В настоящее время более 55 млн человек во всем мире страдают деменцией, при этом каждый год регистрируется около 10 млн новых случаев. Болезнь Альцгеймера (БА) является наиболее распространенной формой деменции и может быть причиной 60—70% ее случаев [1]. Примерно 1 из 9 человек в возрасте 65 лет и старше в США страдают БА [2]. Важно, что БА является смертельным заболеванием. Продолжительность жизни пациентов с БА относительно короткая. Исследования показывают, что люди в возрасте 65 лет и старше живут в среднем от 4 до 8 лет после постановки диагноза деменции при БА, однако некоторые живут до 20 лет [3]. На продолжительность жизни пациентов с БА влияет множество факторов. Они включают возраст на момент постановки диагноза, степень прогрессирования заболевания, наличие у пациента других заболеваний, таких как сахарный диабет или заболевание почек, а также наличие смешанной деменции. Безусловно, наибольший интерес вызывают различная скорость прогрессирования когнитивного снижения и возможность влияния на нее.
Несмотря на огромное количество исследований, посвященных в последнее время БА, вопрос о патогенезе заболевания остается открытым. Существует довольно много гипотез патогенеза БА, такие как амилоидный каскад, гиперфосфорилирование тау-белка, нейровоспаление, окислительный стресс, митохондриальная дисфункция, холинергическая и сосудистая. При этом они не являются взаимоисключающими, и все механизмы играют определенную роль в развитии БА [4].
БА является гетерогенным и многофакторным сложным нейродегенеративным заболеванием, которое характеризуется аномальной агрегацией внеклеточных β-амилоидных бляшек и внутриклеточных нейрофибриллярных клубков. Это приводит к гибели нейрональных клеток, синаптической деградации и глиозу (микроглия и астроциты), что еще больше усугубляет нейродегенерацию и в итоге приводит к деменции. В гомеостатических условиях микроглия играет преимущественно защитную роль, включая фагоцитоз и деградацию β-амилоида, секрецию противовоспалительных цитокинов и ремоделирование нейронной сети. Однако чрезмерное отложение β-амилоида и гибель нейрональных клеток могут вызвать мощную пронейровоспалительную активацию микроглии, что приводит к высвобождению провоспалительных цитокинов и комплемента. Возникает порочный круг нейропатологии, провоспалительной глиальной активации и чрезмерной нейродегенерации. Этот патологический цикл влияет на целостность гематоэнцефалического барьера и лимфодренаж, что приводит к поступлению иммунных клеток (например, T-клеток) в паренхиму мозга и пограничную зону, активации иммунных клеток, накоплению антигенов [5].
Воспаление все чаще признается ключевым игроком в патогенезе БА. Концепция воспаления при БА подтверждается многочисленными доказательствами как в экспериментальных моделях, так и в клинических исследованиях. Было показано, что у пациентов с БА повышен уровень провоспалительных маркеров, таких как цитокины, хемокины и белки острой фазы воспаления в мозге и цереброспинальной жидкости, что указывает на наличие хронического воспалительного процесса [6]. В то же время, хотя наличие воспаления в тканях мозга у пациентов с БА было подтверждено, неясно, является ли воспаление причиной или следствием этого заболевания, поскольку воспаление представляет собой неспецифическую реакцию, которая возникает при многих заболеваниях. Более того, некоторые исследования предполагают, что воспаление возникает на ранних стадиях заболевания и способствует развитию патологии, в то время как другие — предполагают, что это вторичная реакция на повреждение нейронов. Если предполагать, что нейровоспаление является причинным агентом в развитии БА, а изменение иммунной системы происходит раньше, до появления клинических симптомов БА, то понимание процессов воспаления может дать ключ к разработке патогенетической терапии.
Нейродегенерация опосредуется воспалительными и нейротоксическими медиаторами, такими как интерлейкин (IL)-1β, -6, -8, -33, фактор некроза опухоли-альфа (TNF-α), лиганд 2 хемокина (мотив CC, CCL2), CCL5, матриксная металлопротеиназа (ММП), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), фактор созревания глии, вещество P, активные формы кислорода, активные формы азота, гистамин и протеазы, опосредованные тучными клетками, рецептор-2, активируемый протеазой (PAR-2), CD40, CD40L, CD88, повышение внутриклеточного уровня Ca2+и активация митоген-активируемых протеинкиназ (MAPK) и ядерного фактора каппа-B (NF-kB) [7]. При этом роль ряда цитокинов остается не до конца понятной, данные об их статусе при БА носят весьма противоречивый характер.
Цель исследования — изучение цитокинового статуса у пациентов с БА.
Материал и методы
Исследование проводилось на базе ФГБУ «Федеральный центр мозга и нейротехнологий» ФМБА России и ФГБУ «Центр стратегического планирования» ФМБА России. В основную группу пациентов с подтвержденным диагнозом БА были включены 23 больных (6 мужчин, 17 женщин, средний возраст 69 [66,2; 77,5] лет). В качестве группы контроля были использованы данные 163 условно здоровых лиц (данные архива ФГБУ ЦСП ФМБА России). Группы были сопоставимы по полу и возрасту.
Критерии включения: возраст от 40 до 90 лет; родной язык — русский; ясное сознание; отсутствие грубых нарушений двигательных или чувствительных функций, речевых нарушений, декомпенсации хронических заболеваний и других клинически значимых неврологических патологий, психических расстройств в анамнезе, абсолютных противопоказаний к проведению МРТ головного мозга, тревожно-депрессивных расстройств по данным госпитальной шкалы тревоги и депрессии. Все обследуемые подписали информированное согласие на участие в исследовании.
Выполнялся мультиплексный иммуноферментный анализ (технология xMAP) на мультиплексном проточном флюориметре FlexMap 3D («Luminex Corporation», США) с использованием набора реагентов «Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Kit» (США). Образцы были проанализированы по цитокинам: эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста фибробластов (FGF-2), Eotaxin, трансформирующий фактор роста (TGF-α), гранулоцитарный и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий факторы (G-CSF, GM-CSF), Flt-3L, Fractalkine, интерферон (IFN)-α2, IFN-γ, GRO, IL-10, -12p40, -12p70, -13, -15, -17A, -1RA, -1α, -9, -1β, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -10, sCD40L, моноцитарный хемоаттрактантный белок (MCP)-3, -1, макрофагальный хемокин (MDC), макрофагальный воспалительный белок (MIP)-1a, MIP-1b, факторы некроза опухоли (TNF-α, TNF-β), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF). Забор крови для выполнения лабораторного анализа осуществлялся утром натощак из периферической вены с помощью вакуумной системы в вакуумные пробирки Vacutest с антикоагулянтом К3ЭДТА (4 мл).
Статистический анализ полученных клинических данных выполняли средствами программы STATISTICA for Windows (версия 12). Результаты представлены в виде медианных концентраций в пг/мл для группы условно здоровых и группы БА и диапазона между 10-м и 90-м перцентилями для образцов из группы условно здоровых. В качестве нормативных для ряда показателей приводятся значения, используемые в клинической практике [8—12].
Результаты
В таблице представлены полученные результаты.
Концентрации цитокинов в обследованных группах, пг/мл
Цитокин | Группа БА, Me (n=23) | Группа контроля, Me (n=163) | Диапазон между 10-м и 90-м перцентилями для группы контроля | Значения, используемые в клинической практике |
EGF | 26 | 20 | 3—116 | — |
FGF-2 | 100* | 58 | 7—192 | — |
Eotaxin | 214* | 96 | 55—179 | — |
TGF-α | 3,1 | 3,0 | 1,9—3,2 | — |
G-CSF | 75* | 3,8 | 2,3—28,7 | — |
Flt-3L | 20,6* | 2,7 | 2,0—4,1 | — |
GM-CSF | 10,7* | 3,0 | 3,0—3,1 | — |
Fractalkine | 102* | 14 | 3,4—122 | — |
IFN-α2 | 26,7* | 3,2 | 2,0—9,9 | <10 |
IFN-γ | 7,1* | 3,2 | 2,4—6,3 | <10 |
GRO | 829 | 970 | 451—2427 | — |
IL-10 | 4,0 | 2,7 | 2,5—3,2 | <31 |
MCP-3 | 26* | 7 | 5,1—106 | — |
IL-12P40 | 7,5 | 4,0 | 3,5—9,3 | — |
MDC | 701 | 811 | 492—1630 | — |
IL-12p70 | 3,6 | 3,1 | 2,7—3,4 | — |
IL-13 | 2,9 | 1,4 | 1,0—12 | — |
IL-15 | 2,1 | 2,5 | 1,4—2,9 | — |
sCD40L | 692 | 1715 | 281—5264 | — |
IL-17A | 2,3 | 3,0 | 2,2—16,0 | — |
IL-1RA | 41,9* | 3,6 | 3,2—97 | — |
IL-1α | 3,5 | 4,1 | 3,2—21 | <5 |
IL-9 | 4,4 | 3,5 | 2,5—3,5 | — |
IL-1β | 2,5 | 2,8 | 1,2—3,2 | <5 |
IL-2 | 2,6 | 2,7 | 1,2—3,1 | — |
IL-3 | 3,0 | 2,4 | 1,0—3,0 | — |
IL-4 | 47* | 12 | 4—160 | — |
IL-5 | 2,3 | 2,9 | 1,5—3,7 | — |
IL-6 | 2,9 | 3,0 | 2,8—8,2 | <7 |
IL-7 | 3,7 | 2,9 | 2,8—6,1 | — |
IL-8 | 9,5* | 4,1 | 2,6—15,0 | <62 |
IP-10 | 353 | 266 | 146—476 | — |
MCP-1 | 358 | 426 | 236—864 | — |
MIP-1a | 3,3 | 3,1 | 2,9—3,2 | — |
MIP-1b | 34 | 31 | 10—72 | — |
TNF-α | 14,6* | 4,5 | 3,1—13,9 | <8,1 |
TNF-β | 7,7 | 3,2 | 2,9—17,6 | — |
VEGF | 28 | 45 | 8—171 | — |
Примечание. EGF — эпидермальный фактор роста, FGF — фактор роста фибробластов, TGF — трансформирующий фактор роста, G-CSF, GM-CSF — гранулоцитарный и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, Flt-3L — Fractalkine, IFN — интерферон, IL— интерлейкин, MCP-3 — моноцитарный хемоаттрактантный белок, MDC — макрофагальный хемокин, MIP — макрофагальный воспалительный белок, TNF — фактор некроза опухоли, VEGF — фактор роста эндотелия сосудов. * — отличия статистически значимы при сравнении между группами БА и контроля, p<0,05.
Медианные значения концентрации цитокинов FGF-2, Eotaxin, G-CSF, Flt-3L, GM-CSF, Fractalkine, IFN-α2, IFN-γ, MCP-3, IL-1RA, -4, -8, TNF-α в группе БА были выше более чем в 2 раза, по сравнению с группой контроля. При этом медианные значения концентрации цитокинов Eotaxin, G-CSF, GM-CSF, Flt-3L, IFN-α2, IFN-γ, TNF-α в группе БА превышали 90-й перцентиль в группе контроля.
По цитокинам EGF, TGF-α, GRO, IL-12p40, MDC, IL-13, -15, -17A, -1α, -1β , -2, -3, -5, -6, -7, sCD40L, IP-10, MCP-1, MIP-1b, TNF-β, VEGF не было выявлено значимых различий между медианными значениями в группах БА и контроля. Медианные значения по данным цитокинам в группе БА не превышали 90-й перцентиль в группе контроля. Медианное значение уровня цитокинов IL-12p70, -10, -9, MIP-1a в группе БА превышало 90-й перцентиль в группе контроля, однако медианное значение по данным цитокинам в группе БА несущественно превышало медианное значение в группе контроля (менее чем в 2 раза), данный разброс может быть вызван ограничением методики измерений.
Одним из самых значительных показателей было повышение TNF-α (рис. 1). В группе БА значимо больше образцов, у которых значение TNF-α выше 8,1 пг/мл, по сравнению с группой контроля (p=0,003, тест Фишера).TNF-α считается ключевой провоспалительной молекулой, участвующей в возникновении и потенциальном прогрессировании БА, а также других нейродегенеративных расстройств [13]. В мозге TNF-α физиологически участвует в регуляции функции гематоэнцефалического барьера, синаптической пластичности, глутаматергической передаче и взрослом нейрогенезе [14, 15]. При развитии нейродегенеративной патологии TNF-α усиливает преобразование APP в патологические формы β-амилоида за счет как повышения уровня β-секретазы, так и действия в качестве мощного стимулятора активности γ-секретазы. В свою очередь наличие бляшек β-амилоида вызывает активацию микроглии и астроглии, что может дополнительно усилить выработку и высвобождение TNF-α и других провоспалительных цитокинов; это может создавать самораспространяющийся и самоподдерживающийся цикл [16]. Провоспалительный цитокин TNF-α стимулирует продукцию IL-1, -6, -8, IFN-γ активирует лейкоциты. Увеличение уровня IL при БА показано в большом количестве исследований. В частности, продемонстрировано увеличение IL-1α, -1β, -4, -6, -10, -12p70, -10 у пациентов с БА и болезнью Паркинсона по сравнению с контрольной группой [17].
Рис. 1. Концентрация TNF-α в группах БА и контроля.
TNF — фактор некроза опухоли. Здесь и на рис. 2-7: БА — болезнь Альцгеймера.
В нашей работе было выявлено повышение концентрации IL-1RA, -4, -8 (рис. 2). Отмеченное повышение титров цитокина IL-1RA в отсутствие повышенного титра цитокинов IL-1α и -1β может говорить о фоновом или остаточном (после заболевания) воспалительном процессе. Нами было установлено значимое повышение уровня IFN-α2 и IFN-γ при БА (рис. 3). Нормальным для IFN-α2 и IFN-γ является значение <10 пг/мл. В группе БА было значимо больше образцов, у которых значение IFN-α2 и IFN-γ >10 пг/мл, чем в группе контроля (p для IFN-α2 — 9,68·10-16, для IFN-γ — 5,23·10-6, тест Фишера). В литературе также имеются данные о том, что при БА повышается уровень IFN, который коррелирует с тяжестью заболевания и активацией комплемента [18]. Недавние исследования показали, что IFN-γ играет уникальную роль в активации микроглии. Прайминг IFN-γ приводит к пролиферации (микроглиоз), усилению элиминации синапсов и умеренному высвобождению оксида азота, достаточному для нарушения синаптической передачи, активности гамма-ритма и когнитивных функций. Более того, IFN-γ играет ключевую роль в приведении микроглии, активированной Toll-подобным рецептором, в нейротоксические фенотипы, которые вызывают энергетический и окислительный стресс, тяжелую сетевую дисфункцию и гибель нейронов [19].
Рис. 2. Концентрация IL-1RA, -4, -8 в группах БА и контроля.
Здесь и на рис. 3: IL — интерлейкин.
Рис. 3. Концентрация IFN в группах БА и контроля.
IFN — интерферон.
Нами было установлено значимое увеличение содержания FGF-2 при БА (рис. 4). FGF-2 важен для развития и поддержания функции ЦНС. Исследования показали, что FGF-2 является нейропротективным фактором против различных повреждений in vivo и in vitro. В эксперименте было показано нейропротективное действие FGF-2 против нейротоксичности, вызванной β-амилоидом в первично-культивируемых нейронах гиппокампа [20]. FGF может обеспечивать трофическую поддержку, усиливать пролиферацию и предотвращать апоптоз, действуя против активации митохондриального пути апоптоза. Считается, что он оказывает ангиогенное, митотическое и нейротрофическое действие [21]. Учитывая такие механизмы действия, его значимое повышение у больных БА свидетельствует об активном включении защитных механизмов.
Рис. 4. Концентрация FGF-2 в группах БА и контроля.
FGF — фактор роста фибробластов.
Хемокины — семейство хемоаттрактантов, которые играют жизненно важную роль в миграции клеток из крови в ткани и наоборот, а также в индукции движения клеток в ответ на химический (хемокиновый) градиент с помощью процесса, известного как хемотаксис. Кроме того, недавно было показано, что хемокины выполняют функцию нейромодуляторов в нервной системе. Проведенные исследования показали, что концентрация двух хемокинов (MCP-1 и Eotaxin-1) коррелирует с более выраженным ухудшением памяти при умеренном когнитивном снижении и БА [22]. В недавнем исследовании было показано, что эти хемокины способны выступать в качестве биомаркеров для выявления здоровых субъектов и субъектов с умеренным когнитивным снижением и БА [23]. Это согласуется с данными другого исследования, подтвердившего, что содержание MCP-1 и Eotaxin-1 может оптимально дифференцировать не только БА и пожилых лиц (AUC: 0,79), но и БА и умеренные когнитивные нарушения [24].
Нами было установлено статистически значимо более высокое содержание Eotaxin. Также в нашей выборке не было получено значимых различий в MCP-1, в то время как содержание MCP-3 достоверно отличалось (рис. 5). Опубликованный ранее метаанализ выявил повышенные концентрации воспалительных биомаркеров, таких как C-реактивный белок, IL-1b, -2, -6, -8, -12, -18, MCP-1, MCP-3 у больных БА [25].
Рис. 5. Концентрация Eotaxin и MCP-3 в группах БА и контроля.
MCP — моноцитарный хемоаттрактантный белок.
Было проведено специальное исследование влияния системных воспалительных регуляторов на БА в рамках двунаправленного менделевского рандомизированного дизайна. Генетические ассоциации с БА были получены из самого крупного и современного исследования полногеномного поиска ассоциаций (GWAS), а с регуляторами воспаления — из двух недавних GWAS по человеческому протеому и цитокинам. Было получено, что БА предположительно связана с пятью системными воспалительными регуляторами, такими как FRF, G-CSF, INF-γ, IL-13 и -7 [26].
Нами установлено значимое увеличение как G-CSF, так и GM-CSF у пациентов с БА (рис. 6). Данные литературы указывают на нейропротективную роль G-CSF: его влияние на мобилизацию гемопоэтических стволовых клеток, антиапоптоз, нейрональную дифференциацию, ангиогенез и противовоспалительное действие в животных моделях неврологических расстройств. G-CSF экспрессируется многочисленными типами клеток, включая нейрональные, иммунные и эндотелиальные. G-CSF высвобождается аутокринным образом и связывается со своим рецептором G-CSF-R, который далее активирует многочисленные пути передачи сигналов, включая PI3K/AKT, JAK/STAT и MAP-киназу, и тем самым способствует выживанию нейронов, пролиферации, дифференцировке, мобилизации гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток. Экспрессия рецепторов G-CSF (G-CSF-R) в различных областях мозга и их повышение в ответ на повреждение мозга указывают на аутокринный защитный сигнальный механизм G-CSF путем ингибирования апоптоза, воспаления и стимуляции нейрогенеза [27]. GM-CSF представляет собой нейрональный лиганд, который может противодействовать запрограммированной гибели клеток, уменьшать амилоидную нагрузку на мозг и обращать вспять когнитивные нарушения в модели БА [28, 29]. Способность GM-CSF снижать нейрональный апоптоз была подтверждена в экспериментальной модели БА [30].
Рис. 6. Концентрация G-CSF и GM-CSF в группах БА и контроля.
G-CSF, GM-CSF — гранулоцитарный и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий факторы.
Еще одним показателем, полученным при сравнении групп БА и контроля, было увеличение Fractalkine (рис.7). Fractalkine является маркером активности воспалительных процессов разного генеза. Fractalkine — уникальный хемокин, который экспрессируется и секретируется нейронами и снижает экспрессию провоспалительных генов. Сигнализация Fractalkine в ЦНС притупляет активацию микроглии, снижая выработку провоспалительных цитокинов, таких как IL-1β, -6 и TNF-α [31]. В то же время в других работах показаны противоположные эффекты. Экспрессия Fractalkine как в гиппокампе, так и в коре головного мозга снижена в мозге при БА, по сравнению с контролем [32]. Показана связь уровня Fractalkine с когнитивными функциями [33]. Сигнализация Fractalkine/CX3CR1 является важным путем, который регулирует взаимодействие между микроглией и нейронами, участвует в нейрогенезе у взрослых [34].
Рис. 7. Концентрация Fractalkine в группах БА и контроля.
Заключение
Таким образом, изучение цитокинового статуса у пациентов с БА позволило выявить значимые изменения, которые затрагивали как увеличение концентрации провоспалительных цитокинов, так и активацию нейропротективных механизмов. Данное исследование имеет определенные ограничения, связанные с числом пациентов. Необходимо продолжение исследований.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.