуляторами экспрессии генов на транскрипционном и посттранскрипционном уровнях путем РНК-интерференции. МикроРНК составляют более 1% от всего генома, и при этом микроРНК регулируют экспрессию примерно трети всех генов человека на посттранскрипционном уровне [3].
МикроРНК играют важную роль в нормальной физиологии организма, облегчая экспрессию генов в сложных тканевых системах, но имеют значение и в развитии патологических состояний, включая дисфункцию эндотелия, формирование с последующим разрывом атеросклеротической бляшки, гипертрофию миокарда, фиброз и аритмогенез [1, 4]. Некоторые микроРНК рассматривают как возможные диагностические маркеры ИБС [5, 6], связанные с различными патогенетическими механизмами формирования и прогрессирования атеросклеротической бляшки.
Доказано, что микроРНК вовлечены в каждую стадию атерогенеза. В связи с этим активно обсуждается вопрос, может ли определение содержания циркулирующих микроРНК в сыворотке и плазме крови улучшать алгоритмы диагностики, оценки эффективности терапии и прогнозирования тяжести течения ИБС. Малоизученными в этом вопросе являются микроРНК-21, микроРНК-125a, микроРНК-125b и микроРНК-214, в связи с этим целью исследования является оценка уровней экспрессии данных микроРНК в плазме крови больных ИБС и выявление особенностей клинического течения заболевания.
Материал и методы
Настоящее исследование выполнено на клинической базе кафедры терапии факультетской с курсом эндокринологии и кардиологии с клиникой имени академика Г.Ф. Ланга. Уровни экспрессии микроРНК-21, микроРНК-125a, микроРНК-125b и микроРНК-214 в плазме крови определены у 129 больных (73 (56,6%) мужчин и 56 (43,4%) женщин) в возрасте 63,17±8,57 года с диагнозом ИБС, подтвержденным результатами коронароангиографии, длительно проживающих в Санкт-Петербурге, подписавших информированное согласие.
Критериями исключения являлись сердечная недостаточность IV функционального класса, неконтролируемая артериальная гипертензия, онкологические и онкогематологические заболевания, воспалительные заболевания в фазе обострения, перенесенные в последние 2 месяца инфекционные или вирусные заболевания, вирусный гепатит, системные васкулиты, системные заболевания соединительной ткани, патология щитовидной железы, клинически значимая патология печени и почек, тяжелые хронические осложнения сахарного диабета, сопутствующие заболевания в фазе декомпенсации, отрицательно влияющие на прогноз.
Группу сравнения составили 45 человек (25 (55,6%) мужчин и 20 (44,4% женщин) сопоставимого возраста (62,09±8,79 года, p>0,05)), без ИБС. ИБС исключалась выполнением нагрузочных тестов, у ряда больных выполнялась коронароангиография (n=21).
В группе больных при оценке традиционных факторов риска ИБС установлены гипертоническая болезнь у 122 (94,6%) больных ИБС, сахарный диабет 2-го типа у 22 (17,1%) обследованных, ожирение у 45 (34,9%) пациентов, семейный анамнез ИБС выявлен у 14 больных (10,9); курили 68 человек (52,7%). У большинства больных ИБС (74 (57,4%)) в анамнезе имелись сведения о перенесенном инфаркте миокарда (ИМ).
В группе сравнения курили 26 (57,8%) человек, отягощенная по ИБС наследственность отмечалась у 5 (11,1%) обследованных, гипертоническая болезнь — у 28 (62,2%) человек, сахарный диабет — у 5 (11,1%) обследованных, ожирение — у 13 (28,9%) человек. Гипертоническая болезнь и ожирение чаще встречались у больных ИБС, чем в группе сравнения (p1, 2<0,05).
После выделения тотальной РНК из плазмы крови обследованных пациентов, уровни экспрессии микроРНК-125a, микроРНК-125b, микроРНК-21 и микроРНК-214 плазмы крови определяли методом обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией в режиме реального времени с помощью набора реагентов НПК «Синтол» (Россия) и микроРНК-специфических праймеров на амплификаторе DTlite. Уровень исследуемых микроРНК вычисляли в соответствии со стандартной процедурой 2-ΔCt.
Статистический анализ полученных данных выполняли средствами системы STATISTICA for Windows 10.0 (StatSoft Inc.) и SPSS 11.5 for Windows (SPSS Inc.). Данные с нормальным распределением, которое проверялось с помощью тестов Колмогорова–Смирнова, представлены с использованием среднего значения ± стандартного отклонения. Данные, которые не подчинялись нормальному распределению, представлены в виде медианы (Me) с нижним и верхним квартилями (Q25; Q75). Для сравнения количественных переменных без нормального распределения использован непараметрический критерий Манна–Уитни. За критерий статистической достоверности полученных результатов принимали общепринятую величину p<0,05 [7]. Прогностическую значимость для факторов, ухудшающих прогноз течения ИБС, определяли с помощью метода построения «деревьев классификации» (Classification Trees). Отношение рисков (ОР) вычисляли по стандартным формулам доказательной медицины.
Результаты
Уровни экспрессии микроРНК-21, микроРНК-125a, микроРНК-125b и микроРНК-214 в плазме крови были выше у больных ИБС, чем в группе сравнения (рисунок).
Уровни экспрессии микроРНК-21, микроРНК-125a, микроРНК-125b и микроРНК-214 в плазме крови больных ишемической болезнью сердца и в группе сравнения.
УЕЭ — условные единицы экспрессии.
При использовании метода классификационных деревьев были рассчитаны пороговые значения уровня экспрессии исследуемых микроРНК в плазме крови, при котором значительно увеличивается риск ИБС. Так, при уровне экспрессии микроРНК-21 выше, чем 16,43 УЕЭ, риск ИБС увеличивается в 3,49 раза (OP=3,49 (95% ДИ 1,70÷7,17), p<0,001), при уровне экспрессии микроРНК-125a выше, чем 7,21 УЕЭ — в 5,18 раза (OP=5,18 (95% ДИ 2,29÷11,69), p<0,001), при уровне экспрессии микроРНК-125b более, чем 3,49 УЕЭ — в 4,03 раза (OP=4,03 (95% ДИ 1,86÷8,72), p=0,0001), при уровне экспрессии микроРНК-214 более, чем 2,47 УЕЭ — в 3,99 раза (OP=3,99 (95% ДИ 1,91÷8,37), p<0,001).
У курящих больных ИБС уровень экспрессии микроРНК-21 был выше, чем у некурящих (21,90 (7,97; 31,97) УЕЭ и 6,06 (1,15; 27,90) УЕЭ соответственно; p<0,05). Уровень экспрессии микроРНК-125a был выше у курящих пациентов, чем у некурящих (59,85 (21,69; 73,06) УЕЭ и 32,00 (4,59; 67,85) УЕЭ соответственно; p<0,05). При этом уровни микроРНК-125b и микроРНК-214 не различались у курящих и некурящих пациентов (p>0,05). Уровни экспрессии изучаемых микроРНК не различались у больных ИБС с сахарным диабетом 2-го типа и без сахарного диабета 2-го типа (p>0,05).
В соответствие с рекомендациями Российского и Европейского крдиологического общества [8] выделена подгруппа пациентов с ранним развитием ИБС, включающая мужчин с дебютом ИБС в возрасте до 55 лет (n=37) и женщин с началом заболевания в возрасте до 65 лет (n=32), и без раннего развития ИБС (мужчины с дебютом ИБС в возрасте 55 лет и старше (n=36) и женщины с началом заболевания в возрасте 65 лет и старше (n=24)). В группе больных с ранним развитием ИБС (n=69) средний возраст на момент включения был 56,84±9,30 лет, без раннего дебюта ИБС (n=60) — 66,77±6,00 лет.
Уровни экспрессии микроРНК-21 и микроРНК-214 в плазме крови были выше у больных с ранним развитием ИБС, чем у пациентов с дебютом ИБС в более старшем возрасте (p<0,05) (табл. 1). Уровни экспрессии микроРНК-125a и микроРНК-125b в плазме крови не различались у пациентов с развитием ИБС в различном возрасте (см. табл. 1).
Таблица 1. Уровень экспрессии микроРНК-21, микроРНК-125а, микроРНК-125b и микроРНК-214 в плазме крови больных ишемической болезнью сердца с началом заболевания в различном возрасте
| Группа | Характеристики | МикроРНК-21, УЕЭ | МикроРНК-125а, УЕЭ | МикроРНК-125b, УЕЭ | МикроРНК-214, УЕЭ |
| Больные с ранним развитием ИБС, n=64 | M±s.d. | 21,27±13,61 | 54,57±45,71 | 27,20±23,76 | 2,81±2,02 |
| min÷max | 0,12÷45,85 | 0,11÷294,07 | 0,10÷137,19 | 0,25÷13,00 | |
| Me (LQ; UQ) | 21,01 (8,76;34,38) | 59,85 (9,85;73,06) | 26,90 (8,00;36,61) | 2,82 (1,62;3,03) | |
| Больные без раннего развития ИБС, n=65 | M±s.d. | 14,90±14,74 | 48,33±51,64 | 22,84±36,95 | 2,40±2,44 |
| min÷max | 0,09÷45,85 | 0.06÷294,07 | 0,03÷274,37 | 0,16÷13,93 | |
| Me (LQ; UQ) | 7,97 (1,23;27,86) | 43,98 (6,96;68,07) | 14,56 (1,41;36,61) | 2,41 (0,81;2,98) | |
| p | 0,01 | 0,20 | 0,06 | 0,045 | |
Примечание. — р — доверительный уровень вероятности критерия Хи-квадрат при сравнении уровней экспрессии микроРНК в группах больных ИБС с дебютом заболевания в различном возрасте; M — среднее значение; s.d. — стандартное отклонение; min — минимальное значение; max — максимальное значение; Me — медиана; LQ — нижний квартиль; UQ — верхний квартиль; УЕЭ — условные единицы экспрессии.
Уровни экспрессии микроРНК-21, микроРНК-125a, микроРНК-125b и микроРНК-214 в плазме крови были выше у больных ИБС с перенесенным ИМ, чем у пациентов без перенесенного ИМ (p<0,05) (табл. 2).
Таблица 2. Уровни экспрессии
| Группа | Характеристика | МикроРНК-21, УЕЭ | МикроРНК-125а, УЕЭ | МикроРНК-125b, УЕЭ | МикроРНК-214, УЕЭ |
| Больные без перенесенного ИМ, n=57 | M±s.d. | 11,02±12,74 | 39,32±50,76 | 20,99±41,29 | 2,06±2,18 |
| min÷max | 0,09÷45,85 | 0,06÷294,07 | 0,03÷274,37 | 0,20÷13,00 | |
| Me (LQ; UQ) | 3,73 (1,00;20,09) | 18,72 (4,51;68,07) | 6,96 (0,93;29,60) | 1,62 (0,54;2,82) | |
| Больные с перенесенным ИМ, n=72 | M±s.d. | 23,63±13,39 | 60,79±45,24 | 28,17±19,36 | 3,03±2,21 |
| min÷max | 0,12÷45,85 | 0,11÷294,07 | 0,10÷103,97 | 0,16÷13,93 | |
| Me (LQ; UQ) | 25,90 (14,33;34,38) | 62,48 (37,23;73,06) | 29,60 (11,74;37,60) | 2,93 (2,48;3,06) | |
| p | 0,0001 | 0,003 | 0,002 | 0,001 | |
Примечание. — р — доверительный уровень вероятности критерия Хи-квадрат при сравнении уровней микроРНК экспрессии в группах больных ИБС с перенесенным инфарктом миокарда и без него; ИМ — инфаркт миокарда; M — среднее значение; s.d. — стандартное отклонение; min — минимальное значение; max — максимальное значение; Me — медиана; LQ — нижний квартиль; UQ — верхний квартиль; УЕЭ — условные единицы экспрессии.
Рассчитаны пороговые значения уровня экспрессии исследуемых микроРНК в плазме крови, при которых увеличивается риск развития ИМ у больных ИБС. Так при уровне экспрессии микроРНК-21 выше, чем 4,01 УЕЭ, риск развития ИМ у больных ИБС увеличивается в 7,39 раза (OP=7,39 (95% ДИ 3,27÷16,70), p<0,001), при уровне экспрессии микроРНК-125a выше, чем 4,11 УЕЭ — в 4,65 раза (OP=4,65 (95% ДИ 2,19÷9,87), p=0,003), при уровне экспрессии микроРНК-125b более, чем 19,84 УЕЭ — в 4,59 раза (OP=4,59 (95% ДИ 2,14÷9,85), p=0,0002), при уровне экспрессии микроРНК-214 более, чем 1,11 УЕЭ — в 9,75 раза (OP=9,75 (95% ДИ 3,41÷27,84), p<0,001).
Уровни экспрессии микроРНК-21, микроРНК-125a и микроРНК-125b в плазме крови были выше у больных ИБС со стенокардией различных функциональных классов (ФК), чем у больных без клинических проявлений стенокардии напряжения (p<0,05) (табл. 3), но при этом не различалась у пациентов с различными ФК стенокардии напряжения (p>0,05).
Таблица 3. Уровни экспрессии микроРНК-21, микроРНК-125а, микроРНК-125b и микроРНК-214 в плазме крови больных ишемической болезнью сердца без клинических проявлений стенокардии и со стенокардией напряжения
| Группа | Характеристика | МикроРНК-21, УЕЭ | МикроРНК-125а, УЕЭ | МикроРНК-125b, УЕЭ | МикроРНК-214, УЕЭ |
| Больные без стенокардии, n=6 | M±s.d. | 1,50±2,06 | 5,56±8,05 | 3,89±6,64 | 1,73±2,04 |
| min÷max | 0,13÷4,92 | 0,07÷21,11 | 0,20÷17,15 | 0,18÷5,66 | |
| Me (LQ; UQ) | 0,28 (0,19;3,23) | 2,48 (0,23;6,96) | 0,75 (0,50;4,00) | 1,28 (0,23;1,74) | |
| Больные со стенокардией, n=123 | M±s.d. | 18,87±14,35 | 53,65±48,78 | 26,06±31,50 | 2,65±2,25 |
| min÷max | 0,09÷45,85 | 0,06÷294,07 | 0,03÷274,37 | 0,16÷13,93 | |
| Me (LQ; UQ) | 19,7 (3,53;31,94) | 59,85 (9,85;72,70) | 22,99 (5,66;36,61) | 2,69 (1,23;3,03) | |
| p1,2 | 0,0005 | 0,002 | 0,003 | 0,09 | |
Примечание. — р — доверительный уровень вероятности критерия Хи-квадрат при сравнении уровней экспрессии микроРНК в группах больных ИБС без клинических проявлений стенокардии и со стенокардией напряжения; ФК — функциональный класс; M — среднее значение; s.d. — стандартное отклонение; min — минимальное значение; max — максимальное значение; Me — медиана; LQ — нижний квартиль; UQ — верхний квартиль; УЕЭ — условные единицы экспрессии.
Уровни экспрессии микроРНК-214 в плазме крови не различались у больных ИБС без клинических проявлений стенокардии напряжения и со стенокардией напряжения различных ФК (p>0,05) (см. табл. 3).
Обсуждение
Ишемическая болезнь сердца до сих пор занимает лидирующую позицию в структуре заболеваемости и смертности населения во всем мире, и РФ [9]. ИМ является наиболее грозной и зачастую летальной формой ИБС и может проявляться в том числе внезапной сердечной смертью. Результаты исследований последних лет показали, что некоторые микроРНК рассматривают как возможные диагностические маркеры ИБС, связанные с различными патогенетическими механизмами формирования и прогрессирования атеросклеротической бляшки [5, 6]. В связи с этим в нашей работе были определены уровни экспрессии микроРНК-21, микроРНК-125a, микроРНК-125b и микроРНК-214 у больных ИБС и в группе сравнения и методом классификационных деревьев определены пороговые значения уровня экспрессии исследуемых микроРНК в плазме крови, при которых увеличивается риск ИБС и ИМ. Нами установлено, что уровни экспрессии микроРНК-21, микроРНК-125a, микроРНК-125b и микроРНК-214 в плазме крови были выше у больных ИБС, чем в группе сравнения, и у больных ИБС с перенесенным ИМ, чем у пациентов без перенесенного ИМ; рассчитаны пороговые значения уровня экспрессии исследуемых микроРНК в плазме крови, при которых увеличивается риск развития ИМ у больных ИБС. Подобные результаты получены M Jaguszewski et al. (2014). Авторами было установлено, что уровень экспрессии микроРНК-125a был выше у больных с острым коронарным синдромом (ОКС), чем у здоровых людей [10].
Результаты исследований, посвященных роли микроРНК-125b в патогенезе ИБС, противоречивы. Так, GM Gager et al. (2022) установили, что у больных ОКС с многососудистым поражением коронарного русла и высокой летальностью отмечались повышенные уровни экспрессии микроРНК-125b [11]. По данным, полученным в нашем исследовании, уровни экспрессии микроРНК-125b в плазме крови были выше у больных ИБС, чем в группе сравнения, и выше у больных, перенесших ИМ. Также, по нашим данным, уровни экспрессии микроРНК-21, микроРНК-125a и микроРНК-125b в плазме крови были выше у больных ИБС со стенокардией различных ФК, чем у больных без клинических проявлений стенокардии напряжения. Это объясняется тем, что микроРНК участвуют в развитии атеросклероза, дестабилизации и разрыве атеросклеротической бляшки, дисфункции эндотелия, формировании гипертрофии миокарда, фиброза и аритмогенеза [1, 4]. Также установлено, что микроРНК опосредованно влияют на липидный обмен. Так, M Hueso et al. (2021) установили, что микроРНК-125b способна подавлять обратный транспорт холестерина из макрофагов, опосредованный липопротеинами высокой плотности, как у человека, так и в эксперименте на мышах [12].
S Vigili de Kreutzenberg et al. (2022) в группе больных сахарным диабетом описали активацию экспрессии микроРНК-125b вследствие гипергликемии, что сопровождалось кальцификацией коронарных артерий [13]. Однако в нашей работе не выявлены различия уровней экспрессии микроРНК-125b у больных ИБС с сахарным диабетом и без сахарного диабета.
В других исследованиях, наоборот, показан атеропротективный эффект микроРНК-125b. F Lv et al. (2021)установили, что экспрессия микроРНК-125b была ниже у больных ИБС, чем у здоровых людей [14]. Y Zhu et al. (2021) и Z Saadatian et al. (2023) показали, что уровень экспрессии микроРНК-125b был ниже у больных с рестенозом стента, чем у обследованных без рестеноза [15, 16]. Более того, в экспериментальном исследовании «ишемия — реперфузия» показана способность микроРНК-125b оказывать значимый цитопротективный эффект [17].
Поражение коронарных артерий атеросклеротическими бляшками является основой патогенеза ИБС, при этом многие аспекты патогенеза коронарного атеросклероза в настоящее время остаются противоречивыми и не до конца изученными [18, 19]. Известно, что микроРНК-21 экспрессируется в эндотелиоцитах и регулирует их функции. Результаты исследований, посвященных поиску роли данной микроРНК в атерогенезе, противоречивы. TS Lisse et al. (2013) установили, что при увеличении экспрессии микроРНК-21 в эндотелиоцитах снижается их миграция и пролиферация, что может свидетельствовать об антиангиогенной функции данной микроРНК. Экспрессия микроРНК-21 существенно повышена в атеросклеротических бляшках и макрофагах [20]. По нашим данным, уровень экспрессии микроРНК-21 был выше у больных ИБС, чем в группе сравнения. Вероятно, повышенная экспрессия микроРНК-21 может указывать на прогрессирующий рост атеросклеротических бляшек.
Считается, что сердечно-сосудистые заболевания остаются основной причиной неблагоприятных исходов ИБС у молодых людей, в отличие от снижения количества неблагоприятных исходов в других возрастных группах [21, 22]. Несмотря на то что ИМ в основном встречается у пациентов старше 45 лет, в последние годы его частота в молодом возрасте растет [8, 9]. С учетом направленности на персонализированный подход в диагностике и лечении заболеваний у больных ИБС, особенно у пациентов молодого возраста, кроме традиционных факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний важную роль могут играть эпигенетические факторы, поэтому обследованные нами больные ИБС были разделены на две группы: с ранним дебютом заболевания и без раннего начала ИБС. По нашим данным, уровни микроРНК-21 и микроРНК-214 в плазме крови были выше у больных с ранним развитием ИБС, чем у пациентов без раннего развития ИБС. При использовании метода классификационных деревьев нами рассчитаны пороговые значения уровня экспрессии микроРНК-21 и микроРНК-214 в плазме крови, при которых увеличивается риск раннего дебюта ИБС. По литературным данным, микроРНК-214 связана с развитием ИБС, гипертрофии сердца, легочной артериальной гипертензии и сердечной недостаточности. Воздействуя на различные патогенетические звенья метаболизма миокарда, данная микроРНК потенциально может оказывать как протективное, так и профиброгенное воздействие на миокард, а также способствовать гипертрофии миокарда [23].
A Gopalakrishnan et al. (2020) установили, что среди больных ИБС молодого возраста преобладали мужчины, большая часть больных курила, у 88,3% больных была выявлена дислипидемия, 41% пациентов не соблюдали режим приема лекарств [24]. По результатам проведенного нами исследования, у курящих больных ИБС уровни микроРНК-21 и микроРНК-125a были выше, чем у некурящих.
Таким образом, в последние годы активно исследуется роль микроРНК в развитии ИБС и ее осложнений. МикроРНК-125a, микроРНК-125b, микроРНК-214 и микроРНК-21 могут быть перспективными для изучения предикторами ИБС с развитием ИМ, в том числе и у пациентов молодого возраста.
Выводы
Уровни экспрессии микроРНК-21, микроРНК-125a, микроРНК-125b и микроРНК-214 выше у больных ИБС, чем в группе сравнения, у больных ИБС с перенесенным инфарктом миокарда, чем у пациентов без перенесенного инфаркта миокарда и у курящих пациентов, чем у некурящих.
У больных ИБС со стенокардией различных функциональных классов уровни экспрессии микроРНК-21, микроРНК-125a и микроРНК-125b выше, чем у больных без клинических проявлений стенокардии напряжения.
Уровни микроРНК-21 и микроРНК-214 выше у больных с ранним развитием ИБС, чем у пациентов без раннего развития ИБС.
Установлены пороговые значения экспрессии изученных микроРНК, при которых возрастает риск ИБС и ИМ.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов:
Ионова Ж.И., Колодина Д.А. — существенный вклад в разработку концепции или дизайна работы; или в получение, анализ или интерпретацию данных для работы;
Беркович О.А., Беляева О.Д., Зарайский М.И. — участие в написании или редактировании статьи с внесением существенного интеллектуального вклада; одобрение финальной версии статьи, подлежащей публикации;
Все авторы — согласие нести ответственность за все аспекты работы, а также гарантия того, что все вопросы по достоверности и надежности любой части работы надлежащим образом проанализированы и решены.