Дигидрокверцетин (ДГК), также известный как таксифолин, — полифенол природного происхождения, относящийся к группе флавоноидов, обнаружен во многих растениях, плодах и ягодах (расторопша, лук, виноград и др.). На территории России это соединение содержится в больших количествах в комлевой части сибирской лиственницы (Larix sibirica), откуда его получают в качестве побочного продукта переработки древесины. Подобно другим флавоноидам, ДГК обладает множественной фармакологической активностью, что привлекает к нему внимание как к потенциальному средству для лечения различных заболеваний: ожирение, диабет, рак, сердечно-сосудистые заболевания и др. [1—5].

Химическая структура (+) дигидрокверцетина.

В последние годы было показано, что ДГК способен предотвращать нарушение когнитивных способностей у животных, служащих моделью нейродегенеративных заболеваний, связанных с аномальным накоплением бета-амилоида (Аβ) [6, 7]. Этот пептид способен при определенных условиях формировать бляшки, которые являются характерным признаком таких заболеваний, как церебральная амилоидная ангиопатия (ЦАА) и болезнь Альцгеймера (БА). Хотя эти заболевания представляют собой самостоятельные нозологические единицы, они очень часто сопутствуют друг другу, а вовлеченность в их патогенез нарушения обмена Аβ позволяет отнести их к категории β-амилоид-ассоциированных заболеваний (БААЗ). Данная группа заболеваний ведет к деменции, в основе которой лежат дегенеративные изменения нейронов головного мозга. Поиск препаратов, способных затормозить или остановить этот процесс, весьма важен, поскольку распространение нейродегенеративных заболеваний растет во всем мире. К сожалению, на текущий момент ЦАА и БА остаются неизлечимыми заболеваниями.

Недавно было показано, что ДГК способен дезагрегировать Аβ и предотвращать его накопление в мозге [6, 8]. Эти результаты позволяют предположить, что ДГК может быть полезен для профилактики и лечения БААЗ. Однако ряд обстоятельств позволяет усомниться в том, что ДГК имеет центральный механизм действия. В настоящей работе проведена попытка разобраться в механизме нейрозащитного действия ДГК, базируясь на данных по его фармакокинетике, а также принимая во внимание большой совокупный материал по периферическим мишеням этого соединения.

Структура, свойства и фармакокинетика ДГК

ДГК является оптически активной молекулой. На рисунке показан (+)-энантиомер, присущий ДГК, выделяемому из природных источников. Катехоловая группа (кольцо B), сопряженная с C2, обладает восстановительными свойствами и способна обратимо окисляться до орто-хинона. В щелочной среде эта реакция становится необратимой и быстро приводит к разрушению исходного соединения. ДГК легко образует окрашенные, фоточувствительные комплексы с ионами многих металлов (Fe²⁺, Cu²⁺ и др.) и подобно другим полифенолам обладает способностью нейтрализовать свободные радикалы как биологического, так и синтетического происхождения. Например, отмечена способность ДГК в микромолярных дозах напрямую перехватывать гидроксильные (OH*) [9] и пероксильные (ROO*) радикалы [10]. Синтетические свободные радикалы, такие как 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил (DPPH*) и 2,2-азино-бис-(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота) (ABTS⁺), часто служат в качестве стандарта для оценки антирадикальной активности тестируемого соединения. В отношении этих радикалов активность ДГК незначительно отличается от активности других флавоноидов и также лежит в микромолярном диапазоне [11, 12].

В опытах in vivo биологическая активность ДГК изучается преимущественно на мелких грызунах (мыши и крысы). Интерпретация результатов этих исследований невозможна без детального изучения фармакокинетики ДГК. Поскольку наиболее часто ДГК поступает в организм через желудочно-кишечный тракт, для оценки концентрации этого соединения в системном кровотоке требуется знание его биодоступности. Ранее было показано, что кажущаяся проницаемость ДГК через модельный монослой клеток Caco-2 составляет <1·10^–6 см/с [13]. Эти результаты указывают на потенциально низкую скорость проникновения ДГК через барьер из энтероцитов. Действительно, как показали прямые эксперименты, абсолютная биодоступность ДГК у крыс и мышей невелика и лежит в диапазоне 0,17—0,49% [6, 14—16]. При связывании ДГК с белками молока его биодоступность может увеличиваться. Так, показано, что зеин-казеинатный комплекс ДГК обладает почти в 1,5 раза большей биодоступностью, чем простой ДГК (0,52 против 0,35%) [15].

При пероральном введении ДГК в дозе 15 мг/кг максимальная концентрация в плазме достигает 95 нг/мл (~0,31 мкМ) через 5 мин с периодом полувыведения (T_1/2) 6 ч, а при внутривенном введении в этой же дозе — 38 мкг/мл (~120 мкМ) с T_1/2 ~2 ч [16]. Эти данные согласуются с результатами другой работы, где ДГК напрямую вводили в желудок крыс через зонд [14]. В работе, выполненной на мышах с аналогичным протоколом введения ДГК в дозе 300 мг/кг, максимальная концентрация в плазме крови достигала 19 мкМ с T_1/2 ~40 мин [6]. В этой же работе было обнаружено, что при хроническом потреблении ДГК в составе питьевой воды (3%) на протяжении 14 мес концентрация в плазме крови достигала 7,5 мкМ (максимум), а в мозге — около 20 нг/г (~70 нМ). Иными словами, средняя концентрация ДГК в паренхиме мозга мышей была почти в 100 раз меньше, чем в системном кровотоке. В другой работе, выполненной на крысах, были получены несколько иные значения [17], но в целом можно заключить, что типовые концентрации ДГК в мозге всегда лежат в пико/наномолярном диапазоне.

Бета-амилоид и его свойства

Аβ — это пептид (от 37 до 49 аминокислот), который образуется путем расщепления β- и γ-секретазами белка-предшественника амилоида (APP). В норме Аβ присутствует в мозге в виде небольшого количества мономеров, которые, однако, имеют важное физиологическое значение и, как полагают, регулируют активность синапсов [18—20]. Третичная структура Аβ является неустойчивой, в значительной степени зависит от микроокружения и может легко переключиться из α-спирали в самокомплиментарную конформацию β-листа, которая затем «склеивается» со своими аналогами, формируя токсичные олигомеры, нерастворимые фибриллы и бляшки [21, 22]. Аβ_1—40 и Аβ_1—42 являются наиболее хорошо изученными изоформами Аβ и несколько отличаются друг от друга. Так, Аβ_1—42 более склонен к агрегации в фибрилы, чем Аβ_1—40 [23]. Аβ_1—40 характеризуется периваскулярным накоплением, тогда как Аβ_1—42 откладывается преимущественно в паренхиматозных бляшках [24]. Все агрегированные формы Аβ являются аномальными образованиями, запускающими самоподдерживающиеся процессы нейровоспаления, генерации активных форм кислорода (АФК) и гибели нейронов в финале. Вероятность формирования таких агрегированных форм быстро возрастает с ростом концентрации исходно нетоксичного мономерного Аβ. Увеличению его концентрации способствуют: избыточная экспрессия APP, повышенная активность γ-секретазы, формирующей Аβ из APP (BACE1), снижение протеолиза Аβ и нарушения работы дренажной системы, которая, как полагают, вносит наибольший вклад в регуляцию концентрации Аβ в мозге и в которой задействованы лимфатическая система, интрамуральный периваскулярный дренаж, а также система транспорта Аβ через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) в системный кровоток. В норме концентрация Аβ в сером веществе мозга достигает ~3 мкг/г, при БА это значение увеличивается примерно в 4 раза, главным образом, за счет доли Аβ_1—42. Периферический Аβ распределен неравномерно, его концентрация примерно в 3—100 ниже, чем в мозговой ткани [25].

Влияние ДГК на агрегацию/дезагрегацию β-амилоида в опытах in vitro

В одной из ранних работ было изучено влияние энантиомеров ДГК на агрегацию Аβ₄₂ [26]. Для этих целей использовали способность тиофлавина T флюоресцировать при связывании с агрегированными изоформами Аβ. Также был использован метод просвечивающей электронной микроскопии. Показано, что ДГК в дозе 50 мкМ значительно (~в 3 раза через 48 ч инкубации) уменьшал агрегацию Аβ₄₂, причем разницы между энантиомерами ДГК почти не было. Авторы делают вывод, что за антиагрегационную активность ДГК отвечают OH-группы 3’,4’, тогда как гидроксил в позиции 7 и стереохимия позиций 2 и 3 не играют роли [26]. В другой работе [27] были проведены более глубокие исследования влияния (+)ДГК на агрегацию Аβ₄₂. Было показано, что для антиагрегационной активности ДГК необходим кислород воздуха. Этот феномен связывают с автоокислением катехола в орто-хинон. Механизм формирования Аβ₄₂ фибрил хорошо укладывается в модель с фазами нуклеации (образование ядра или зародыша) и элонгации (распространения). Авторы работы [27] изучали, на какую фазу влияет ДГК. Было обнаружено, что он влияет на обе стадии. ДГК способен в микромолярном диапазоне концентраций (IC₅₀ ~33 мкМ) разрушать уже сформированное ядро (зародыш фибриллы) и препятствовать его укрупнению путем формирования слоистой структуры (β-листы). Авторы приходят к выводу, что ДГК подавляет агрегацию Аβ₄₂ путем химического взаимодействия орто-хинона с остатками лизина. В работе [28] уточнялся механизм взаимодействия ДГК с Аβ₄₂. Показано, что присоединение ДГК к Аβ₄₂ идет по механизму аза-реакции Михаэля при которой происходит нуклеофильная атака депротонированной аминогруппы остатка лизина в положении 16 (Lis16) на орто-хинон. В другой работе [6] изучили влияние ДГК на агрегацию изоформы Аβ₄₀. Показали, что ДГК более чем в 2 раза снижал флюоресценцию тиофлавина T (300 мкМ, 5 ч инкубации), что говорит о дезинтегрирующем влиянии ДГК на агрегаты из Аβ₄₀. Более низкие дозы ДГК (3 и 30 мкМ) также тормозили агрегацию Аβ₄₀, однако дезинтеграции не наблюдалось, происходило замедленное накопление агрегатов. Эти данные подтвердились при наблюдении за агрегацией Аβ₄₀ при помощи просвечивающей электронной микроскопии.

Защитные свойства ДГК в модели ЦАА

Влияние ДГК на патологию, связанную с накоплением Аβ, детально изучалось в модели ЦАА на мышах линии Tg-SwDI [6, 8]. Эти животные несут мутантный ген, стабильно экспрессирующий APP, и характеризуются преимущественно периваскулярным накоплением Аβ_1—40, что наблюдается при ЦАА. Отложения Аβ в гиппокампе, по-видимому, отвечают за нарушение пространственной референтной памяти у этих животных. При использовании водного теста Морриса было показано, что ДГК при хроническом введении полностью восстанавливал этот дефект. Накопление Аβ было ассоциировано с подъемом уровня глутамата, активацией оксидантного стресса и компенсаторным увеличением экспрессии генов, ответственных за его регуляцию. Под действием ДГК нормализовались уровни малонового диальдегида (МДА, индикатор перекисного окисления липидов), глутамата, падали уровни мРНК, отвечающих за синтез Cu/Zn- и Mn-содержащих супероксиддисмутаз (СОД), а также каталазы. Хроническое воздействие агрегированных форм Аβ также сопровождалось активацией микроглии. Гистохимически было обнаружено, что ДГК значительно понижал содержание клеток, несущих маркер активации глии (Iba-1). Этот эффект наблюдался в большей степени в гиппокампе, чем в коре мозга. Аналогичные результаты были обнаружены для TNF-α- и TREM2-позитивных клеток. Изучение маркеров воспаления на молекулярном уровне показало, что ДГК понижал в гиппокампе уровни экспрессии провоспалительных цитокинов, таких как TNF-α, IL-6, IL-1β. Также ДГК подавлял уровни экспрессии Iba-1, TREM2, ADAM10 и в небольшой степени sTREM2. Изучение корреляционных связей измеренных параметров показало, что TREM2 положительно коррелировал с ADAM10, TNF-α и IL-1β. Для коры обнаружена значимая положительная связь TREM2 с уровнем экспрессии Iba-1 и IL-6. Активация микроглии, оксидантный стресс и эксайтотоксичность глутамата связаны с усилением апоптоза в зоне гиппокампа и, по-видимому, вносят независимый вклад в нарушение функционирования нейронов, поскольку корреляционной связи между маркерами воспаления, уровнем глутамата и ПОЛ не выявлено. Защитные эффекты ДГК в модели ЦАА тесно ассоциированы с дезагрегирующим влянием этого соединения на Аβ. Так, в работе [6] проверяли содержание мономеров и олигомеров Аβ в целом мозге. Мозг мышей замораживали, гомогенизировали, центрифугировали, супернатант подвергали фиксации и тонкой фильтации (200 нМ), содержание мономеров и олигомеров определяли с использованием антител A11 (только олигомеры) и антител 6E10 (мономеры+олигомеры). Было обнаружено, что уровень олигомеров был почти в 4 раза меньше у животных, получавших ДГК (3%, 8 мес), по сравнению с контролем. Далее изучали влияние ДГК на содержание Аβ₄₀ и Аβ₄₂ в растворимой фракции гомогената мозга. Использовали иммунохимический метод. Было обнаружено, что общее содержание олигомеров в мозге достоверно падает [6]. В отношении отдельных регионов мозга было показано, что ДГК значимо понижал содержание Аβ₄₀ в гиппокампе и Аβ₄₂ в сенильных бляшках [8]. Сходные результаты были получены при изучении коры мозга этих же животных.

Таким образом, ДГК способен снижать содержание агрегированных форм Аβ не только in vitro, но и in vivo. Вместе с тем, как упомянуто выше, антиагрегантная активность ДГК в опытах in vitro проявляется в микромолярном диапазоне, в то время как концентрация ДГК в мозге почти в 1000 раз меньше, что явно недостаточно для дезинтеграции Аβ. Возникшее противоречие позволяет усомниться в прямом воздействии ДГК на паренхиму мозга. В связи с этим вероятной мишенью для ДГК могут служить сосуды головного мозга. Гипоксические проявления, связанные с периваскулярным отложением Аβ, характерны для ЦАА. Об этом свидетельствуют снижение мозгового кровотока и увеличение уровня экспрессии HIF1-α (фактор, индуцируемый гипоксией) [8]. Поскольку ДГК при хроническом введении полностью нормализовал эти параметры, прямая вовлеченность церебральных сосудов в механизм действия ДГК кажется несомненной.

Считают, что наибольший вклад в регуляцию концентрации Аβ в мозге вносит дренажная система [29, 30]. Важным звеном этой системы является мозговой эндотелий. Одинарный слой церебральных эндотелиальных клеток является первым барьером ГЭБ, отделяющим системный кровоток от паренхимы мозга. В зоне этих клеток концентрация ДГК, согласно данным фармакокинетики, может достигать концентраций, достаточных для проявления его антирадикальной и антиагрегаторной активностей. С другой стороны, эндотелий напрямую участвует в обмене Аβ между мозгом и периферией. За удаление Аβ из мозга отвечают АТФ-зависимый P-гликопротеин (P-gp), а также транспортный белок LRP1. RAGE-рецептор выполняет противоположную роль, поскольку, как полагают, запускает транслокацию Аβ с периферии в мозг [31]. Активные транспортные потоки через мозговой эндотелий требуют особенно много энергии. Большую часть этой энергии вырабатывают митохондрии. Если энергии не хватает (например, вследствие недостаточности митохондрий, нехватки Q₂ или глюкозы), то процесс удаления Аβ из мозга замедляется и, как следствие, может вызывать локальное накопление мономерного Аβ. Когда его концентрация становится достаточной для агрегации, зародыши токсичных олигомеров Аβ могут еще больше усугубить нехватку энергии, что замыкает порочный круг и провоцирует апоптоз эндотелия. Так, показано, что изоформа Аβ₄₀-Q22 в дозе 10 мкМ вызывала генерацию АФК и повреждение митохондрий мозгового эндотелия с последующей утечкой из них цитохрома C и активацией каспазы-9 [32]. Защитные эффекты ДГК в отношении митохондрий в различных модельных системах хорошо известны и часто приписываются его антирадикальным свойствам [33—35]. Вместе с тем важным звеном в механизме защитного действия ДГК на мозговой эндотелий может оказаться его прямое блокирующее воздействие на карбоангидразу. Так, показано, что ингибиторы этого фермента, такие как метазоламид и ацетазоламид, защищают митохондрии эндотелия от воздействия на них токсичного Аβ₄₀-Q22 [32]. Следует отметить, что карбангидраза является для ДГК одной из немногих молекулярных мишеней, где он проявляет активность в наномолярной концентрации (K_i ~20 нМ для изоформ CA-I и CA-II) [36]. Другим источником энергетического голодания эндотелия может служить нарушение в работе глюкозного транспортера (GLUT1), который, как показано, имеет пониженный уровень экспрессии в мозговых капиллярах при накоплении Аβ [37, 38]. В модели ЦАА хроническое введение ДГК полностью восстанавливало работу GLUT1 [8]. Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о способности ДГК нормализовать энергетический обмен мозгового эндотелия в моделях БААЗ. Вместе с тем для более глубокого понимания механизма действия ДГК требуется обратить внимание на периферический пул Аβ.

ДГК как системный нейропротектор

ДГК является естественным, факультативным компонентом пищи растительного происхождения. Следовательно, первой мишенью в организме, с которой взаимодействует этот полифенол, является желудочно-кишечный тракт. Всасывание ДГК наиболее интенсивно происходит в тонком кишечнике, где расположена основная часть микробиома и который также является объектом воздействия ДГК. Так, ДГК обладает антибактериальными, противовирусными и фунгицидными свойствами [1, 39—40]. Также хорошо известно, что кишечник, микробиом и ЦНС связывают каналы взаимного влияния, в совокупности именуемые «кишечно-мозговой осью». Существует тесная ассоциативная связь между нарушением работы кишечника и психическими расстройствами, в том числе БА [41—44]. Механизм этой связи в значительной мере связан с феноменом «дырявой кишки» (ДК), т.е. повышением проницаемости кишечного барьера из энтероцитов для патогенов. Поскольку ДГК защищает этот барьер, способствуя более тесному смыканию энтероцитов и подавляя воспалительный процесс в кишечнике [15, 45, 46], можно заключить, что потенциально ДГК способен оказывать защитное действие на мозг, еще даже не проникнув в системный кровоток. Даже если некоторое количество токсинов все же проникает в кровоток в результате повреждения кишечного барьера, то ДГК способен быстро подавить системную воспалительную реакцию, что показано, например, в отношении бактериального липополисахарида [47, 48].

Есть веские основания полагать, что патологически измененный микробиом в сочетании с ДК способен служить индуктором для превращения Аβ из мономера в токсичные олигомеры [49—51]. Механизм этого явления связывают с возможностью межвидового взаимодействия человеческого Аβ с бактериальными белками, несущими прионоподобные фрагменты [52—54]. С другой стороны, как показано в модели БА на мышах, избыточный синтез Аβ способен изменять состав микробиома так, что будучи трансплантированным стерильным мышам, вызывает у последних признаки БА [55]. Эти факты свидетельствуют, что, по-видимому, между периферическим Аβ и микробиомом существуют двунаправленные связи. В связи с этим главной ареной защитного (антиагрегантного) действия ДГК следует признать все периферические ткани и органы, богатые Аβ, включая системный кровоток. Более того, поскольку олигомеры Аβ способны к самовоспроизведению, т.е. могут «заражать» здоровую ткань мозга подобно прионам [56], то можно предположить, что этиология БААЗ, по крайней мере, в части случаев, имеет периферический след, особенно в случае хронического воспалительного процесса, провоцирующего повреждение ГЭБ [57]. Так, эпидемиологические данные указывают на высокую степень ассоциации между БААЗ и системными заболеваниями, сопровождающимися вялотекущим воспалительным процессом. Например, факторами риска развития БААЗ являются такие заболевания, как сахарный диабет 2-го типа, ожирение среднего возраста, атеросклероз, хронические интоксикации различного генеза, а также сердечно-сосудистые заболевания [58—63]. При всех этих системных заболеваниях ДГК при хроническом применении в физиологических концентрациях проявляет защитный эффект [1, 2, 35, 64, 65]. Другим важнейшим фактором риска развития БААЗ является возраст. С возрастом число пациентов с БААЗ прогрессивно увеличивается — почти в 10 раз в диапазоне от 65 до 85 лет. Известно, что с возрастом также снижается активность митохондрий, в том числе митохондрий мозгового эндотелия, отвечающих за дренаж Аβ. В опытах на стареющих животных было показано, что ДГК при хроническом приеме (6 нед, ~2 мг/кг) противодействует снижению функциональной активности митохондрий скелетных мышц [33]. Если эту активность принять в качестве меры биологического возраста, то хронический прием ДГК следует связать со снижением риска развития БААЗ.

Заключение

Таким образом, представленные данные указывают на то, что защитное действие ДГК в отношении нейронов головного мозга обусловлено его прямым воздействием не столько на мозговую паренхиму, сколько на весь организм в целом. Этот вывод согласуется с данными по фармакокинетике. Вероятно, ДГК и подобные ему соединения следует выделить в отдельную группу и предложить для них новый термин — «системный нейропротектор», чтобы подчеркнуть плейотропный механизм действия на уровне всего организма. Несомненно, что биологически-активные добавки на основе ДГК с повышенной биодоступностью будут полезны для профилактики и лечения начальных стадий БААЗ.

Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.