Одними из основных средств фармакотерапии острой боли при широком спектре патологических состояний являются нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП), общий механизм действия которых — ингибирование циклооксигеназы (ЦОГ) с последующим снижением повышенного при воспалении или повреждении ткани уровня простагландинов, за счет чего НПВП оказывают обезболивающий, противовоспалительный и жаропонижающий эффекты. Однако их прием сопровождается нежелательными явлениями (НЯ), обусловленными периферическим действием препаратов. Прежде всего это НЯ со стороны желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), сердечно-сосудистой системы, НПВП-ассоциированные нефропатии, гепатотоксичность [1]. НПВП способны ускорить дегенерацию хряща, поэтому, облегчая хроническую ноцицептивную боль при остеоартрите, они могут негативно влиять на течение заболевания [2]. Высокий риск НПВП-ассоциированных НЯ применения НПВП ограничивает их долгосрочное использование [3].

Для уменьшения доз НПВП и повышения безопасности их применения возможно комбинирование НПВП со средствами, механизм действия которых исключает выраженное ингибирование фосфолипазы A2 и ЦОГ и направлен на иные звенья патогенеза боли. Такими средствами могут быть препараты с антиоксидантным действием, так как в каскаде арахидоновой кислоты образуются активные формы кислорода (АФК) [4], которые являются одними из альгогенов при воспалительной гипералгезии, и перехватчики АФК или соединения, имитирующие активность супероксиддисмутазы, которые уменьшают гипералгезию [5, 6]. АФК способны усиливать глутамат-зависимую трансдукцию: могут окислять сульфгидрильные группы транспортеров глутамата и, таким образом, инактивировать их, вследствие чего снижается захват глутамата из синаптической щели и его перенос в клетку [7—9].

Использование антиоксидантных препаратов совместно с НПВП целесообразно и с целью уменьшения вызываемых ими НЯ. С одной стороны, механизм побочного действия НПВП на слизистую оболочку ЖКТ является следствием их прооксидантного действия [10]. С другой стороны, при приеме НПВП существенно увеличен риск гибели пациентов, перенесших инфаркт миокарда [11]. Вследствие ишемии миокарда при инфаркте миокарда, нестабильной стенокардии и ишемической болезни активируется перекисное окисление липидов (ПОЛ) и повышается образование АФК, повреждающих клеточные мембраны и оказывающих цитотоксическое действие [12]. Поэтому применение в комбинации с НПВП средств, проявляющих антиоксидантные свойства, обосновано не только с целью усиления основного действия НПВП, но и для снижения риска развития НЯ со стороны ЖКТ, сердечно-сосудистой и других систем.

В настоящем исследовании для комбинации с НПВП был выбран антиоксидант этилметилгидроксипиридина сукцинат (ЭМГПС), который обладает мультимодальным механизмом действия, включающим его способность ингибировать ПОЛ и модифицировать фосфолипидный состав мембран [13—15], повышать активность Se-зависимой глутатионпероксидазы, снижать активность индуцибельной NO-синтазы, связывать супероксидный анион-радикал, уменьшать глутаматную эксайтотоксичность [16], улучшать энергетический статус клетки и влиять на процессы в цикле Кребса [17, 18].

Цель исследования — изучить влияние ЭМГПС на противоболевой эффект неселективного ингибитора ЦОГ диклофенака натрия и селективного ингибитора ЦОГ-2 эторикоксиба на моделях острой висцеральной и соматической боли и оценить возможность применения ЭМГПС в комбинации с ингибиторами ЦОГ для снижения их доз с сохранением противоболевой эффективности.

Материал и методы

В работе использовали половозрелых беспородных белых мышей-самцов массой 24—29 г и крыс-самцов массой 240—280 г. из питомника филиала «Столбовая» ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России». Организацию и проведение работ осуществляли в соответствии с ГОСТ 33216-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами», ГОСТ 33215-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур» и Директивой 2010/63/EU Европейского Парламента и Совета Европейского Союза от 22.09.2010 по охране животных, используемых в научных целях. Проведение опытов одобрено Комиссией по биомедицинской этике НИИ фармакологии им. В.В. Закусова (протокол №01 от 28.01.2021).

Использовали диклофенак натрия (Вольтарен, раствор для внутримышечного введения 75 мг/3 мл; «Novartis Pharma Stein AG», Швейцария); эторикоксиб (Аркоксия, таблетки, покрытые пленочной оболочкой; «Merck sharp & Dohme B.V.», Нидерланды); ЭМГПС (Мексидол, раствор для в/в введения 50 мг/мл; ООО «НПК «ФАРМАСОФТ», Россия); в качестве растворителя применяли физиологический раствор (Натрия хлорид, раствор для инфузий 0,9%; ОАО НПК «ЭСКОМ», Россия).

Висцеральную боль у мышей вызывали внутрибрюшинным введением 0,9% раствора уксусной кислоты из расчета 0,1 мл на 10 г массы тела (тест «уксусные корчи», ТУК). Введение раствора уксусной кислоты приводит к раздражению серозных оболочек, что вызывает сокращение абдоминальной мускулатуры и проявляется специфическими болевыми движениями — корчами, количество которых подсчитывали на протяжении 15 мин сразу после введения раствора уксусной кислоты [19]. О противоболевом действии препаратов судили по снижению количества корчей после их введения относительно количества корчей в контрольной группе мышей, которым вводили растворитель.

Изучение влияния ЭМГПС на выраженность противоболевого действия НПВП на модели висцеральной боли у мышей проводили в трех опытах. В первом оценивали влияние ЭМГПС на действие диклофенака натрия, во втором — на действие эторикоксиба, в третьем — на висцеральную боль per se. С целью выбора доз НПВП для применения в комбинации с ЭМГПС оценивали дозозависимость их противоболевого эффекта: для диклофенака натрия в диапазоне доз от 0,5 до 10 мг/кг, для эторикоксиба — от 1 до 20 мг/кг. Дозы ЭМГПС в комбинации с НПВП составляли от 12,5 до 100 мг/кг, влияние ЭМГПС per se изучали при его введении в дозах 25, 50 и 100 мг/кг. Препараты или физиологический раствор (контрольная группа) мышам вводили перорально за 1 ч до внутрибрюшинного введения 0,9% раствора уксусной кислоты.

Формалиновый тест, моделирующий боль при операционных разрезах (травмах). В заднюю лапу крыс вводили 0,1 мл 2% раствора формалина [19]. Каждые 5 мин в баллах регистрировали 4 типа поведенческих реакций: 0 — отсутствие реакции; 1 — лапа остается на горизонтальной поверхности, но животное на нее не опирается; 2 — лапа поднята; 3 — лапа облизывается, грызется или встряхивается. Подсчитывали сумму баллов в острую (0—5 мин), тоническую (20—60 мин) фазу боли и интерфазу (5—20 мин). Критерием анальгетического эффекта считали уменьшение болевых реакций в группах крыс, получавших препараты, относительно контрольной группы животных, которым вводили физиологический раствор. Изучаемые НПВП эторикоксиб и диклофенак натрия в дозах 1 и 10 мг/кг соответственно, ЭМГПС в дозе 25 мг/кг, комбинации этих НПВП (1 мг/кг) с ЭМГПС (25 мг/кг) и физиологический раствор вводили перорально за 1 ч до введения 2% раствора формалина.

При проведении теста механической гипералгезии при воспалении гипералгезию регистрировали у крыс с воспалением, вызванным введением в заднюю лапу 0,1 мл 1% раствора каррагинана [20]. О гипералгезии судили по снижению порога тактильной чувствительности, которую фиксировали через 3 и 24 ч после введения раствора каррагинана с помощью волосков фон Фрея весом от 0,06 до 23,96 г («Aesthesio Ugo Basile», Италия). Крыс помещали по отдельности в пластиковые камеры (20×10×14 см) на возвышенной решетчатой платформе с перфорациями и в течение 15 мин адаптировали в условиях покоя. Нити фон Фрея предъявляли перпендикулярно в разных местах подошвенной поверхности задних лап животных, исключая области пальцев и скакательного сустава. Для каждого волоска фон Фрея тестирование проводили 5 раз с интервалом 3 с. Определяли порог реакции, вызывающий отдергивание лапы. Эторикоксиб и диклофенак натрия в дозах 1 и 10 мг/кг, ЭМГПС в дозе 25 мг/кг, комбинации этих НПВП (1 мг/кг) с ЭМГПС (25 мг/кг) вводили перорально дважды через 2 и 23 ч после введения раствора каррагинана. Группе крыс без воспаления лапы (контрольная группа) и группе крыс «Каррагинан» (животным с отеком лапы, которым не вводили препараты) перорально в эти же сроки вводили физиологический раствор.

Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью программы Statistica 10.0. Нормальность распределения данных проверяли критерием Шапиро—Уилка с последующей оценкой межгруппового равенства дисперсий критерием Левена. При нормальном распределении в группах и соблюдении межгруппового равенства дисперсий дальнейшую статистическую обработку проводили путем однофакторного дисперсионного анализа с последующим сравнением групп с помощью критерия Ньюмана—Кейлса и t-критерия Стьюдента. При отсутствии нормального распределения использовали критерий Краскела—Уоллиса. При обнаружении статистически значимых различий между группами с помощью критерия Краскела—Уоллиса далее проводили статистический анализ методом сравнения средних рангов для всех групп. Различия между группами считали статистически значимыми при p≤0,05. Результаты представляли на рисунках, выполненных с помощью программы GraphPad Prism V. 8.4.3: при применении параметрической статистики — как среднее значение±стандартное отклонение (M±SD), непараметрической — в виде боксплотов.

Результаты

Влияние препаратов на висцеральную боль в ТУК у мышей. Висцеральная боль у мышей после внутрибрюшинного введения им 0,9% раствора уксусной кислоты проявлялась специфическими болевыми движениями — корчами, количество которых в контрольных группах варьировало от 48,3 до 62,0 (рис. 1). Диклофенак натрия оказывал дозозависимое противоболевое действие и значимо снижал болевую реакцию животных при однократном пероральном введении в дозах от 1 до 10 мг/кг, но не в дозе 0,5 мг/кг. Противоболевой эффект препарата в дозе 1 мг/кг соответствовал 43,6%, в дозе 5 мг/кг — 57,0%, в дозе 10 мг/кг — 64,6%. При этом уменьшение интенсивности висцеральной боли при введении мышам диклофенака натрия в дозах 5 и 10 мг/кг было значимо соответственно на 47,7 и 57,0% более выражено, чем в группе животных, которым его вводили в дозе 0,5 мг/кг (рис. 1, а). Применение диклофенака натрия в дозе 1 мг/кг и эторикоксиба с ЭМГПС в дозе 25 мг/кг приводило к значимому снижению боли на 47,7%; использование этого НПВП совместно с ЭМГПС в дозе 100 мг/кг подавляло боль на 40,3%. Применение диклофенака натрия в дозе 0,5 мг/кг, в которой препарат не оказывал значимого влияния на висцеральную боль, совместно с ЭМГПС в дозах 25 и 12,5 мг/кг приводило к появлению значимого противоболевого эффекта. Комбинация диклофенака натрия в дозе 0,5 мг/кг с ЭМГПС в дозе 25 мг/кг снижала боль на 29,8%, с ЭМГПС в дозе 12,5 мг/кг — на 25,1% (см. рис. 1, а).

Рис. 1. Влияние диклофенака натрия (а), эторикоксиба (б), ЭМГПС (в) и их комбинаций (а, б) при однократном пероральном введении на выраженность острой висцеральной боли в тесте ТУК у мышей (M±SD).

* — p<0,05,** — p<0,005, *** — p<0,0005 по сравнению с контролем; для рис. 1а: ^# — p<0,05, ^## — p<0,005 по сравнению с группой «Диклофенак 0,5 мг/кг»; ^ — p<0,05 по сравнению с группой «Диклофенак 5 мг/кг»; ^@ — p<0,05 по сравнению с группой «Диклофенак 10 мг/кг, критерий Ньюмена—Кейлса».

Эторикоксиб при однократном пероральном введении в диапазоне доз 1—20 мг/кг дозозависимо подавлял висцеральную боль у мышей. Препарат в дозе 1 мг/кг значимо снижал количество корчей на 22,5%, в дозе 5 мг/кг — на 33,9%, в дозе 10 мг/кг — на 36,4%, в дозе 20 мг/кг — на 43,2%. Применение эторикоксиба в дозе 1 мг/кг совместно с ЭМГПС в дозах 25—100 мг/кг усиливало выраженность противоболевого эффекта НПВП и приводило к подавлению боли на 40,1—44,2%, что было сопоставимо с эффектом эторикоксиба в дозе 20 мг/кг. Хотя при статистическом анализе с помощью критерия Ньюмена—Кейлса различий между группами комбинаций эторикоксиба (1 мг/кг) и ЭМГПС (25—100 мг/кг) не было, при попарном сравнении с помощью t-критерия Стьюдента зарегистрировано значимое (p<0,05) повышение эффективности этих комбинаций на 22,6—28,0% по сравнению с введением только эторикоксиба. Однако при применении эторикоксиба (1 мг/кг) в комбинации с ЭМГПС в дозе 12,5 мг/кг количество корчей практически не отличалось от показателя в группе мышей, которым вводили только эторикоксиб в дозе 1 мг/кг (см. рис. 1, б). ЭМГПС при однократном пероральном введении в дозах 25—100 мг/кг значимо не влиял на выраженность висцеральной боли у мышей. Вместе с тем при его применении в дозах 50 и 100 мг/кг наблюдалась тенденция к снижению количества корчей (соответственно на 19,8%, p=0,07, и 23,4%, p=0,075, t-критерий Стьюдента) (см. рис. 1, в).

Таким образом, на модели острой висцеральной боли у мышей ЭМГПС при однократном пероральном введении в дозах 25—100 мг/кг не оказывал значимого влияния на ее выраженность, но усиливал противоболевой эффект диклофенака натрия и эторикоксиба при их однократном пероральном введении в дозах 0,5 и 1 мг/кг.

Влияние препаратов на соматическую боль в формалиновом тесте у крыс. В формалиновом тесте спонтанное болевое поведение крыс после введения им 0,1 мл 2% раствора формалина характеризовалось двухфазной реакцией (рис. 2). Первая фаза, которая длилась в течение 5 мин, обусловлена действием формалина на ионный канал TRPA1 афферентных нейронов, вторая фаза начиналась с 20 мин наблюдения, и ее механизм связывают с развивающейся воспалительной реакцией и центральной сенситизацией [21]. Регистрируемое с 5-й по 20-ю мин снижение болевой реакции — интерфаза — объясняют результатом гиперполяризации и временной инактивации нейронов, повышение возбудимости которых и центробежное распространение формалина в коже вызывают вторую фазу болевой реакции [22].

Рис. 2. Влияние диклофенака натрия (а, б), эторикоксиба (в, г) и их комбинаций с ЭМГПС при однократном пероральном введении на формалиновую боль у крыс в острую и тоническую фазу.

Данные представлены в виде боксплотов; статистическую обработку данных проводили с помощью критерия Краскела—Уоллиса с последующим статистическим анализом данных методом сравнения средних рангов для всех групп.

Диклофенак натрия оказывал дозозависимое противоболевое действие в формалиновом тесте у крыс. В дозе 10 мг/кг он значимо снижал количество свидетельствующих о боли спонтанных реакций крыс на 50,0% в острую фазу боли и на 31,7% в тоническую. Введение животным диклофенака натрия в меньшей дозе (1 мг/кг) приводило к значимому подавлению боли (на 26,8%) только в тоническую фазу (см. рис. 2, а, б). Эторикоксиб оказывал значимое противоболевое действие только в дозе 10 мг/кг и на 17,1% снижал количество свидетельствующих о боли спонтанных реакций крыс в тоническую фазу. На острую фазу боли препарат влияния не оказывал (см. рис. 2, в, г).

ЭМГПС при однократном пероральном введении в дозе 25 мг/кг не оказывал значимого влияния на болевое поведение крыс в формалиновом тесте. Однако его применение совместно с диклофенаком натрия или эторикоксибом в дозе 1 мг/кг усиливало выраженность противоболевого действия НПВП за счет появления у комбинаций препаратов способности снижать боль (на 50,0%) в острую фазу. Эффект комбинаций препаратов и диклофенака натрия в дозе 10 мг/кг в острую фазу формалиновой боли развивался за счет уменьшения ее длительности; болевые реакции крыс сразу после введения раствора формалина во всех опытных группах практически не различались. Применение ЭМГПС в дозе 25 мг/кг совместно с эторикоксибом в дозе 1 мг/кг еще и значимо на 23,5% усиливало противоболевой эффект НПВП в тоническую фазу боли (см. рис. 2). Значимых различий в поведении животных опытных групп во время интерфазы выявлено не было.

Влияние препаратов на соматическую боль в тесте механической гипералгезии при воспалении у крыс. При экссудативном воспалении лапы у крыс, вызванном инъекцией раствора каррагинана, развивается гипералгезия, которую регистрировали с помощью нитей фон Фрея через 3 и 24 ч после его индукции. При тактильной стимуляции порог чувствительности животных с каррагинановым отеком, которым вводили растворитель, через 3 ч после введения каррагинана составил 5 г, через 24 ч — 8 г против порога чувствительности, равного 60 г, у крыс, которым раствор каррагинана не вводили.

Диклофенак натрия в тесте механической гипералгезии при воспалении проявлял дозозависимый противоболевой эффект. Через 3 ч после индукции воспаления диклофенак натрия значимо увеличивал порог чувствительности животных по сравнению с группой, которой вводили раствор каррагинана и растворитель, только при введении в дозе 10 мг/кг (порог чувствительности составил 26 г). Через 24 ч порог чувствительности крыс, которым вводили диклофенак натрия в обеих изучаемых дозах (1 и 10 мг/кг), повышался до значения группы животных без отека лапы (рис. 3, а, б).

Рис. 3. Влияние диклофенака натрия (а, б), эторикоксиба (в, г) и их комбинаций с ЭМГПС при однократном пероральном введении в тесте механической гипералгезии при воспалении у крыс через 3 (а, в) и 24 (б, г) ч после введения раствора каррагинана.

По оси ординат — порог болевой реакции в граммах (г). Данные представлены в виде боксплотов; ** — p<0,005, *** — p<0,0005 по сравнению с группой «Физиолоический раствор»; ^## — p<0,005 по сравнению с группой «Каррагинан + физиологический раствор»; ^ — p<0,05, ^^ — p<0,005 по сравнению с группой «Каррагинан + ЭМГПС 25 мг/кг»; критерий Краскела—Уоллиса с последующим статистическим анализом данных методом сравнения средних рангов для всех групп.

У крыс с каррагинановым отеком, которым вводили эторикоксиб в дозах 1 и 10 мг/кг, порог чувствительности при тактильной стимуляции поврежденной лапы был значимо выше по сравнению с группой животных с отеком лапы, которым вводили только растворитель, и через 3 и 24 ч после индукции воспаления составил 26 г (см. рис. 3, в, г).

ЭМГПС в дозе 25 мг/кг не влиял на порог чувствительности поврежденной лапы крыс с каррагинановым отеком при ее тактильной стимуляции. Однако его введение совместно с диклофенаком натрия в дозе 1 мг/кг приводило к повышению порога чувствительности животных по сравнению с введением только диклофенака натрия в дозе 1 мг/кг, который не оказывал на него значимого влияния. Порог чувствительности крыс, которым вводили диклофенак натрия в дозе 1 мг/кг с ЭМГПС в дозе 25 мг/кг, через 3 ч после введения флогогена составил 43 г, т.е. был в 8,6 раз выше, чем в группе крыс с отеком лапы, которым вводили только растворитель. Через 24 ч после индукции воспаления при тактильной стимуляции порог чувствительности крыс с отеком лапы, которым вводили комбинацию диклофенака натрия (1 мг/кг) с ЭМГПС (25 мг/кг), не отличался от порога чувствительности животных, которым вводили диклофенак натрия в обеих изучаемых дозах (см. рис. 3, а, б). На эффект эторикоксиба ЭМГПС (25 мг/кг) оказывал меньшее влияние. Порог чувствительности крыс, которым перорально вводили комбинацию эторикоксиба (1 мг/кг) и ЭМГПС (25 мг/кг), через 3 и 24 ч после индукции воспаления был незначимо повышен по сравнению с соответствующими значениями в группе животных, которым вводили только эторикоксиб (1 мг/кг), и составлял соответственно 43 и 60 г (см. рис. 3, в, г).

Обсуждение

Результаты проведенного экспериментального исследования свидетельствуют о том, что ЭМГПС в дозе 25 мг/кг усиливает противоболевое действие ингибиторов ЦОГ диклофенака натрия и эторикоксиба, используемых в малой дозе (1 мг/кг). Острая висцеральная боль у мышей, тоническая фаза формалиновой боли и механическая гипералгезия у крыс с отеком лапы возникают на фоне развития острого экссудативного воспаления, при котором повышено образование АФК, поэтому зарегистрированное влияние ЭМГПС на противоболевой эффект НПВП можно связать с его антиоксидантными свойствами. Острая фаза формалиновой боли обусловлена действием формалина на ионный канал TRPA1 афферентных нейронов. Ионный канал TRPA1 коэкспрессируется с ионным каналом TRPV1 [22], и антагонисты ионного канала TRPV1 способны снижать выраженность болевого поведения крыс в острую фазу индуцированной формалином боли [23]. Диклофенак натрия при пероральном введении в дозе 10 мг/кг, но не 1 мг/кг, подавляет формалиновую боль у крыс в острую фазу за счет влияния на ионные каналы TRPV1, так как известно, что этот НПВП снижает выраженность механической и тепловой гипералгезии, вызванной активацией этих каналов [24]. Применение ЭМГПС в дозе 25 мг/кг при введении совместно с диклофенаком натрия и эторикоксибом в дозе 1 мг/кг приводит к появлению значимого анальгетического эффекта в острую фазу формалиновой боли, что в первую очередь обусловлено его мембранотропными свойствами.

В проведенных нами ранее экспериментах показано, что на модели каррагинанового отека у мышей и крыс антиэкссудативный эффект комбинаций ЭМГПС в дозе 25 мг/кг и диклофенака натрия или эторикоксиба в дозе 1 мг/кг при однократном пероральном введении не уступает эффекту этих НПВП в дозе 10 мг/кг [25]. ЭМГПС в дозе 100 мг/кг усиливает антиэкссудативное и анальгетическое действия диклофенака натрия в дозе 5 мг/кг при однократном внутрибрюшинном введении препаратов крысам [26]. Однако при превентивном 10-дневном пероральном введении ЭМГПС в дозе 100 мг/кг в комбинации с диклофенаком натрия в дозе 5 мг/кг усиление противовоспалительного эффекта НПВП не превышает эффект однократного сочетанного введения этих препаратов при внутрибрюшинном введении [27]. В исследованиях in vitro установлено, что диклофенак натрия оказывает дозозависимый прооксидантный эффект в реакции Фентона, зарегистрированный хемилюминесцентным методом, а ЭМГПС в концентрации 250 или 25 мкМ совместно с диклофенаком натрия в концентрациях соответственно 50, 100 или 10 мкМ уменьшает пик хемилюминесценции, который пропорционален скорости свободнорадикальных реакций, по сравнению с использованием только НПВП, но при этом увеличивает длительность и квантовый выход хемилюминесценции [28]. Значимых изменений кинетики хемилюминесценции не происходит при применении ЭМГПС в концентрации 25 мкМ с диклофенаком натрия в концентрации 1 мкМ, что подтверждает целесообразность применения препаратов в малых дозах [28].

Полученные данные согласуются с результатами клинических исследований. Так, применение ЭМГПС в комбинированной терапии совместно с НПВП, вазоактивными препаратами, миорелаксантами, витаминами группы B ускоряет темп снижения боли при пояснично-крестцовых радикулопатиях [29, 30, 31], остеохондрозе разных отделов позвоночника и радикулоишемии [32, 33, 34].

Заключение

Установлено, что на моделях острой висцеральной и соматической боли у мышей и крыс ЭМГПС при однократном пероральном введении в малой дозе 25 мг/кг усиливает противоболевой эффект диклофенака натрия и эторикоксиба, используемых в малой дозе 1 мг/кг. Полученные данные свидетельствуют о целесообразности клинического исследования применения ЭМГПС в комбинации с НПВП при висцеральной и соматической боли с целью оценки его способности повышать лечебный эффект НПВП.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.