Павлова Г.В.

ФГБУ "Институт биологии гена" РАН

Баклаушев В.П.

Отдел фундаментальной и прикладной нейробиологии ФГБУ "Государственный научный центр социальной и судебной психиатрии им. В.П. Сербского"; Кафедра медицинских нанобиотехнологий Российского государственного медицинского университета им. Н.И. Пирогова

Иванова М.А.

ФГБУ «Центральный научно-исследовательский институт организации и информатизации здравоохранения» Минздрава России, Москва, Россия

Горяйнов С.А.

НИИ нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко РАМН, Москва

Рыбалкина Е.Ю.

ФГБНУ "Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина", Москва

Копылов А.М.

Химический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Чехонин В.П.

Отдел фундаментальной и прикладной нейробиологии ФГБУ "Государственный научный центр социальной и судебной психиатрии им. В.П. Сербского"; Кафедра медицинских нанобиотехнологий Российского государственного медицинского университета им. Н.И. Пирогова

Потапов А.А.

НИИ нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко РАМН, Москва

Коновалов А.Н.

ФГАУ «Научно-исследовательскйй институт нейрохирургии имени академика Н.Н. Бурденко», Москва, Российская Федерация

Современные молекулярные подходы к диагностике и лечению низкодифференцированных глиом

Журнал: Журнал «Вопросы нейрохирургии» имени Н.Н. Бурденко. 2014;78(6): 85-100

Просмотров : 9

Загрузок :

Как цитировать

Павлова Г. В., Баклаушев В. П., Иванова М. А., Горяйнов С. А., Рыбалкина Е. Ю., Копылов А. М., Чехонин В. П., Потапов А. А., Коновалов А. Н. Современные молекулярные подходы к диагностике и лечению низкодифференцированных глиом. Журнал «Вопросы нейрохирургии» имени Н.Н. Бурденко. 2014;78(6):85-100.

Авторы:

Павлова Г.В.

ФГБУ "Институт биологии гена" РАН

Все авторы (9)

a:2:{s:4:"TEXT";s:111081:"

Первичные опухоли центральной нервной системы (ЦНС) составляют около 2% всех опухолей и занимают четвертое место в структуре онкологической смертности [1]. Около 60% выявляемых опухолей головного мозга - глиомы, из них до 50-70% имеют морфологические признаки, позволяющие отнести их к глиомам III-IV степени злокачественности. Мультиформная глиобластома (МГ) является наиболее часто встречающейся опухолью ЦНС [2].

Несмотря на все современные успехи нейрохирургии, развитие интраоперационной навигации, химио- и лучевой терапии, лечение первичных злокачественных опухолей головного мозга продолжает оставаться недостаточно эффективным. Средняя продолжительность жизни таких пациентов после операции на фоне химио- и лучевой терапии составляет для МГ и анапластической астроцитомы 14 и 25 мес соответственно, а 5-летняя выживаемость больных с МГ не превышает 10% [3].

С точки зрения молекулярной биологии МГ представляет собой постоянно эволюционирующую, поликлональную, генетически и фенотипически гетерогенную популяцию клеток с множественными генными и геномными изменениями, дисрегулированными внутриклеточными сигнальными путями, пластично реорганизующуюся в процессе терапии. Эти особенности МГ делают малоэффективными существующие методы лечения МГ, включая самые современные цитотоксические химиопрепараты и антиангиогенную терапию с помощью моноклональных антител и низкомолекулярных ингибиторов. В связи с этим поиск новых эффективных методов противоопухолевой терапии остается крайне актуальным.

Разработка инновационных молекулярно-биологических подходов к терапии МГ идет в нескольких направлениях. В частности, исследуются возможности создания таргетных противоопухолевых препаратов на основе наноконтейнеров, снабженных «направляющими» моноклональными антителами [4], обладающих pH-чувствительностью или каким-либо другим свойством, увеличивающим тропность к очагу опухоли [5]. В рамках этого же направления активно разрабатываются новые способы лечения, основанные на доставке и экспрессии терапевтических генов, которые могут привести к гибели опухолевых клеток, ингибировать сосудообразование в опухоли или активировать эффективный иммунный ответ против глиобластомы. Иммуностимулирующая терапия МГ и создание противоопухолевых вакцин как ДНК, так и клеточных, составляет отдельное направление исследований. Большие надежды в этой связи возлагают на применение аутологичных дендритных клеток. Сенсибилизация этих клеток антигенами опухолевой ткани позволяет существенно повысить противоопухолевый клеточный иммунный ответ [6].

Еще одним инновационным подходом к терапии низкодифференцированных глиом является применение онколитических вирусов (ОВ). Преклинические исследования на культурах опухолевых клеток и на животных с экспериментальными опухолями человека (включая экспериментальные глиомы) демонстрируют очень высокий терапевтический потенциал ОВ, превосходящий возможности всех существующих клинико-экспериментальных методов терапии. Малая вероятность формирования внутренней резистентности в опухолевых клетках к ОВ и отсутствие значительных побочных эффектов даже при высоких дозах системного введения делают их особо привлекательными для генно-инженерной разработки улучшенных вариантов с высокой терапевтической активностью [7, 8].

Цель настоящего обзора - анализ наиболее перспективных инновационных подходов, которые в ближайшем будущем могут быть также транслированы в нейроонкологическую практику. В обзоре проведен обобщенный анализ известных на сегодняшний день мембранных маркеров глиомы человека, который может послужить основой для разработки таргетной терапии данного заболевания.

Диагностика глиом

Общая ежегодная заболеваемость глиомами составляет 5-6 на 100 000 населения [2, 3]. Анапластические астроцитомы, анапластические олигодендроглиомы и олигоастроцитомы (Grade III по классификации ВОЗ), а также глиобластомы (Grade IV по классификации ВОЗ) относятся к злокачественным глиомам, тогда как глиомы I и II степени по классификации ВОЗ считаются доброкачественными и характеризуются благоприятным прогнозом [9]. Гистологический диагноз является одним из факторов, определяющим тактику послеоперационного лечения [11]. Глиомы Grade III, в отличие от опухолей I-II степени злокачественности, характеризуются митотической активностью и полиморфизмом ядер опухолевых клеток. Для определения опухолей IV степени (глиобластомы) важными критериями являются повышенная сосудистая пролиферация, наличие микрокровоизлияний и очагов некроза [9].

Для подтверждения гистологического типа глиом в настоящее время применяется иммуногистохимический анализ с помощью антител к GFAP (маркер высокодифференцированных астроцитом), виментину, белку S-100b, MBP (маркеры олигодендроглиоцитов), белку-супрессору p53 и др. Иммуногистохимическими признаками злокачественности глиом являются низкий уровень перечисленных выше белков и высокое содержание в опухолевых клетках таких белков, как Ki-67 (ядерный белок, индуктор пролиферации), CD34 (маркер активации эндотелия), цитокератины и некоторые другие белки, ассоциированные с повышенной пролиферативной активностью и ингибированием апоптоза [11].

Большое количество исследований посвящено молекулярно-генетической диагностике глиом и поиску генетических маркеров, обеспечивающих долговременное выживание пациентов со злокачественными глиомами. Последние данные свидетельствуют о возможности классифицировать глиомы по экспрессии кластера маркерных генов. Опираясь на подобную классификацию, возможно корректировать методы лечения, приводящие к повышению выживаемости пациентов. Исследователи показали, что в подобной классификации можно использовать около 44 генов, отвечающих за пролиферацию, миграцию, стимуляцию образования сосудов и др. Таким образом, предложено разделение глиом на четыре группы в зависимости от экспрессии генетических маркеров, при этом отмечено, что выживаемость пациентов коррелировала с экспрессией определенных генов. Наибольшая выживаемость отмечалась у пациентов с глиомами, экспрессирующими факторы, отвечающие за дифференцировочный потенциал [12].

Другой пример генетического прогнозирования выживаемости пациента - определение метилированного состояния MGMT промотора. MGMT (O6-метилгуанин-ДНК метилтрансфераза) - фермент системы репарации ДНК, препятствующий генотоксическим эффектам алкилирующих агентов, таких как темозоломид. Метилирование промотора MGMT ведет к угнетению экспрессии гена MGMT и связано с наиболее благоприятным исходом для пациентов с глиобластомой, лечившихся темозоломидом [13].

В настоящее время по меньшей мере три молекулярных маркера считаются важными при диагностике злокачественных глиом [14]: 1p/19q коделеция, метилирование промотора МGМТ и мутация изоцитратдегидрогеназы-1/2 (ИДГ-1/2). Совместная потеря участков хромосом 1 и 19, вероятно, вызывается нестабильными транслокациями и четко связана с олигодендроглиальной морфологией глиом [15]. 1p/19q коделеция выявляется флуоресцентной in situ гибридизацией или анализами на основе минисателлитной полимеразной цепной реакции (ПЦР) для детекции аллельных потерь и дает более благоприятный прогноз. Метилирование промотора МGМТ оценивается специфической к метилированию ПЦР промоторного участка [16]. Есть предположения, что в результате него происходит потеря МGМТ, фермента, противостоящего повреждениям ДНК, вызванным алкилирующими агентами. Этот молекулярный маркер не распределен дифференциально среди различных типов глиомы, но остается потенциальным маркером для предсказания успешной химиотерапии [17]. Мутации генов ИДГ, в основном ИДГ-1, могут быть выявлены ПЦР и направленным секвенированием и очень распространены в глиомах II и III степени, но редки в глиобластомах [18, 19]. Это свидетельствует о том, что многие глиобластомы - биологически далекие опухоли, которые не связаны с типичными предшественниками ранних степеней. Патогенная роль мутаций ИДГ в глиомагенезе остается спорной, но может включать появление новых, альтернативных функций мутантных ИДГ ферментов, которые производят онкометаболит alpha-гидроксиглутарат. Мутации ИДГ прогностически благоприятны и почти никогда не появляются у пожилых пациентов со злокачественными глиомами, что частично объясняет отрицательное прогностическое влияние возраста этих пациентов [19]. Иммуногистохимический анализ с помощью специфических антител к мутантной ИДГR132H может быть диагностически ценным, так как эти мутации распространены в глиомах II и III степени, но отсутствуют, например, в пилоцистарных астроцитомах или эпендимомах [18].

Весьма перспективными молекулярными маркерами глиом могут служить микроРНК. В частности, показано, что экспрессия одних микроРНК, например miR-650 [20], повышается в глиомах, тогда как других, например miR-203 [21], снижается. Данные изменения экспрессии коррелируют с неблагоприятным прогнозом заболевания. Предполагается, что анализ паттерна микроРНК может дать ценную дополнительную информацию не только о прогнозе, но и о степени злокачественности, а также резистентности к химио- и радиотерапии [22].

Принципы современного лечения глиом головного мозга

Лечение злокачественных глиом в настоящий момент комбинированное и включает микрохирургическое удаление опухоли, лучевую и химиотерапию [1]. Основной задачей хирургического лечения внутримозговых опухолей является удаление опухолевой ткани (циторедукция) с минимальным повреждением мозга и установление гистологического диагноза. Максимальная радикальность оперативного вмешательства с учетом физиологической дозволенности приводит к одномоментной элиминации большого количества жизнеспособных опухолевых клеток, в том числе и резистентных к терапии, уменьшает внутричерепную гипертензию и может способствовать улучшению нарушенных неврологических функций [23]. Полное удаление злокачественных внутримозговых опухолей практически невозможно в силу инфильтративного характера роста и поражения функционально важных зон мозга, что может привести к выраженному неврологическому дефициту после операции.

При проведении всех видов лечения у пациентов с глиобластомами частота 5-летней выживаемости, к сожалению, не превышает 10% [3]. Прогноз в наибольшей степени зависит от патоморфологической характеристики опухоли и возраста пациента [24], в меньшей степени от радикальности оперативного вмешательства [25].

Генотерапия

Генно-терапевтические подходы уже частично перешли от преклинических исследований к I и II фазе клинических испытаний [36, 41]. Общая цель генной терапии состоит в достижении селективной экспрессии генотерапевтической конструкции в опухолевых клетках для их элиминации и стойкой защиты от рецидива.

Один из вариантов генотерапии - метод антиангиогенной терапии разработан для предотвращения сосудо­образования в опухолях, необходимого для их роста и метастазирования [26]. В иммуностимулирующих подходах стремятся использовать собственную иммунную систему пациента для направленного разрушения опухоли [27]. Также, предположительно, при этом подходе может быть активирована иммунологическая память для защиты от рецидива заболевания. Онколитические вирусы провоцируют лизис опухолевой клетки и распространение вируса после инфекции, специфично заражая опухолевые клетки с генетическими или метаболическими изменениями [28, 29]. Стратегии с использованием направленных токсинов используют рецепторы, специфически экспрессирующиеся на глиомных клетках, для направленного уничтожения этих клеток [30, 31].

Опухолевые супрессоры, онкогены и другие векторы с репликационным компонентом

Все опухолевые клетки изначально произошли из нормальных предшественников [33]. Однако опухолевые клетки содержат «вредные» мутации в ключевых генах, опухолевых супрессорах или онкогенах, которые регулируют пролиферацию и/или апоптоз. Общепризнано, что канцерогенез является многоэтапным процессом, для которого необходимы мутации различных генов в ДНК отдельных клеток, таких как гены, которые регулируют клеточный цикл, независимость от факторов роста, сосудо­образование, клеточную миграцию, изменение адгезивных свойств, сниженные уровни апоптоза и пониженную чувствительность к химиотерапевтическим агентам [33].

Генетика глиомогенеза хорошо охарактеризована в сравнении с различными видами рака, и эта информация также может быть использована для разработки генной терапии для исправления этих генетических нарушений. С развитием глиомы у человека, как правило, связывают мутации четырех сигнальных путей: P53/ARF/MDM2 путь, P16/Rb/cyclinD/CDK4 путь, RTK/Ras путь и PI3K/PTEN/Akt путь [34]. Разработаны вирусные векторы, экспрессирующие трансгены, обычно мутировавшие в глиоме, для коррекции генетических мутаций [28].

Существуют аденовирусные векторы для доставки p53 к опухолевым клеткам. Экспрессия гена p53 критически необходима для нормального клеточного цикла и апоптоза [35]. В глиоме человека наиболее распространены мутации p53 или инактивирующих его белков. Инактивация p53 позволяет опухолевым клеткам обходить нормальный контроль клеточного роста. В попытке ингибирования опухолевого роста и запуска апоптоза ген p53 доставляли в клетки глиомы с помощью репликативно некомпетентного аденовирусного вектора [36].

В первой фазе испытаний пациентам имплантировали микрокатетеры для инъекции аденовирусных векторов с p53 в опухолевую ткань. Через несколько дней после введения вируса выполняли резекцию опухоли, оценивали степень биологического эффекта. В послеоперационном периоде было проведено дальнейшее введение аденовирусов с p53 в образовавшуюся после резекции полость для определения токсичности. При этом была показана трансдукция p53, хотя трансдуцированные клетки были обнаружены на расстоянии не более 5-8 мм от места введения. Признаки апоптоза выявлялись в небольшой доле опухолевых клеток. Тогда как активного вируса за пределами ЦНС не было обнаружено, титры антиаденовирусных антител были повышены. У некоторых пациентов развились неврологические побочные эффекты, которые купировались лечением кортикостероидами. Время до развития рецидива составляло в среднем 7 мес [37].

Онколитические вирусы в терапии мультиформной глиобластомы

История виротерапии опухолей насчитывает более 100 лет: первое сообщение о регрессе опухоли в области шеи у женщины после введения вакцины, содержащей истощенный вирус бешенства, датировано 1912 г. [7].

В дальнейшем были и другие наблюдения, показывающие, что перенесенная вирусная инфекция замедляет развитие опухоли. Современная эра онколитической виротерапии началась в 90-х годах прошлого столетия, когда развитие генной инженерии сделало возможным конструирование вирусного генома, а понимание основных молекулярно-генетических механизмов канцерогенеза и вирусной инвазии позволило определить мишени, обеспечивающие тропность вирусов к опухолевым клеткам. Первый лабораторный вирус для онколитической терапии был создан на основе Herpes simplex virus (HSV; вирус простого герпеса) в 1991 г. R. Martuza и соавт. [38].

В 1996 г. были опубликованы данные о первом генно-инженерном онколитическом аденовирусе [39]. В настоящее время известны более 20 потенциальных ОВ более чем из 10 различных вирусных семейств, список же созданных на их основе модифицированных форм ОВ уже не поддается исчислению. В фазе клинических испытаний находятся ОВ, созданные на основе HSV, аденовируса, вируса болезни Ньюкасла, реовируса, парвовируса H1 [40-42], вируса кори, вируса полиомиелита [7].

Мультиформная глиобластома почти с самого начала развития концепции ОВ рассматривалась в качестве кандидата для онколитической терапии, и не только в связи с неэффективностью существующих методов лечения. Во-первых, эта опухоль не имеет отдаленных метастазов и почти всегда локализована в пределах одного органа, что позволяет применять локальное введение ОВ. Во-вторых, за исключением реактивных астроцитов, образующих перитуморальный глиальный вал, все остальные клетки вокруг опухоли являются высокодифференцированными и не вступают в митоз, что позволяет еще больше повысить тропность ОВ по отношению к глиомным клеткам, поскольку для эффективной репликации вируса требуются пролиферирующие клетки. В-третьих, высокая специализация клеток нервной ткани, обусловленная особенностями генетической экспрессии, подразумевает, в частности, наличие тканеспецифических промоторов (например, промотор GFAP и других нейроспецифических белков). Применение таких промоторов также может позволить увеличить тропность вируса по отношению к опухолевым клеткам нейроэпителиального происхождения.

Перечисленные преимущества для применения ОВ, вкупе с высокой актуальностью разработки новых методов терапии МГ, обусловили большое количество исследований в этом направлении. Со времени первой публикации R. Martuza в 1991 г. опубликовано 250 работ по онколитической виротерапии глиом с помощью 15 различных ОВ, из которых 7 в настоящее время проходят I и II фазы клинических испытаний.

Концепция онколитической виротерапии. Концепция создания ОВ подразумевает селекцию или генно-инженерные модификации вирусного генома, в результате которых репликативно-компетентный вирус приобретает определенную тропность и при введении в организм человека селективно реплицируется в опухолевых клетках, приводя к их лизису и усиливая сенсибилизацию иммунокомпетентных клеток опухолевыми антигенами.

Все разрабатываемые ОВ можно разделить на три группы: 1) патогенные для человека вирусы; 2) вирусные вакцины, 3) условно непатогенные для человека вирусы. Наиболее распространенные представители первой группы - вирус простого герпеса (HSV) [43] и аденовирусы [44, 45]. Основная проблема для ОВ этой группы - снижение патогенности для нормальных клеток человека. Примеры ОВ на основе вирусных вакцин - генно-инженерные препараты, созданные на базе вируса натуральной оспы (Vaccinia) [46], вируса полиомиелита [47] и вируса кори [48-50]. Для этих ОВ проблема патогенности отодвигается на второй план после придания вирусам селективности по отношению к опухолевым клеткам. В случае разработки ОВ на основе вирусных вакцин на первый план также может выходить проблема преодоления устойчивого иммунитета к перечисленным вирусам, которым обладает большинство людей. Наконец, ОВ третьей группы, как правило, вообще не требуют модификаций, связанных с устранением патогенности. Это ОВ, созданные на базе таких вирусов, как вирус болезни Ньюкасла, вирус миксомы, парвовирус H1, вирус везикулярного стоматита, вирус Синдбис, вирус псевдостолбняка, вирус долины Сенека.

Не являясь, за редким исключением, вирулентными для нормальных клеток человека, данные вирусы, иногда даже без каких-либо генно-инженерных модификаций, проявляют способность селективно инфицировать опухолевые клетки, вследствие значительных перестроек у последних мембранных рецепторов и внутриклеточных белков. Ярким примером немодифицированного непатогенного для человека ОВ является парвовирус H1 [40, 41].

Мембранные механизмы селективности ОВ. Селективное связывание вируса с мембранным рецептором клетки-мишени - самый первый и иногда ключевой механизм, обеспечивающий тропность вируса к опухолевым клеткам. В частности, вирус кори селективно взаимодействует с рецептором CD46, который в большом количестве содержится на поверхности многих, в том числе и глиомных, опухолевых клеток [48]. Корецептор CD155, необходимый для адгезии и последующей интернализации вируса полиомиелита, гиперпродуцирован на поверхности глиомных клеток [51]. Рецептором для вируса Синдбиса оказался 67 кД высокоаффинный рецептор к ламинину, оверэкспрессия гена которого наблюдается, например, в клетках рака яичника [52]. Сродство вирусов к опухольассоциированным рецепторам может быть создано с помощью генной инженерии, путем экспонирования на поверхности вируса вариабельных доменов антител или специфических лигандов. В качестве рецепторов-мишеней для ОВ исследуются: рецептор эпидермального фактора роста vIII (EGFRvIII), рецептор тромбоцитарного фактора роста (PDGFR), рецептор интерлейкина-13 (IL-13R) и ряд других опухольассоциированных белков [7, 49]. Экспонирование на поверхности аденовируса хорошо известного циклического трипептида RGD, селективно взаимодействующего с опухолевым интегрином αvβ3, позволяет соответствующим образом нацеливать вирус [44, 53]. Поиск опухольселективных поверхностных маркеров активно продолжается.

Цитоплазматические механизмы онкоспецифичности. В цитоплазме нормальных клеток присутствуют потенциальные противовирусные агенты. Например, появление двухцепочечной РНК, которая необходима для цикла некоторых РНК-содержащих вирусов, запускает систему противовирусной защиты, в результате чего активируется протеин-киназа R (PKR) и интерфероновый путь. Активированная PKR ингибирует синтез вирусных белков и запускает апоптоз, а интерфероны приводят к активации ряда противовирусных медиаторов [7]. Опухолевые клетки, подчас имеющие различные поломки в проапоптотических каскадах, могут обладать и дефектами в системе противовирусной защиты. Так, дефект интерферонового пути у некоторых опухолевых клеток делает их чувствительными к вирусам везикулярного стоматита [54, 55] и миксомы [56]. Функция PKR нарушается у опухолевых клеток, с активированным RAS сигнальным путем. На этом свойстве основан онкотропизм реовирусов [57] и HSV c удаленным геном F134.5 [58]. Активация AKt-пути в опухолевых клетках делает их подверженными к инфицированию вирусом миксомы, что также используется для создания ОВ [59].

Мощным потенциалом для разработки опухольселективных ОВ обладает паттерн микроРНК. Известно, что экспрессия многих опухольсупрессивных микроРНК практически отсутствует в опухолевых клетках [22]. Недавно было показано, что репликация вируса везикулярного соматита и вируса кори в нормальных клетках почти полностью снижается при включении в вирусный геном последовательности, комплементарной противоопухолевой микроРНК miR7. При этом в опухолевых клетках, в которых экспрессия данной микроРНК отсутствует, такие miR7-чувствительные вирусы хорошо реплицировались и способствовали лизису зараженных клеток [50, 60].

Ядерные механизмы онкоспецифичности ОВ. Для репликационного цикла некоторых вирусов, например автономных парвовирусов (Autonomous parvoviruses), необходимо, чтобы клетка-хозяин обязательно прошла S-фазу митоза [42]. Эта особенность делает парвовирусы непатогенными для всех постмитотических клеток, что особенно актуально для нервной системы. Почти такое же свойство приобретает мутантный HSV с удаленными генами тимидинкиназы и рибонуклеотидредуктазы [61].

Продукт аденовирусного гена E1A, взаимодействуя с pRB (cellular retinoblastoma tumor suppressor protein), запускает в клетке-хозяине S-фазу митоза. Белок Е1B при этом выполняет функцию супрессора апоптоза путем связывания и инактивации p53, который обычно запускает апоптоз в ответ на срабатывание механизмов противовирусной защиты. Вследствие этого дефектные по генам E1A и E1B аденовирусы не могут реплицироваться в нормальных клетках и приобретают селективность по отношению к опухолевым клеткам с дефектными pRB и p53 [62].

Другим весьма перспективным генно-инженерным способом придания ОВ онкоспецифичности является создание вирусов, гены которых находятся под контролем опухоль- или тканеспецифических промоторов, таких как Nestin-1, GFAP, Ki-67 и др. [45].

Опыт 20-летних исследований показывает, что ОВ, созданные на базе вируса простого герпеса, аденовируса, вируса болезни Ньюкасла, кори, парвовируса и др. без­опасны для организма и характеризуются селективной репликацией в опухолевых клетках. Кроме того, ОВ способствуют презентированию опухольассоциированных антигенов иммунокомпетентными клетками и, таким образом, могут стимулировать противоопухолевый иммунный ответ. Резюмируя данные доклинических исследований и клинических испытаний ОВ, можно с уверенностью заключить, что этот подход, несомненно, будет эффективно применяться для лечения МГ в ближайшем будущем.

Биомаркеры глиом

Для всех направлений генотерапии необходимо понимание биомаркеров глиом. Многие новые методы лечения глиомы, так или иначе, основаны на доставке терапевтических веществ к клеткам-мишеням. Как правило, такими веществами являются цитостатические препараты или киллерные гены, поэтому чем более селективна доставка лекарства к опухолевым клеткам, тем менее выражены побочные эффекты, связанные с поражением нормальных клеток. Обеспечить такую адресность можно, направляя препарат к поверхностным рецепторам, гиперпродуцированным в глиомных клетках. С другой стороны, колоссальная опухолевая гетерогенность от пациента к пациенту и даже в пределах субпопуляций опухолевых клеток у одного пациента диктует необходимость индивидуального подхода к адресной терапии. Очевидно, что нацеливание на какой-либо один поверхностный маркер опухолевых клеток не позволит эффективно элиминировать все опухолевые клетки. Таким образом, возникает задача как можно более полного анализа поверхностных маркеров клеток глиобластомы и создания некоего паттерна молекулярных мишеней, которые, с одной стороны, обеспечивали бы селективность доставки в опухоль, а с другой - ее универсальность для гетерогенных популяций опухолевых клеток. В данном разделе суммирован материал по наиболее изученным на сегодняший день маркерам МГ.

IL-13Rα

IL-13Rα2 - маркерный рецептор клеток глиобластомы, структурно отличается от рецептора нормальных клеток [63]. IL-13Rα2 может связывать только IL-13, но не IL-4 и представлен в изобилии на поверхности клеток глиом III и IV стадии [63]. IL-13Rα2 имеет свойства раково-семенниковых антигенов, расположен на хромосоме X, и единственная нормальная ткань, где ген этого белка значительно экспрессируется, - семенники. Предполагается, что IL-13Rα2 - рецептор-ловушка для IL-13, не имеющий внутриклеточного каскада передачи сигнала [65]. Однако существует и другая точка зрения, предполагающая наличие сигнальной роли этого рецептора [64]. IL-13Rα2 - первый рецептор, гиперпродукция которого была обнаружена в опухолевых клетках у большинства пациентов с глиобластомой и при этом не наблюдается в нормальных клетках нервной ткани. Авторадиографический и иммуногистохимический анализы выявили гипер­экспрессию IL-13Rα2 у пациентов с глиобластомой в 75% случаев [66]. Были созданы молекулярные лекарственные препараты, нацеленные на IL-13Rα2, первый из которых сейчас в 3-й фазе клинических испытаний по лечению рекуррентной глиобластомы [67].

IL-13Rα1 - фрагмент белка IL13Ralpha, сам по себе имеет низкое сродство к IL-13. Соединяясь с IL4Ralpha цепью, он формирует IL-13R с высоким сродством к IL-13, и, таким образом, IL-13Rα1 последовательность важна для связывания IL-4/IL-13. В экспериментах IL-13Rα1 обнаружен на мембранах во всех глиомных клеточных линиях [68].

EphA2

EphA2 входит в семейство рецепторов Eph с тирозинкиназной активностью. Они уникальны в том, что их эндогенные лиганды - эфрины, поверхностно заякорены в мембране соседних клеток. Рецепторы Eph делятся на классы A и B на основании типа прикрепления к плазматической мембране [69]. Эфрины А прикреплены гликозилфосфатидилинозитольной связью, тогда как эфрины В содержат трансмембранную последовательность с внутриклеточным доменом, который участвует в прикреплении к клеточной мембране. Все эфрины взаимодействуют со специфическими рецепторами эфринов, а некоторые из них связываются более чем с одним рецептором [70].

Рецепторы Eph и эфрины показывают специфический паттерн экспрессии в течение развития [71]. Обнаружено, что в развитии нервной системы рецепторы Eph и их лиганды играют важную роль в направлении роста аксона с участием контактзависимых процессов между клетками [72]. EphA2 представлен в нервной системе в течение эмбрионального развития, но в отличие от большинства других рецепторов Eph он также экспрессируется на поверхности пролиферирующих зрелых клеток эпителия [73]. EphA2 играет важную роль в сосудообразовании и неоваскуляризации опухоли путем связывания с его эндогенным лигандом ephrinA1 [74].

EphA2 гиперпродуцируется в глиобластоме [75] на мембране опухолевых клеток, а также в связанных с опухолью сосудах, что делает EphA2 привлекательной целью. Более того, этот рецептор гиперэкспрессируется еще в некоторых солидных опухолях, включая рак молочной железы [76] и рак поджелудочной железы [77]. Таким образом, можно заключить, что EphA2 является онкобелком, играющим важную функциональную роль в формировании злокачественного фенотипа.

uPAR

Белок uPA (урокиназный активатор плазминогена) и его рецептор uPAR играют важную роль в локализации плазмина на поверхности клеток, производящих uPAR. Различные физиологические и патологические процессы, например органогенез во время эмбрионального развития, инвазивное и метастатическое распространение злокачественных опухолей и воспалительные реакции требуют, чтобы определенные типы клеток мигрировали из места своего стандартного расположения в различные другие зоны организма. Чтобы разрешить такие клеточные миграции, должны быть доступны механизмы, обеспечивающие фокальную деградацию компонентов внеклеточного матрикса. На основе ряда исследований предположили, что внеклеточный протеолиз, катализируемый плазминогенным активатором, может играть важную роль в событиях, необходимых для миграции клеток в тканях. В настоящее время хорошо известно, что различные типы клеток синтезируют и секретируют uPA, к ним относятся клетки, такие как моноциты/макрофаги, полиморфно-ядерные лейкоциты, а также клетки, полученные из злокачественных опухолей. Образование плазмина на поверхности клетки разрушает внеклеточный матрикс путем активации матриксных металлопротеиназ. Это, возможно, значимое событие в опухолевой инвазии и метастазировании и в миграции клеток [78]. uPAR сильно гликозилирован и образует множество дисульфидных мостиков и обладает высоким сродством к uPA. uPAR состоит примерно из 284 аминокислотных остатков, включая 3 повтора по 90 остатков [79], первый из которых взаимодействует с лигандом, а последний заякоривает uPAR в плазматической мембране цепью гликозил-фосфатидилинозитола [80]. Обнаруженные сайты для AP-1 и Sp-1 в предпромоторной области uPAR играют важную роль в регуляции этого гена в клетках рака толстой кишки и других типах раковых клеток [81].

Обнаружено, что повышенный уровень белков uPA и uPAR коррелирует с повышением злокачественности [82]. Более того, выработка uPA и uPAR на поверхности мембраны клеток злокачественных опухолей мозга, но не нормальной ткани, свидетельствует о том, что эти белки могут участвовать в опухолевой инвазии. Воздействие антителами к uPAR [83], или антисенсными нуклеотидами [84] уменьшает инвазивность клеток глиобластомы человека. Инвазивное поведение клеток в стабильных трансфицированных клонах клеточной линии глиобластомы значительно снижается in vitro и in vivo при использовании антисмыслового транскрипта (блокатора), комплементарного 300 п.н. (пар нуклеотидов) с 5'конца мРНК uPAR в сравнении с поведением клеток исходной клеточной линии [84].

FPR

FPR - связанный с G белком рецептор, изначально найденный в фагоцитирующих лейкоцитах, участвующий в клеточном хемотаксисе и активирующийся в ответ на бактериальные формилированные хемотаксические белки. Связываясь с FPR, агонист включает сигнальный каскад, вовлекающий фосфатидилинозитол-3-киназу, белковую киназу C, митогенактивируемые белковые киназы и транскрипционный фактор NF-kB [88]. Предполагается, что благодаря своей экспрессии в клетках иммунной системы и взаимодействию с бактериальными хемотаксическими белками FPR участвует в защите организма против микробных инфекций [85]. Обнаружено несколько хемотаксических агонистов FPR - формилпептиды, вероятно, синтезируемые митохондриями поврежденных клеток [86], аннексин I, производимый активированным эпителием [89], и фермент гранул нейтрофилов, катепсин G [90]. Ко всему прочему, функциональный FPR был найден в клетках негематопоэтического происхождения, таких как клетки легочного эпителия [91] и гепатоциты [92]. Следовательно, спектр патофизиологических процессов, в которых участвует FPR, расширяется.

Обнаружено, что опухолевые клетки большинства злокачественных глиом человека, включая анапластическую астроцитому и глиобластому, также экспрессируют FPR [93, 94]. FPR, экспрессируемый в опухолевых клетках из глиобластомы человека в ответ на родственный белок-агонист fMLF и агонисты из отмирающих опухолевых клеток, вызывает направленную миграцию, выживаемость и производство сосудообразующих факторов опухолевыми клетками [93, 95]. Удаление FPR короткими интерферирующими РНК заметно снижает онкогенность глиобластомных клеток в мозгу иммунодефицитной мыши [93]. Таким образом, in vitro и in vivo показано, что FPR потенциально способен усугублять прогрессию злокачественных глиом человека.

AMPAR

AMPAR - ионотропный трансмембранный рецептор глутамата, участвующий в быстрой синаптической передаче сигнала в ЦНС. Может активироваться синтетическим аналогом глутамата - α-амино-3-гидрокси-5-метилизоксазол-4-пропоновой кислотой. AMPAR состоит из четырех типов субъединиц GluR1, GluR2, GluR3 и GluR4, которые в совокупности образуют тетрамеры [96].

Клетки глиомы могут регулировать проводимость кальция, изменяя экспрессию субъединиц AMPAR. Транскрипты субъединицы GluR2 подвергаются Q/R редактированию, вызывающему непроницаемость рецептора. При восстановлении субъединицы GluR2 в глиобластомных клетках с помощью вирусного вектора глиобластомные клетки не смогли сформировать опухоль в мозгу иммунодефицитной мыши, что указывает на необходимость подавления GluR2 для выживания глиобластомных клеток [97]. Показано, что в образцах ткани и клеточных линиях глиобластомы снижена экспрессия белка и мРНК AMPAR по сравнению с нормальными клетками мозга [98]. Более того, мРНК субъединицы GluR2 претерпевает частичное посттранскрипционное редактирование в первичных опухолевых клетках [98]. Вероятно, подавление экспрессии рецептора позволяет клеткам глиобластомы избежать клеточной смерти.

Напротив, субъединица GluR1 гиперэкспрессируется клетками глиобластомы, что приводит к усилению формирования комплексов фокальных контактов, колокализации актина и паксиллина и клеточной поляризации [99]. Клетки, гиперэкспрессирующие GluR1, содержат повышенные количества FA киназы, и стимуляция глутаматом приводит к возросшей активности Rac1 ГТФазы. Иммунопреципитация показала, что GluR1 может быть связана с рецепторами интегрина. Уровень экспрессии AMPAR коррелирует с инвазивностью глиомных клеток in vitro и in vivo [99].

NgR

Nogo-66 - нейрональный гликозилфосфатидилинозитол-заякоренный белок, формирующий комплекс сигнальной трансдукции с трансмембранными белками p75NTR и LINGO-1 [101]. Служит рецептором для молекулы, связанной с миелином, ингибирующей рост нейронов, Nogo-A [100]. Nogo-66 - C-терминальный внемембранный домен Nogo-A, связывается с NgR [102].

Nogo-A вовлечен в созревание олигодендроцитов и формирование миелина [103]. Nogo-A активно экспрессируется в олигодендроцитах ЦНС и в демиелинизирующих поражениях [104]. Кроме демиелинизации, Nogo-A также вовлечен в онкогенез. Присоединение к субстрату и миграция клеток из клеточной линии глиомы U87MG значительно ослабляется внемембранными доменами Nogo-A (Nogo-66) и миелин-ассоциированного гликопротеина (МАГ) [105]. Клетки, подвергшиеся воздействию антител к NgR, показали повышенную способность связываться и передвигаться по субстратам, покрытым Nogo-66 и МАГ. Таким образом, Nogo-66 и МАГ могут замедлять рост и движение глиомы, действуя через NgR [105].

В образцах глиомы ч

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail