Болезнь Паркинсона (БП) является одним из наиболее распространенных нейродегенеративных заболеваний по всему миру [1]. В связи с этим разработка лекарственных препаратов с комплексным механизмом действия, способных остановить прогрессирование нейродегенерации и замедлить развитие симптомов заболевания, остается актуальной. Показатели изменения спектров мощности электроэнцефалограмм (ЭЭГ) широко используются для оценки функционального состояния головного мозга при различных заболеваниях и оценки нейропротективной терапии у пациентов [2, 3].

У больных БП показано увеличение медленной активности ЭЭГ в дельта- и тета-диапазоне [4, 5], степень которой коррелировала с выраженностью двигательных расстройств. Снижение активности мозга в состоянии покоя у больных с БП, не получавших медикаментозной терапии de novo, было показано даже на самых ранних клинических стадиях, что свидетельствует о возникновении изменений на ЭЭГ еще на доклинической стадии заболевания, предшествующей появлению характерных двигательных нарушений [6].

Функциональная активность мозга у больных БП, изучаемая методом спектрально-когерентного анализа ЭЭГ, показала, что на начальных стадиях заболевания у пациентов наблюдается характерная бета-активность с источником генерации в срединных структурах головного мозга [7—9]. Записи локальных потенциалов субталамических ядер у пациентов с БП также демонстрируют высокую активность в бета-диапазоне 15—30 Гц, коррелирующую с двигательными симптомами БП и уменьшающуюся после лечения [10].

У животных с экспериментальным синдромом паркинсонизма (СП), вызванным пронейротоксином 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридином (МФТП), избирательно поражающим нигростриатные дофаминергические нейроны, наблюдаются специфические изменения биоэлектрической активности головного мозга. У крыс с СП, индуцированным МФТП, отмечаются пароксизмальные разряды быстрых и медленных волн, увеличение мощности ЭЭГ в области медленных волн в сенсомоторной коре (СМК) и черной субстанции (ЧС), хвостатых ядрах (ХЯ) [11]. Корреляция между степенью моторных нарушений и изменениями в ЭЭГ в структурах мозга также была выявлена в экспериментах на обезьянах при МФТП-индуцированном СП [12].

Ранее было показано, что гимантан (N-2-адамантил-гексаметиленимина гидрохлорид) обладает в эксперименте выраженным антипаркинсоническим эффектом [11, 13]. Предыдущие исследования тоже выявили у гимантана положительный дофаминовый эффект, а также свойства низкоаффинного неконкурентного блокатора ионного канала глутаматных N-метил-D-аспартат (NMDA)-рецепторов, обратимого ингибитора моноаминоксидазы B и умеренную антиоксидантную, противовоспалительную, нейропротективную и иммунотропную активности [13—18].

Цель работы — изучение влияния гимантана на биоэлектрическую активность структур мозга мышей на ранней и поздней (выраженной) стадиях экспериментальной БП.

Материал и методы

В исследовании было использовано 30 самцов мышей линии C57BL/6J массой 25—32 г, полученных из НПП «Питомник лабораторных животных» ФИБХ РАН. Для экспериментального моделирования БП у мышей линии C57BL/6J системно (внутрибрюшинно) вводили пронейротоксин МФТП в двух режимах, соответствующих разным клиническим стадиям заболевания. При введении МФТП мышам в дозе 12 мг/кг 4 раза с интервалом 2 ч моделировали раннюю клиническую стадию БП, а при введении пронейротоксина в дозе 20 мг/кг также 4 раза и с интервалом 2 ч — позднюю (выраженную) клиническую стадию заболевания [19].

Показано, что введение МФТП по схеме 12 мг/кг 4 раза с интервалом 2 ч вызывает падение уровня дофамина на 75—80% в стриатуме [20], что соответствует уровню уменьшения дофамина у пациентов на начальной клинической (симптомной) стадии БП.

Гимантан синтезирован в ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр оригинальных и перспективных биомедицинских и фармацевтических технологий».

Для регистрации биоэлектрической активности мозга животных в наркотизированном состоянии после наступления медикаментозного сна были вживлены электроды в соответствии с координатами стереотаксического атласа [21]. ЭЭГ регистрировалась через 14 дней после моделирования БП в условиях свободного передвижения животных в течение 10 мин с использованием 21-канального аппаратно-компьютерного комплекса Нейро-КМ («Статокин», Россия). После фильтрации и визуального анализа данных, выделения и удаления артефактов статистическую обработку спектрально-когерентных характеристик ЭЭГ проводили с помощью программы Brainsys [22].

Животные содержались в соответствии с правилами, установленными Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 г., касающимися защиты животных, используемых в научных целях. Животные содержались в полипропиленовых клетках со стерилизованной мелкой стружкой в качестве подстила при температуре воздуха 22—26 °C и относительной влажности 35—65% при световом режиме 12:12 ч согласно ГОСТ 34088-2017. Для кормления использовали гранулированный комбикорм (ООО «МЭСТ», Россия ГОСТ Р50258-92) ad libitum. Поение животных на период адаптации осуществлялось проточной фильтрованной водой ad libitum. Экспериментальные работы проводились согласно требованиям, изложенным в Директивах Совета Европейского сообщества 86/609/ЕЕС об использовании животных при проведении экспериментальных исследований, что подтверждено заключением Этического комитета ФГБНУ НИИОПП (№4 от 02.09.19).

Статистический анализ. Нормальность распределения оценивали по критерию Колмогорова—Смирнова, равенство дисперсий — по тесту Бартлетта. Для сравнения групп ЭЭГ-файлов в случае независимых выборок при неравенстве дисперсий использовали критерий Фишера—Беренса. Параметрическое сравнение двух групп ЭЭГ-файлов реализовали по t-критерию Стьюдента, считая различия статистически значимыми при p<0,05.

Результаты

У контрольной группы животных был выявлен дизритмичный характер фоновой биоэлектрической активности мозга с присутствием как быстрых, так и медленных волн в широком диапазоне частот — от 1,0 до 32 Гц, с выделением стандартных групп: дельта-, тета-, альфа-, бета1- и бета2-диапазона (1—3,5; 4—7; 8—12; 13—20; 21—30 Гц соответственно), амплитудой от 0,5 до 80 мкВ (рис. 1, а). Амплитуда биоэлектрической активности была более низкой в области СМК по сравнению с другими структурами мозга. Наблюдалась более регулярная активность в диапазоне тета-частот (4—7 Гц), особенно в черной субстанции, и диапазоне дельта-частот (1—3,5 Гц) во всех анализируемых структурах мозга (см. таблицу). Этот характер фоновой биоэлектрической активности соответствует нормальной работе мозга животных в состоянии покоя [23].

Рис. 1. Примеры электрограмм мозга мышей C57Bl/6 (по 3 особи из каждой группы).

а — группа «Контроль»; б — «МФТП 12×4»; в — «Гимантан 20×4+МФТП 12×4»; г — «МФТП 20×4»; д — «Гимантан 20×4+МФТП 20×4»; 3,5 мкВ/мм — масштаб изображения амплитуды, 1,5 см/с — скорость разверстки записи.

Влияние гимантана на изменение спектров мощности физиологически значимых диапазонов волн биоэлектрической активности мозга мышей C57Bl/6 с экспериментальным моделированием БП, вызванным введением МФТП, % (M±SEM)

Примечание. * ** или ^т* — p<0,05, p<0,01, p<0,07 соответственно, достоверность отличий по сравнению с группой «Контроль»; ^{# ##} или ^т# — p<0,05, p<0,01, p<0,07 соответственно, достоверность отличий по сравнению со значениями в группе, получавшей МФТП в соответствующей дозе.

При моделировании ранней клинической фазы БП у мышей с помощью введения МФТП в дозе 12 мг/кг 4 раза наблюдались характерные изменения в биоэлектрической активности во всех исследуемых структурах мозга. Визуальный и спектральный анализ ЭЭГ мышей, зарегистрированных через 14 дней после воздействия пронейротоксина, показал повышение амплитуды всех групп волн во всех отведениях (см. рис. 1, рис. 2 на цв. вклейке), достигавшее статистической значимости в диапазоне дельта-частот в СМК, ЧС и ХЯ, а также в диапазонах тета-, альфа- и бета-частот в ЧС и ХЯ. Наиболее выраженными изменения в спектре мощности ЭЭГ были в диапазоне дельта-волн (1—3,5 Гц) при введении МФТП в дозе 12 мг/кг 4 раза (см. таблицу, рис. 3 на цв. вклейке). Доля этой активности составила 46% в СМК, 34% в ЧС и 41% в ХЯ, что превышало значения, отмеченные в группе контрольных животных, на 17, 9 и 11% соответственно. Во всех других диапазонах частот во всех анализируемых структурах мозга при введении МФТП (12 мг/кг 4 раза) отмечалось снижение спектра мощности, достигавшее статистической значимости в диапазоне тета-волн в СМК и ЧС, а также в диапазоне бета2-волн в СМК (см. таблицу). В ЧС статистически значимое снижение спектральной мощности отмечалось только в диапазоне тета-частот, а в ХЯ — в диапазоне тета-частот и отдельных бета2-волнах (см. рис. 3, а, на цв. вклейке).

Рис. 2. Изменение амплитудных спектров отдельных волн (шаг 1 Гц) от всего диапазона (%) ЭЭГ мышей групп «МФТП 12×4» (а) и «МФТП 20×4» (б) в сравнении с группой «Контроль» и групп «Гимантан 20×4+МФТП 12×4» (в) и «Гимантан 20×4+МФТП 20×4» (г) в сравнении с соответствующими группами мышей, получавших только МФТП.

По оси ординат — величина t-Стьюдента со знаком (N1—N2), где N1 — данные группы, получавшей МФТП или Гимантан и МФТП, а N2 — «Контроль» или соответствующая группа МФТП. По оси абсцисс — диапазоны волн: дельта 1—3,5 Гц, тета 4—7 Гц, альфа 8—12 Гц, бета1 13—20 Гц, бета2 21—30 Гц. Достоверность различий при p<0,05 при t>1,9.

Рис. 3. Изменение спектров процентной мощности отдельных волн с шагом 1 Гц в % от всего диапазона ЭЭГ мышей групп «МФТП 12×4» относительно группы «Контроль» (а) или «Гимантан 20×4+МФТП 12×4» относительно группы «МФТП 12×4» (б).

По оси ординат — величина t-Стьюдента со знаком (N1—N2), где N1 — данные группы «МФТП 12×4» или «Гимантан+МФТП 12×4», а N2 — «Контроль» или «МФТП 12×4». По оси абсцисс — диапазоны волн с шагом 1 Гц, где: дельта 1—3,5 Гц, тета 4—7 Гц, альфа 8—12 Гц, бета1 13—20 Гц, бета2 21—30 Гц. Достоверность различий при p<0,05 при t>1,9.

При моделировании поздней стадии БП у мышей, получивших МФТП в дозе 20 мг/кг 4 раза, наблюдался еще более выраженный рост амплитуды ЭЭГ во всех отведениях по сравнению с контрольной группой и группой мышей, которым вводили меньшую дозу МФТП (12 мг/кг 4 раза), при этом амплитуда волн в СМК была выше, чем в других структурах (см, рис. 1, г; рис. 2, б, на цв. вклейке).

Анализ ЭЭГ мышей, получивших МФТП в дозе 20 мг/кг 4 раза, выявил усиление активности в диапазоне дельта- и бета-волн (см. рис. 1). Анализ изменений мощности биоэлектрической активности мозга показал усиление дельта-активности во всех структурах и снижение мощности в диапазоне тета-волн в ЧС по сравнению с контрольной группой (см. таблицу). При детальном анализе (с шагом 1 Гц) изменений биоэлектрической активности мозга мышей, у которых моделировали позднюю стадию БП с помощью введения МФТП в дозе 20 мг/кг 4 раза, и соответствующих значений контрольной группы, наряду с усилением дельта-активности, во всех изучаемых структурах, выявлено снижение спектра мощности в диапазоне тета-частот, достигавшее уровня значения в ЧС и ХЯ (рис. 4 на цв. вклейке). Наряду с этим в ЧС отмечалось также некоторое усиление спектра мощности в диапазоне бета1- и бета2-частот.

Рис. 4. Изменение спектров процентной мощности отдельных волн с шагом 1 Гц в % от всего диапазона ЭЭГ мышей групп «МФТП 20×4» относительно группы «Контроль» (В) или «Гимантан 20×4+МФТП 20×4» относительно группы «МФТП 20×4» (Г).

По оси ординат — величина t-Стьюдента со знаком (N1—N2), где N1 — данные группы «МФТП 20×4» или «Гимантан+МФТП 20×4», а N2 — «Контроль» или «МФТП 20×4». По оси абсцисс — диапазоны волн с шагом 1 Гц, где: дельта 1—3,5 Гц, тета 4—7 Гц, альфа 8—12 Гц, бета1 13—20 Гц, бета2 21—30 Гц. Достоверность различий при p<0,05 при t>1,8.

При использовании гимантана (20 мг/кг), введенного за 30 мин до каждой инъекции МФТП в дозе 20 мг/кг 4 раза, наблюдалось уменьшение амплитуды волн во всех структурах по сравнению с группой, получившей МФТП в дозе 12 мг/кг 4 раза, особенно выраженное в диапазоне дельта- и бета2-волн в СМК (см. рис. 1, в, рис. 2, в, на цв. вклейке). Гимантан вызвал снижение мощности биоэлектрической активности мозга в диапазоне дельта-волн (1—3,5 Гц) у мышей с моделью ранней БП, наиболее выраженное в СМК, и повышение тета- и альфа-активности во всех структурах, достигавшее значимости в области СМК, в сравнении с группой контрольных животных, которым вводили только МФТП в дозе 12 мг/кг 4 раза (см. таблицу). Детальный анализ полученных изменений биоэлектрической активности мозга мышей на этой стадии БП, которым вводили гимантан, показал существенное усиление спектра мощности всех групп волн, за исключением дельта-частот, в СМК, а также увеличение активности в диапазонах тета-, альфа- и бета1-частот в ЧС и ХЯ при сравнении с группой, которая получала только МФТП в дозе 12 мг/кг 4 раза при незначимом снижении спектра мощности в диапазоне бета2-частот в структурах ЧС и ХЯ (см. рис. 3, б, на цв. вклейке).

При моделировании у мышей поздней стадии БП с помощью МФТП в дозе 20 мг/кг 4 раза введение гимантана в дозе 20 мг/кг за 30 мин до каждой инъекции пронейротоксина снизило амплитуду дельта-волн во всех структурах, но не оказало влияния на амплитуду в других диапазонах частот по сравнению с группой животных, которым вводили только МФТП в дозе 20 мг/кг 4 раза (см. рис. 1, д, рис. 2, г, на цв. вклейке). Кроме того, при применении гимантана на этой стадии БП во всех анализируемых структурах мозга мышей наблюдалось ослабление спектра мощности в диапазоне дельта-волн, а также увеличение активности в диапазонах тета-, альфа- и бета1-волн, наряду со снижением бета 2-активности, которое было наиболее выражено в ЧС при сравнении с группой животных, которым вводили только МФТП в дозе 20 мг/кг 4 раза (см. таблицу, рис. 4 на цв. вклейке).

Обсуждение

Таким образом, нейротоксин МФТП в дозах 12 и 20 мг/кг при четырехкратном введении усиливал десинхронизацию ЭЭГ, повышал амплитуду волн, увеличивал спектр мощности в диапазоне дельта-частот при уменьшении биоэлектрической активности остального диапазона волн, особенно диапазона тета-частот в ЧС, СМК и ХЯ мозга мышей. Гимантан был способен снизить повышенную при введении МФТП амплитуду ЭЭГ-волн в структурах мозга мышей, начиная с ранней стадией БП, а также уменьшал дельта-активность при повышении тета-, альфа- и бета1-активности.

Показано, что при фармакологическом или хирургическом воздействии, а также при электрической стимуляции у больных с БП было отмечено снижение аномальных бета-колебаний при различных видах воздействия, в результате чего улучшались двигательные функции пациентов [24]. Еще одним характерным признаком БП на ЭЭГ является общее замедление ритмов [5, 25]. Моделирование экспериментального паркинсонизма у мышей введением нейротоксина 6-гидроксидофамина приводило к усилению синхронной активности в бета-диапазоне и замедлению ритма [26].

Избирательная гибель нигростриатных дофаминергических нейронов, вызванная интрацеребральным введением нейротоксина 6-гидроксидофамина, приводит к значительному усилению мощности спектра биоэлектрической активности и когерентности в бета-диапазоне в СМК (фронтальная часть), а также в субталамических ядрах мозга крыс при сравнении с аналогичными характеристиками группы контрольных животных. Характер синхронизации между активностью в СМК и субталамических ядрах на модели гемипаркинсонического синдрома, вызванного 6-гидроксидофамином, аналогичен наблюдаемым изменениям ЭЭГ у больных БП. Частота пика когерентной активности в бета-диапазоне у больных БП повышалась при спонтанных и навязанных движениях [27].

У пациентов с БП на начальной клинической стадии без признаков деменции было выявлено снижение мощности бета-диапазона в 7 областях мозга по сравнению с показателями у здоровых лиц соответствующего возраста, а снижение мощности бета-диапазона в височной области обратно коррелировало с выраженностью моторных нарушений у пациентов [28].

Изменения ЭЭГ в корково-кортикальном и кортико-таламическом взаимодействиях наблюдались как чрезмерная бета-когерентность у пациентов с БП и коррелировали с показателями шкалы оценки тяжести БП (UPDRS) и активностью транспортера дофамина, что может служить надежным показателем определения тяжести заболевания [9].

В наших предыдущих исследованиях на МФТП-индуцированной модели паркинсонического синдрома у мышей показано снижение тета-активности и усиление бета-активности в диапазоне 15—30 Гц, которое возникало уже через 10 мин от начала введения пронейротоксина и сохранялось длительное время [29, 30].

В данной работе применение гимантана в дозе 20 мг/кг как на ранней, так и на поздней стадиях экспериментального моделирования БП посредством системного введения МФТП в дозе 12 и 20 мг/кг 4 раза соответственно приводило к уменьшению мощности дельта-осцилляций и росту тета-волн. Этот эффект препарата можно объяснить как нивелирование негативного действия пронейротоксина на передачу сигналов и протективное действие по отношению к дофаминергическим нейронам нигростриатной системы. Гимантан также был способен снижать активность ЭЭГ в бета2-диапазоне, повышенную как на ранней (МФТП 12 мг/кг, 4 раза), так и на поздней (выраженной) (МФТП 20 мг/кг, 4 раза) клинической стадии экспериментального моделирования БП, что способствовало нормализации биоэлектрической активности.

Заключение

Таким образом, проведенный анализ изменений биоэлектрической активности мозга мышей с экспериментальным моделированием БП после применения гимантана показал позитивные эффекты препарата, которые выразились в уменьшении амплитуды всех групп волн во всех отведениях, понижении мощности бета- и дельта-осцилляций и росте активности в диапазоне тета-волн. Выявлено, что применение препарата способствовало возвращению мощности ритмов к фоновым показателям контрольных животных без индукции БП, а также снижению бета2-активности в ЧС как на ранней, так и на поздней клинической стадии БП. Обнаруженное нивелирование с помощью гимантана изменений ЭЭГ в структурах мозга животных с экспериментальным моделированием БП можно рассматривать как показатель лечебного эффекта препарата. Согласно полученным данным, эффект гимантана на изменения ЭЭГ при экспериментальном моделировании БП более выражен на начальной стадии заболевания, чем на развернутой стадии.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.