На сегодняшний день болезнь Паркинсона (БП) является одним из самых распространенных и тяжелых нейродегенеративных заболеваний и поражает около 2% лиц старше 60 лет. Заболевание характеризуется такими моторными симптомами, как тремор, брадикинезия и ригидность мускулатуры, которые появляются вследствие гибели свыше 60—80% дофаминергических нейронов черной субстанции головного мозга. Заболевание является мультифакторным, к его развитию приводят как экзогенные, так и эндогенные причины. К числу эндогенных факторов относят различные мутации около 20 известных на данный момент причинных генетических локусов БП. Мутации в некоторых генах, например SNCA, LRRK2, PINK1 и др., более тесно ассоциированы с развитием заболевания, а мутации в других генах только повышают риск развития БП, к ним относится ген GBA. Мутации в GBA наиболее распространены среди всех причинных генов БП [1]. Частота встречаемости мутаций в гене GBA у пациентов с БП составляет 3—20% в различных популяциях мира [2], для европейских популяций этот показатель составляет 4—5% [3]. В России исследования гена GBA проводились только у пациентов с БП европейской части страны (частота встречаемости мутаций в гене составила 4%) [4], в связи с чем актуальны аналогичные исследования для пациентов других регионов России.

Ген GBA кодирует лизосомальный фермент β-глюкоцереброзидазу (глюкозидаза), катализирующую реакцию расщепления глюкоцереброзидов. Гомозиготные мутации в данном гене, снижающие или вовсе блокирующие активность глюкозидазы, являются причиной развития тяжелого заболевания из класса лизосомных болезней накопления — болезни Гоше (БГ). В зависимости от того, к какому типу БГ приводит каждая конкретная мутация и насколько при этом снижается активность фермента, мутации в гене GBA условно делятся на тяжелые и мягкие [5]. При этом серьезность заболевания может быть обусловлена не только уровнем снижения ферментативной активности, но и недостаточностью фермента внутри лизосомы вследствие нарушения ее транспорта из эндоплазматического ретикулума [6]. Например, было показано, что транспорт глюкозидазы с тяжелыми мутациями p.D409H и p.L444P в лизосому был нарушен, а с мягкой мутацией p.N370S — был частичным [7]. Эти исследования предполагают, что, хотя мутировавшая глюкозидаза может обладать остаточной ферментативной активностью, она может не достигать лизосомы in vivo и, следовательно, не может выполнять свою функцию. Таким образом, возможно, что нарушение транспортировки глюкозидазы в лизосомы может способствовать развитию БП.

На индивидуальном уровне гетерозиготы или гомозиготы GBA с БП неотличимы от пациентов с идиопатической БП (иБП). Однако скорость прогрессирования двигательных нарушений выше при БП, ассоциированной с мутациями в гене GBA (GBA-БП) по сравнению с иБП. Кроме того, носители мутации GBA с большей вероятностью будут иметь немоторные симптомы, которые встречаются при иБП, включая когнитивные нарушения, расстройство поведения во время быстрого сна, гипосмию и вегетативную дисфункцию. При этом скорость когнитивных изменений выше при GBA-БП, чем при иБП [3].

У больных с GBA-БП, у кого есть тяжелые мутации (например, p.L444P), имеют более быстрое прогрессирование моторных нарушений, более высокую скорость развития деменции и более молодой возраст наступления смерти, чем носители легких мутаций (например, N370S). Кроме того, тяжелые мутации GBA связаны с более высоким риском возникновения БП по сравнению с более легкими мутациями. Однако при этом мутации GBA характеризуются неполной пенетрантностью, при которой у большинства носителей мутации GBA не развивается синуклеинопатия. Основываясь на крупных популяционных исследованиях, сегодня известно, что у носителей мутаций GBA лишь у около 9,1% разовьется БП [8].

Несмотря на то что только уменьшение активности глюкозидазы не может быть достаточным для накопления альфа-синуклеина и гибели нейронов, в многочисленных исследованиях, в том числе на модельных организмах, было показано, что снижение активности данного фермента ассоциировано с увеличением олигомеров альфа-синуклеина, а гиперэкспрессия GBA в головном мозге может приводить к снижению уровня альфа-синуклеина и устранению симптомов паркинсонизма [9]. В связи с этим возможно использование препаратов, повышающих активность глюкозидазы, в качестве нейропротекторов для пациентов с мутациями в GBA [3]. Например, потенциальным терапевтическим эффектом обладает амброксола гидрохлорид, низкомолекулярный шаперон, который, как было показано, увеличивает активность глюкозидазы мозга. На сегодняшний день были успешно проведены испытания на пациентах с БП, показавшие его безопасность, хорошую переносимость и целевое воздействие, однако необходимы дальнейшие плацебо-контролируемые клинические испытания [10].

Материал и методы

Проведено открытое неконтролируемое одноцентровое обсервационное одномоментное исследование 75 пациентов с подтвержденным диагнозом БП, поступивших на консультативный прием в ФГБУ «Федеральный Сибирский научно-клинический центр Федерального медико-биологического агентства» (Красноярск). Исследование проводилось в период с февраля 2019 г. по январь 2021 г.

Критерии включения: возраст старше 18 лет; способность пациента прочитать информационный листок и добровольно подписать информированное согласие; установленный диагноз БП в соответствии с «United Kingdom Parkinson’s Disease Society Brain Bank criteria».

Критерии невключения: отказ пациента от участия в исследовании; данные о наличии у пациента другого нейродегенеративного заболевания, нежели БП; отсутствие технической возможности для проведения венепункции (поражение поверхностных вен, воспаление кожных покровов). В исследование были включены 21 (28%) мужчина и 54 (72%) женщины в возрасте от 20 до 87 лет на момент обследования.

Молекулярно-генетическая часть работы выполнялась на базе «Научно-практической лаборатории молекулярно-генетических методов исследований» Сибирского федерального университета (Красноярск). Всем пациентам был осуществлен забор 2 мл цельной венозной крови в пробирку-вакутейнер с антикоагулянтом ЭДТА. Геномная ДНК выделялась из лейкоцитов цельной крови пациентов с помощью набора Wizard Genomic DNA Purification Kit («Promega»). Исследование ДНК пациентов на наличие мутаций в гене GBA проводили с помощью секвенирования по Сенгеру на генетическом анализаторе AB 3500 («Applied Biosystems»). Амплифицирующая ПЦР проводилась с использованием TaqMan Fast Advanced Master Mix («Applied Biosystems»). Очистку продуктов ПЦР проводили ферментами ExoSAP-IT («Applied Biosystems»), секвенирующую ПЦР — с использованием набора реагентов BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit («Applied Biosystems»). Чистка продуктов после секвенирующей ПЦР осуществлялась набором BigDye XTerminator Purification Kit («Applied Biosystems»).

Чтобы исключить влияние на достоверность полученных результатов псевдогена GBAP1, обладающего 96% гомологичностью с последовательностью гена GBA и включающего в свою нормальную последовательность некоторые мутантные для GBA варианты, для анализа 8, 9, 10 и 11-го экзонов был использован метод вложенной ПЦР с участием нескольких пар праймеров (табл. 1). Праймеры для анализа 2-го и 7-го экзонов были специфичны для последовательности гена и использовались как в первой, так и в секвенирующей ПЦР. Проверка специфичности пар праймеров проводилась с помощью программы Primer-BLAST (NCBI).

Таблица 1. Праймеры, используемые при секвенировании гена GBA

Проведение исследования одобрено локальным Этическим комитетом при ФГБУ «Федеральный Сибирский научно-клинический центр Федерального медико-биологического агентства» (Красноярск) на заседании №16 от 18.02.2019.

Результаты

Анализ гена GBA выявил различные варианты изменения структуры ДНК в исследуемых экзонах у 11 из 75 обследованных пациентов (табл. 2).

Таблица 2. Выявленные варианты в гене GBA

Из выявленных вариантов в гене GBA доля тяжелых мутаций, для которых ранее неоднократно была продемонстрирована патогенная связь с БП, а именно p.L444P (rs421016, в 10-м экзоне), p.D409H (rs1064651, в 9-м экзоне) и p.H255Q (rs367968666, в 7-м экзоне), составила 5,3%, а частота встречаемости всех выявленных вариантов GBA в целом — 14,7%. Варианты p.T369M (rs75548401, в 8-м экзоне) и p.E326K (rs2230288, в 8-м экзоне) встречаются в гене GBA относительно часто, однако их влияние на развитие БП все еще находится под вопросом. Замена c.1497G>C (p.V460V, rs1135675, в 10-м экзоне) входит в состав комплексной тяжелой мутации RecNcil, (p.L444P; p.A456P; p.V460V), ассоциированной с БП, однако сама по себе данная замена не является патогенной, согласно данным литературы. 3’-UTR вариант c.*92G>A (rs708606, в 11-м экзоне), возможно, способен вносить вклад в патогенез БП, однако на сегодняшний день слабо изучен.

Также был проведен анализ ассоциации носительства мутаций в гене GBA с ранним дебютом заболевания (до 45 лет включительно). Ранний дебют имел место у 23 пациентов с иБП и у 6 — с GBA-БП. Поздний дебют — у 41 пациента с иБП и у 5 — с GBA-БП. Данная ассоциация рассчитывалась по методу точного двустороннего критерия Фишера и не оказалась статистически значимой.

Обсуждение

Течение заболевания у пациентов с GBA-БП и с иБП клинически очень схоже, но все же при GBA-БП имеются некоторые отличительные черты. Например, галлюцинации и расстройства поведения во время быстрого сна более распространены у пациентов с мутантным GBA. Другие немоторные симптомы, такие как депрессия и различные вегетативные дисфункции, также чаще представлены у пациентов с GBA-БП (особенно при наличии тяжелых мутаций). Кроме того, у носителей мутаций в GBA чаще встречаются такие моторные симптомы, как дисфагия, дизартрия и нарушения ходьбы с феноменом «выключения», и более распространена акинетико-ригидная форма БП. Важно отметить, что при GBA-БП обычно наблюдается очень хороший ответ на леводопу [5].

В гене GBA известно свыше 300 генетических вариантов, менее ¹/₂ из них клинически значимы для БГ. Наиболее распространенные среди европейских популяций пациентов и влияющие на развитие БП мутации GBA представлены во 2, 7, 8, 9, 10 и 11-м экзонах гена [11]. Особенно частыми являются мутации p.N370S и p.L444P. В представленной выборке пациентов частота встречаемости мутации p.L444P составила 2,7%, причем оба случая носительства оказались компаунд-гетерозиготными, включая дополнительно по одному из полиморфизмов p.E326K и p.T369M. Замена p.L444P относится к тяжелым мутациям, в гомозиготном варианте остаточная активность фермента при ней может составлять до 5% от нормальной. Данная мутация локализована в 10-м экзоне, который участвует в обеспечении протеолитической и каталитической стабильности фермента [12]. Также было показано, что при наличии мутации p.L444P ограничивается транспорт глюкозидазы в лизосому, что может объяснять нарушение нормального функционирования фермента [6]. Полиморфизмы p.E326K и p.T369M снижают активность глюкозидазы незначительно (до 50%) и не имеют клинической значимости для БГ, в связи с чем их ассоциация с БП до сих пор спорна, однако многие исследования выявляют их значимую связь с БП [11]. Оба полиморфизма локализованы в 8-м экзоне, который также обеспечивает каталитическую активность фермента [9]. Было показано, что наличие сразу нескольких мутаций в GBA ассоциировано с более ранним дебютом БП и более тяжелым течением заболевания [13]. Эти данные согласуются с обоими случаями компаунд-гетерозиготного носительства в представленной выборке. Так, у пациентки 1 (см. табл. 2), с вариантами p.L444P и p.T369M, был ранний возраст дебюта БП — 45 лет, смешанный акинетико-ригидно-дрожательный фенотип, имелись вегетативные симптомы в виде запоров и нарушений мочеиспускания и депрессивный синдром. У пациента 2, с вариантами p.L444P и p.E326K, также был ранний возраст дебюта БП — 30 лет, отец пациента страдал БП с тяжелым течением, инвалидизацией в течение 4 лет с момента манифестации заболевания (в 52 года) и ранней смертью в возрасте 60 лет.

Тяжелые гетерозиготные мутации в GBA были выявлены еще у 2 пациентов. Пациент 3, с вариантом p.D409H в 9-м экзоне, также ответственным за каталитическую активность фермента [9], имел ранний возраст дебюта БП — 44 года, форма заболевания была смешанная, ригидно-дрожательная, однако прогрессирование — умеренное. У пациентки 4, с вариантом p.H255Q в 7-м экзоне, возраст манифестации БП составил 52 года, присутствовала акинетико-ригидно-дрожательная форма, течение заболевания было умеренное, однако были выражены вегетативные и прогрессирующие эмоциональные нарушения: запоры, проблемы мочеиспускания, депрессивный синдром и стойкая бессонница. Пациентка 5, с полиморфизмом p.E326K, имела ранний дебют БП — в 41 год, акинетико-ригидно-дрожательный фенотип, скорость прогрессирования заболевания была умеренная.

Частота полиморфизма p.T369M у пациентов нашей выборки составила 5,3% и оказалась наиболее высокой по сравнению с остальными вариантами. Данный полиморфизм был обнаружен, помимо описанного выше случая компаунд-гетерозиготного носительства, еще у 3 пациенток (6, 7 и 8). Возраст дебюта БП для них составил соответственно 51 год, 77 и 45 лет, все 3 пациентки имели смешанную акинетико-ригидно-дрожательную форму, для всех было характерно медленное прогрессирование заболевания. Помимо этого, пациентка 7 имела вегетативные симптомы: нарушение мочеиспускания и запоры. У пациенток 9 и 10 была выявлена синонимичная замена p.V460V, не имеющая патогенетической значимости по данным литературы. БП дебютировала у этих пациенток в возрасте 55 и 36 лет соответственно, скорость прогрессирования заболевания была умеренной, отягощения вегетативными и когнитивными симптомами не имелось.

Также у пациентки 11 был выявлен 3’-UTR полиморфизм c.*92G>A в 11-м экзоне (rs708606). Данная пациентка имела также акинетико-ригидно-дрожательную форму заболевания, возраст дебюта БП у нее составил 56 лет, кроме того имело место быстрое присоединение вегетативных и когнитивных расстройств. Исследование M. Wilke и соавт. [14] связывало данный вариант с развитием немоторных симптомов, особенно когнитивных нарушений, однако ассоциация не была статистически значимой.

Многие исследования выявляют ассоциацию мутаций в GBA с более ранним возрастом манифестации заболевания, чем при иБП [15]. В данном исследовании пациенты с GBA-БП с возрастом дебюта БП до 45 лет были более широко представлены среди пациентов с GBA-БП, чем пациенты с иБП с ранним дебютом среди всех пациентов с иБП, однако ассоциация не достигла статистической значимости (точный критерий Фишера, p=0,32).

Также можно отметить, что для пациентов с GBA-БП в представленной выборке, особенно имеющих тяжелые мутации, было характерно отягощение немоторными симптомами, в частности вегетативными и когнитивными дисфункциями, однако большинство из них не имели быстрого прогрессирования заболевания. Кроме того, у данных пациентов с GBA-БП преобладал смешанный акинетико-ригидно-дрожательный фенотип.

Заключение

В настоящем исследовании были проанализированы 2, 7, 8, 9, 10 и 11-й экзоны гена GBA у 75 пациентов с БП Красноярского региона. Частота встречаемости патогенетически значимых мутаций GBA составила 5,3%, а частота встречаемости всех вариантов в гене GBA, включая замены, ассоциация которых с развитием БП не столь однозначна, — 14,7%. Для пациентов с GBA-БП в представленной выборке было характерно наличие вегетативных и когнитивных симптомов, а также ранний возраст манифестации заболевания, хотя данная связь не оказалась статистически значимой. В целом можно заключить, что распространенность вариантов в гене GBA как одном из ведущих генетических факторов развития БП у пациентов Красноярского региона довольно высока и сопоставима с распространенностью в европейских популяциях. В будущем эти данные могут быть полезны в рамках развития ранней диагностики и персонализированного лечения БП.

Исследование выполнено при финансовом обеспечении Государственного задания ФМБА России на тему: «Использование молекулярно-генетического анализа для оценки риска раннего развития нейродегенеративных заболеваний», а также с привлечением средств федерального бюджета Сибирского федерального университета.

The study was carried out with financial support the state task of the FMBA of Russia on the topic: «The use of molecular genetic analysis to assess the risk of early development of neurodegenerative diseases», as well as with the involvement of funds from the federal budget of the Siberian Federal University.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.