Согласно амилоидной гипотезе болезни Альцгеймера (БА), причина развития нейродегенеративных изменений заключается в прогрессирующем образовании в головном мозге патологических форм бета-амилоида (Aβ), разрушении цитоскелета нейронов вследствие гиперфосфорилирования нейрофибрилл и высвобождении тау-белка. В современной клинико-патогенетической классификации в течении БА в зависимости от степени выраженности когнитивных нарушений выделяют три периода: легкой, умеренной и тяжелой деменции, при этом каскад патологических изменений в головном мозге при БА начинается за 15—20 лет до клинического дебюта деменции [1—4]. Поэтому выделяют также два периода, предшествующих ее развитию (додементные стадии): это асимптомная стадия, в которой происходит каскад патологических процессов, в том числе опосредованных нейровоспалением с формированием патологических агрегатов и их накоплением в ЦНС, и преклиническая, соответствующая стадии умеренных когнитивных расстройств амнестического типа (УКРа). Именно эти стадии представляют наибольший интерес для изучения в целях определения подходов к патогенетической терапии заболевания. Современные достижения в поиске биомаркеров, характеризующих наличие специфических патологических изменений, таких как повышение тау-белка и снижение Aβ в цереброспинальной жидкости, а также нейровизуализационных маркеров, основанных на оценке степени выраженности и характера нейродегенеративного процесса, в настоящее время позволяют диагностировать БА на ранних стадиях, однако применяемые методики диагностики имеют целый ряд недостатков. В большинстве случаев они требуют значительного времени, являются дорогостоящими и нередко инвазивными. В связи с этим необходим поиск простых, безопасных и информативных биомаркеров для диагностики БА на самых ранних стадиях, что позволит своевременно назначить терапию и в перспективе модифицировать прогрессирование когнитивных нарушений на недементных стадиях [2—6].

Несмотря на свое периферическое расположение, сетчатка глаза является частью ЦНС за счет общего эмбриологического происхождения и поэтому может отражать характерные для БА патологические изменения [7]. В настоящее время активно изучаются толщина отдельных ее слоев и изменения в сосудистой системе. Одним из направлений является поиск отложений Aβ и тау-белка в различных структурах глаза, например в хрусталике, роговице и даже слезной жидкости [8, 9]. Однако с учетом особенностей послойного строения сетчатки, наличия гематоретинального барьера и сосудистой сети, схожей с таковой в головном мозге, поиск патологических агрегатов тау-белка и Aβ является наиболее перспективным именно в сетчатке глаза.

В нескольких небольших зарубежных исследованиях сообщалось о возможности визуализации отложений Aβ в сетчатке in vivo с помощью куркумина — полипотентного полифенола с флюоресцентными свойствами, наличие которого в агрегатах Aβ было подтверждено и при аутопсии [10—15]. В дальнейшем были получены положительные результаты при исследовании популяции пациентов с преимущественно УКРа для оценки корреляции степени амилоидной нагрузки сетчатки с демографическими, когнитивными показателями и начальными проявлениями атрофических изменений при нейровизуализации, а также описана тропность отложения Aβ вдоль артериол сетчатки [16]. Куркумин относится к биологически активным веществам, его применение безопасно. Традиционно используемый в качестве красителя и специи в различных блюдах восточной и индийской кухни, включая карри, куркумин широко применяется в пищевых добавках, косметике и фармацевтике [17—19]. Многие исследования подтверждают полезные лечебные эффекты куркумина, описаны его антиоксидантные, противовоспалительные и противораковые свойства, а также его профилактическая роль в предупреждении развития БА и других нейродегенеративных заболеваний [20, 21]. В тканях куркумин демонстрирует естественную флюоресценцию с пиковыми длинами волн возбуждения и эмиссии 420 и 520 нм соответственно. Он имеет химическую структуру, сходную с Конго красным и с высокой аффинностью и специфичностью связывается с Aβ [16].

Наличие отложений Aβ в сетчатке глаза на сегодняшний день является спорным, поскольку ряд исследователей не смогли гистологически подтвердить его наличие у пациентов с деменцией [9, 21]. Вероятно, это связано с расхождением в методике выполнения самой процедуры или же низкой биодоступностью куркумина. В настоящее время среди биологически активных добавок имеется несколько форм куркумина, в том числе с фосфолипидной нагрузкой, что позволяет повысить его проникающую способность через как гематоретинальный, так и гематоэнцефалический барьер. Однако до настоящего времени сообщалось только об успешном применении препарата (Longvida) для визуализации амилоида в сетчатке с помощью конфокальной сканирующей лазерной офтальмоскопии (СЛО) [12, 15, 16].

Цель исследования — поиск эффективного метода ранней диагностики БА и УКРа с применением СЛО как безопасного и широкодоступного метода исследования.

Материал и методы

В исследовании приняли участие 45 пациентов, из них 20 — имели вероятный диагноз БА, который был установлен на основании критериев NINCDS-ADRDA и NIA-AA (National Institute of Aging/Alzheimer’s Association) [7, 13], 10 — диагноз УКРа согласно критериям R. Petersen и J. Touchon [7, 22] и 15 лиц в возрасте от 54 до 80 лет были без когнитивных нарушений.

Критерии включения: наличие подписанного информированного согласия; возраст от 55 до 85 лет; наличие УКРа по результатам нейропсихологического тестирования; признаки типичного для БА и УКРа поражения медиобазальных отделов височной доли по данным МРТ.

Критерии невключения: психические заболевания или нарушения сознания и поведения у пациентов, которые не позволяют провести запланированные исследования в полном объеме; наличие острого нарушения мозгового кровообращения или его последствий с повреждением стратегически важной для когнитивных функций зоне; грубые двигательные и/или чувствительные нарушения; наличие других клинически значимых неврологических заболеваний (рассеянный склероз, опухоли головного мозга, нейроинфекции, нейродегенеративные и дисметаболические нарушения и др.); наличие сопутствующих соматических заболеваний в стадии декомпенсации; глаукома, а также любая патология глаза, приводящая к нарушению прозрачности оптических сред (включая катаракту сильнее степени 1 по Lens Opacity Classification System scale III).

Все участники исследования прошли нейропсихологическое тестирование, включающее краткую шкалу оценки психического статуса (MMSE), тест свободного и ассоциированного селективного распознавания (FCSRT), тест рисования часов (ТРЧ), оценку по клинической рейтинговой шкале деменции (CDR), все пациенты с УКРа имели 0,5 баллов по шкале CDR. Для подтверждения диагноза, а также для определения соответствия критериям включения/невключения всем обследованным выполнялась МРТ головного мозга с последующей оценкой атрофических изменений по ВАШ: глобальной (диффузной) кортикальной атрофии по шкале Pasquier (GCA), атрофии медиальных отделов височной доли (MTA) с поправкой на возраст для каждого участника и всей группы в целом.

Все офтальмологические процедуры были проведены в условиях медикаментозного мидриаза. Все пациенты прошли стандартный офтальмологический осмотр на начальном этапе.

В первой контрольной точке всем пациентам была выполнена СЛО на приборе F-10 («NIDEK», Япония). СЛО — один из методов визуализации в офтальмологии, основанный на построении растрового изображения путем быстрого сканирования глазного дна лазерным лучом по единственной оси со смещением в ортогональном направлении. Для детекции связанного с Aβ куркумина СЛО проводили с длиной волны сканирующего луча 490 нм. Предыдущие исследования показали, что верхняя височная область сетчатки подвергается дегенерации при БА в большей степени [11, 13, 15, 18], поэтому в первой контрольной точке фиксировали отдельные участки сетчатки по ходу верхней височной аркады, преимущественно с височной стороны от макулы, размером 750×750 пикселей. Во второй контрольной точке целью СЛО было получить изображения тех же зон для последующего анализа кратности увеличения площади и количества отдельных частиц с пиковой яркостью (ЧПЯ). Срок между первой и второй контрольными точками составил 10 дней, в течение которых пациент перорально принимал куркумин (Longvida, «Now foods», США) по 400 мг 1 раз в день. Повторную СЛО проводили через 4 ч в день последнего приема куркумина (рис. 1). Изображения с депозитами одной локализации были экспортированы из программного обеспечения прибора и загружены в программу для обработки изображений ImageJ (NIH, США). Изображения, полученные в разные контрольные временные точки, полуавтоматически при помощи данной программы были нормализованы по яркости фона (в качестве референсного был выбран участок глазного дна без сосудов и локальных изменений пигментации), а также обработаны при помощи фильтра Гаусса и линейного фильтра для последующего анализа частиц. Для анализа были выбраны частицы, имеющие максимальную пиковую яркость по всей площади изображения за пределами сосудов. Произведена оценка в пикселях их площади и количества [10—12, 15, 18]. В итоговый анализ были включены данные обработки изображений сетчатки одного глаза каждого из пациентов, выбранные по качеству сигнала оптической компьютерной томографии и визуализации СЛО (либо по признаку наличия депозитов, если они были обнаружены только в одном глазу). На втором этапе для каждого участника был рассчитан процент изменения данных показателей для последующего статистического анализа (см. рис. 1).

Рис. 1. Этапы обработки изображения и оценки степени флюоресценции сетчатки за счет расчета площади и количества частиц с пиковой яркостью (ЧПА) после приема куркумина.

Пациент Р., 71 года, болезнь Альцгеймера. Продемонстрированы этапы выделения и оценки площади ЧПЯ до и после приема куркумина. Выделены ЧПЯ в двух контрольных точках, продемонстрировано увеличение количества (175%) и площади частиц (226%).

Статистический анализ проведен с использованием методов непараметрической статистики (критерий Манна—Уитни для двух независимых выборок), корреляционные взаимозависимости оценивались с применением ранговой корреляции Спирмена.

Результаты

Всего в исследовании приняли участие 45 пациентов (оценена сетчатка 63 глаз). Участники всех трех групп достоверно не различались по полу и возрасту. У пациентов с БА по результатам нейропсихологического тестирования выявлены более низкие баллы в сравнении с контрольной группой, а для УКРа наиболее чувствительным оказался тест FCSRT, позволяющий оценивать кратковременную вербальную память, что было ожидаемо. По данным МРТ головного мозга выявлены признаки атрофии височной (медиальной, базальной и латеральной) и теменной (медиальной и латеральной) коры у пациентов основной группы. Полученные результаты представлены в табл. 1.

Таблица 1. Сравнение выраженности интеллектуально-мнестических нарушений и результатов оценки выраженности церебральной атрофии по данным МРТ у обследованных пациентов, баллы, Me [Q₂₅; Q₇₅]

Примечание. Здесь и в табл. 2, 3: БА — болезнь Альцгеймера, УКР — умеренное когнитивное расстройство, ЧПЯ — частицы с пиковой яркостью. Здесь и в табл. 3: MMSE — краткая шкала оценки психического статуса, FCSRT — тест свободного и ассоциированного селективного распознавания, ТРЧ — тест рисования часов, CDR — клиническая рейтинговая шкала деменции, MTA — шкала атрофии медиальных отделов височной доли, GCA — шкала глобальной кортикальной атрофии.

В исследовании были выбраны тесты с наибольшей чувствительностью к выявлению УКРа, поэтому ожидаемо при их выполнении участники с БА и УКРа имели более низкие баллы, по сравнению с группой контроля. Так как целью данной работы был поиск метода ранней диагностики БА, основная масса пациентов с БА имели легкую деменцию. Более того, реализация офтальмологического осмотра требует от пациентов выполнения достаточно большого набора команд, например фиксации и целенаправленного отведения взгляда в требуемом направлении, возможность выполнения которых тоже зависит от уровня интеллектуально-мнестических способностей испытуемого.

У пациентов с УКРа первично развивается атрофия медиобазальных отделов коры головного мозга с преимущественным вовлечением гиппокампа. По результатам оценки МРТ головного мозга по шкале MTA отмечались изменения уже на стадии УКР, тогда как шкала GCA была информативна на стадии деменции из-за увеличения атрофических изменений при прогрессировании заболевания.

Результаты выполненной в двух точках СЛО, а также оценка связи полученных результатов с данными нейропсихологического тестирования и определение степени выраженности атрофических изменений по данным нейровизуализации представлены в табл. 2, 3.

Таблица 2. Оценка кратности увеличения общего количества и площади ЧПЯ при повторном обследовании у пациентов трех групп, %, Me [Q₂₅; Q₇₅]

Таблица 3. Результаты анализа корреляционных связей между кратностью увеличения показателей флюоресценции сетчатки, результатами нейропсихологического обследования и данных МРТ у обследованных пациентов (значения коэффициента корреляции Спирмена (r); корреляции значимы на уровне p<0,05)

В ходе проведенного анализа удалось установить, что после 10-дневного приема куркумина количество ЧПЯ на достоверном уровне не различалось у исследуемых групп, тогда как их площадь была увеличена почти в 2 раза для пациентов с БА, что существенно выше, чем в контрольной группе (p_1,3=0,007).

На основании проведенного корреляционного анализа установлено, что увеличение количества ЧПЯ находится в обратной зависимости от итогового балла оценки шкалы FCSRT для пациентов с БА и УКРа и шкалы MMSE только для УКРа. Это говорит о том, что увеличению количества депозитов в сетчатке у пациентов сопутствовало прогрессирование когнитивных нарушений. Кроме того, степень нарастания диффузной церебральной атрофии, выявленная по шкале GCA, была прямо пропорциональна нарастанию количества ЧПЯ в сетчатке на фоне приема куркумина для пациентов с УКРа.

Обсуждение

Для реализации цели настоящего исследования было необходимо изучить особенности накопления структурами сетчатки глаза куркумина на ранних стадиях БА, в связи с чем нами был произведен отбор пациентов на стадии УКРа и легкой деменции. Выявление Aβ в сетчатке глаза является перспективным методом диагностики БА, однако на настоящий момент остается плохо изученным. Прижизненная визуализация Aβ в головном мозге возможна с помощью проведения позитронно-эмиссионной томографии с Питтсбургской субстанцией, однако это дорогостоящий метод, который не может претендовать на роль скринингового в процессе диагностики БА. В нашей работе лигандом для Aβ являлся куркумин. Куркумин — это полифенол, содержащийся в куркуме (род однодольных травянистых растений семейства Имбирные), используемый в пищевых красителях и в качестве традиционной фитотерапии. Содержание куркуминоидов в куркуме составляет 2—9%, а в препаратах — 70—75% куркумина [16, 20, 21].

При СЛО, проведенной в динамике, совмещенной с пероральным приемом пищевого лиганда Aβ куркумина в течение 10 дней, было выявлено, что у пациентов с преимущественно легкой деменцией альцгеймеровского типа статистически значимо повышалась степень пиковой яркости депозитов в сетчатке (на 198% [95% ДИ 148; 230]), одновременно с этим повышение количества депозитов было обратно пропорционально данным когнитивной оценки по шкале MMSE, а это свидетельствует о повышенном содержании Aβ в сетчатке глаза на достоверно более высоком уровне для пациентов с легкой деменцией альцгеймеровского типа (p=0,007). Хотя на стадии УКРа подобные изменения для площади частиц выявлены не были (на 155% [95% ДИ [129; 178]), все же в ходе корреляционного анализа были получены данные о соответствии прогрессирования когнитивных нарушений увеличению количества частиц. Установлена прямая сильная корреляционная связь количества ЧПЯ и балла по выполнению части со свободным воспроизведением теста FCSRT, который является высокочувствительным к выявлению пациентов с УКРа, а также MMSE, что дополнялось наличием прямой сильной связи с результатом оценки по шкале GCA. Это свидетельствовало о том, что прогрессирование когнитивных нарушений клинически и развитие атрофических изменений сопровождалось увеличением количества ЧПЯ. Общая фоновая флюоресценция сетчатки и площадь частиц на фоне приема куркумина были увеличены для всех групп пациентов, и все же на достоверном уровне площадь частиц была больше у пациентов с БА примерно в 2 раза, в то время как в контрольной группе кратность ее увеличения была практически равна единице. Пример оценки количества и яркости частиц представлен на рис. 2. Опираясь на особенности патоморфологии и современные данные секционных исследований, можно утверждать, что частицы являются отложениями Aβ. Этот факт может помочь в диагностике БА, сделать ее более доступной, точной и возможно более ранней.

Рис. 2. Пример гистограмм и оценки площади количества частиц с пиковой яркостью (ЧПЯ) у пациента с болезнью Альцгеймера (БА) и участника контрольной группы.

1) Пациент Н., 73 лет, диагноз: БА. Представлены изображения с выделенными ЧПЯ и гистограммами изображений. Отмечается увеличение кратности площади частиц до 190%, разница в фоновой яркости между двумя снимками 39 ед. 2) Изображение глазного дна пациента Л., 65 лет, из контрольной группы. Отмечено увеличение площади, равное 158%, разница в фоновой яркости между контрольными точками 18 ед.

Заключение

В представленной работе впервые в отечественной практике предложен метод оценки степени флюоресценции сетчатки для пациентов с БА, который позволяет безопасно и неинвазивно диагностировать пациентов на ранней стадии. Преимуществами его являются широкая доступность, быстрота и неинвазивность, а также возможность оценивать пациентов в динамике. Ограничениями проведенного исследования являются относительно ограниченное офтальмологическое обследование, не позволяющее исключить ранние доклинические изменения сетчатки, разрешающая способность офтальмоскопа и качество полученных снимков.

Данные, полученные при помощи СЛО, показали, что у пациентов с БА на глазном дне ЧПЯ стали больше по площади на фоне приема куркумина, в сравнении с группой контроля. Необходимо проведение большего количества исследований с применением современных офтальмоскопов с высоким разрешением, особенно для пациентов с УКРа, так как данный метод диагностики является крайне перспективным.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.