Введение

На рубеже XIX и XX веков было установлено, что инокуляция патогенных микробов как ослабленных, так и убитых, вызывает защиту от соответствующей инфекции. Однократное введение живых вакцин, как правило, обеспечивало формирование более интенсивного и длительного иммунитета, чем аналогичное введение инактивированной вакцины. Однако живые вакцины на основе штаммов со сниженной вирулентностью, в отличие от инактивированных, не исключают риска возникновения инфекционного процесса у лиц с ослабленным иммунитетом. Кроме того, возможна реверсия вирулентности в результате компенсаторных мутаций в вакцинном штамме. Инактивированные вакцины также имеют свои недостатки. Поэтому продолжаются исследования по улучшению обеих форм вакцин с целью разработки более совершенной вакцины, сочетающей безопасность с высокой защитной активностью и значительной продолжительностью иммунитета [2].

L.Pasteur первым получил ослабленные штаммы возбудителей птичьей холеры, сибирской язвы и бешенства, а затем использовал их в качестве основы для вакцинных препаратов [3—5]. Первые попытки аттенуации возбудителя чумы были предприняты его первооткрывателем A. Yersin. Для этого он использовал культивирование при повышенных температурах и/или добавление в питательную среду этанола до 0,5—5,0%. Сочетание двух подходов позволило получить через два месяца пассажей практически авирулентные культуры [6]. Кроме того, исследователь показал, что живые аттенуированные чумные микробы защищали мелких лабораторных грызунов значительно лучше, чем убитые. Более высокая эффективность живых чумных вакцин по сравнению с инактивированными была подтверждена и другими исследователями, создавшими с помощью альтернативных методов ряд аттенуированных штаммов возбудителя чумы [7, 8].

Мыши являются предпочтительной экспериментальной моделью для большинства иммунологов и изучение их иммунных реакций в значительной степени способствовало пониманию работы иммунной системы человека. Однако за 65 млн лет эволюционирования сформировались существенные различия как во врожденном, так и в адаптивном иммунитете у разных видов млекопитающих, и эти различия следует учитывать при использовании мышей в качестве моделей при проведении доклинических исследований препаратов, предназначенных для человека [9].

Помимо различий в межвидовой и внутривидовой специфической реакции хозяина на антигены Y. pestis, нельзя забывать об антигенной изменчивости чумного микроба. Чтобы преодолеть иммунную защиту хозяина, патогены эволюционируют, вырабатывая не реагирующие или слабо перекрестно реагирующие изоформы иммунодоминантных антигенов, бактериальных факторов, абсолютно необходимых для вирулентности патогена [10, 11]. Патоген также может прекратить продукцию иммунодоминантного антигена, если это не снижает его гипервирулентность [12].

Исследования патогенеза и иммуногенеза чумы на молекулярном уровне позволили ученым выявить значительное количество факторов патогенности, необходимых для реализации гипервирулентности Y. pestis (F1, V, Pla, PsaA, Ymt, Ail, LPS и др.), однако лишь два из них, F1 и V, с высокой эффективностью защищают от гибели большую часть иммунизированных лабораторных животных [13]. Это послужило причиной того, что подавляющее большинство исследователей переключили свое внимание на разработку различных вариантов низкокомпонентных субъединичных вакцин на основе двух иммунодоминантных F1- и V-антигенов.

Однако вакцины, сконструированные на основе индивидуальных антигенов F1 и V или их комбинации, не являются идеальными, так как не могут обеспечить защиты от всех вирулентных вариантов возбудителя чумы, продуцирующих серологически отличающиеся изоформы этих белков [10, 11]. В то же время живая чумная вакцина, созданная на основе штамма EV линии НИИЭГ, способна обеспечивать защиту животных как от штаммов «дикого» типа (индекс иммунитета (ИИ) для белых мышей ~3,3×10⁴, для морских свинок ~1,4×10⁵), так и от их бескапсульных вариантов (ИИ для мышей ~2,6×10², для морских свинок ~1,2×10⁶) [14]. Есть данные, что вакцина живая чумная эффективна и в отношении «полёвочьих» штаммов возбудителя чумы [15], продуцирующих серологически отличающиеся изоформы нескольких факторов патогенности [16]. Это подтверждает то, что наличие в живых вакцинах, сконструированных на основе аттенуированных штаммов, не только одного-двух иммунодоминантных, но и целого спектра сложных (комплекс белка с ЛПС и т.п.), конформационно-лабильных и минорных антигенов, обеспечивает индукцию «гетерогенного» иммунного ответа, способного защитить макроорганизм от патогенных бактерий даже с частично измененной антигенной специфичностью.

С учетом всего вышесказанного, настоящая работа посвящена оценке эффективности противочумного иммунитета, индуцированного у морских свинок и мышей при однократном подкожном введении в одном шприце равных количеств двух штаммов Y. pestis, аттенуированных за счет делеций в геномах локуса pgm и гена lpxM или гена nlpD.

Материал и методы

Штаммы микроорганизмов и условия выращивания

Бактерии, использованные в исследовании, и их характеристики перечислены в табл. 1. Штаммы Y. pestis выращивали на агаре Хоттингера (различные партии, приготовленные в ГНЦ ПМБ) при pH 7,2. Культуры Y. pestis для иммунизации и заражения животных выращивали при температуре 28 °C в течение 48 ч.

Таблица 1. Характеристика использованных в работе штаммов Y. pestis

Животные

В экспериментах in vivo в качестве модельных животных использовали аутбредных мышей SHR (самки, 6—8 нед, масса 18—22 г) и морских свинок Агути (самки, 8—10 нед, масса 250—400 г), полученных из питомника лабораторных животных в филиале «Андреевка» ФГБУН «НЦБМТ» ФМБА России. Содержание и использование лабораторных животных соответствовало правилам и положениям, описанным в СанПиН 3.3686—21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней». Все эксперименты были одобрены комиссией по биоэтике при ФБУН «ГНЦПМБ» (ВП-2024/6).

Иммунизация и заражение животных

Животных иммунизировали подкожно двухсуточными агаровыми культурами испытуемых штаммов (по 40 свинок и 40 мышей на один штамм/смесь штаммов): морских свинок в дозе 5 × 10³ КОЕ в объеме 0,5 мл, белых мышей — 10⁴ КОЕ в объеме 0,2 мл. На 21-е сутки после иммунизации животных заражали культурой вирулентного штамма Y. pestis 231 в 4 дозах: 10², 10⁴, 10⁶, 10⁸ КОЕ (морских свинок в объеме 0,5 мл и белых мышей в объеме 0,2 мл). Одновременно заражали интактных (контрольных) животных в дозах 10, 50, 250, 1250 и 6250 КОЕ в том же объеме, как и для иммунизированных животных. Наблюдения за зараженными животными проводили в течение 20 сут. Погибших животных вскрывали и исследовали бактериологическим методом.

Иммуноферментный анализ

ИФА проводили, как описано ранее [19]. Для сенсибилизации планшет использовали растворы рекомбинантных белков Y. pestis (6 мкг/мл) в 0,1 М карбонат-бикарбонатном буфере (pH 9,6). Титром антител считали величину наибольшего разведения иммунной сыворотки, которой соответствовала оптическая плотность, превосходящая контрольное значение на 0,1 единицу, при условии достижения значения оптической плотности не меньше 0,2.

Определение напряженности иммунитета

Напряженность иммунитета, т.е. способность вакцинного препарата предохранять животное от заражения массивными дозами вирулентной культуры, определяли по формуле:

,

где ИИ — индекс иммунитета; LD50имм — LD₅₀ для животных, иммунизированных исследуемым препаратом, КОЕ; LD50инт — LD₅₀ для интактных животных, КОЕ.

Статистические методы

Величины LD₅₀ вирулентного штамма, полученные на иммунизированных и интактных животных, а также доверительные интервалы (для вероятности 95%) определяли по методу D.J.Kärber [20]. Для статистического анализа использовали Graph Pad Prism 6 (Graph Pad Software, La Jolla, CA), выполняя однофакторный дисперсионный анализ ANOVA. Различия считали достоверными при p≤0,05.

Результаты и обсуждение

Определение безвредности исследуемых штаммов

После однократного подкожного введения беспородным мышам и морским свинкам видимых признаков общей интоксикации и местных реакций у животных не наблюдали. Все животные из экспериментальных групп оставались подвижными, а поведенческие реакции были адекватными. У 100% вакцинированных животных шерсть оставалась гладкой и блестящей. Слизистые оболочки глаз и носа у всех экспериментальных животных не имели отклонений от нормы. В месте введения вакцинных препаратов ни у одного животного не отмечали гиперемии, отечности, некрозов и набухания региональных лимфатических узлов, что свидетельствует об отсутствии общетоксического действия на организм мышей и морских свинок. Динамика изменения массы тела мышей и морских свинок после подкожного введения исследуемых штаммов представлена на рис. 1.

Рис. 1. Динамика изменения массы тела мышей и морских свинок после подкожного введения исследуемых штаммов.

Антительный ответ к исследуемым штаммам

Уровни антител к F1 и LcrV антигенам в сыворотках крови мышей оценивали на 28 день после подкожной иммунизации исследуемыми штаммами Y. pestis в дозе 10⁴ КОЕ (рис. 2). Средние титры антител к F1 антигену в мышиных сыворотках после иммунизации культурой Y. pestis 231ΔnlpD и смесью культур Y. pestis 231ΔnlpD + Y. pestis EVΔlpxM превышали таковые, полученные после иммунизации штаммом Y. pestis EVΔlpxM (p<0,05). Средние анти-LcrV титры после иммунизации мышей различными штаммами не отличались.

Рис. 2. Средние реципрокные титры антител в сыворотках крови мышей и морских свинок после подкожного введения исследуемых штаммов.

Титры анти-F1- и анти-LcrV-антител в сыворотках крови вакцинированных и контрольных морских свинок определяли на 28-й день после подкожной иммунизации исследуемыми штаммами Y. pestis в дозе 5×10³ КОЕ (см. рис. 2). Реакция антител на F1 и LcrV антигены Y. pestis у морских свинок после введения исследуемых штаммов была однородной.

Уровни циркулирующих антител против F1 в крови мышей, иммунизированных штаммом Y. pestis 231ΔnlpD и смесью культур Y. pestis 231ΔnlpD + Y. pestis EVΔlpxM были значительно выше, чем у морских свинок, иммунизированных теми же штаммами.

В контрольной группе антитела к F1 и LcrV антигенам чумного микроба после введения фосфатного буферного солевого раствора (PBS) не обнаружены.

Протективная эффективность исследуемых штаммов

Результаты сравнительного определения напряженности иммунитета, индуцированного у лабораторных животных при введении аттенуированных штаммов Y. pestis, представлены в табл. 2 и 3. Как и в наших предыдущих экспериментах [1] при подкожной иммунизации мышей ΔnlpD мутант индуцировал иммунный ответ, более чем в 10⁵ раз превосходящий по напряженности ответ на введение ΔlpxM варианта вакцинного штамма EV, а NlpD⁻ вариант бактерий практически не защищал морских свинок от подкожного заражения возбудителем чумы, уступая штамму EVΔlpxM по напряженности формируемого иммунитета примерно в 10⁵ раз. Иммунизация же смесью аттенуированных штаммов обеспечивала индекс иммунитета более 10⁸ для обоих видов лабораторных животных.

Таблица 2. Показатели напряженности иммунитета у мышей, вакцинированных аттенуированными вариантами штаммов Y. pestis

Таблица 3. Показатели напряженности иммунитета у морских свинок, вакцинированных аттенуированными вариантами штаммов Y. pestis

Исследования кандидатных вакцин часто проводят на мелких видах лабораторных животных, что позволяет использовать большое количество животных, обеспечивающее статистическую достоверность полученных результатов. Однако прямая экстраполяция на людей результатов экспериментов на мелких животных недопустима по ряду соображений. Так, инбредные линии мышей, делающие данные более воспроизводимыми, не отражают изменчивость иммунного ответа в аутбредных популяциях людей. Межвидовые различия в рецепторах распознавания патогенов могут объяснять различия между людьми и грызунами в ответе на микробные вакцины. Существуют также видоспецифичные репертуары В-клеток и Т-клеток, а также HLA-презентация доминирующих эпитопов Т-клеткам CD4 и CD8. Из-за этих ограничений исследования кандидатных вакцин проводят на нескольких видах мелких и крупных животных, что, как ожидается, позволяет получать данные, более переносимые на людей [21].

В классической монографии, посвященной вакцинопрофилактике чумы, Е.И. Коробкова [6] отмечала, что одновременное введение вместе со штаммом EV в виде двухкомпонентной смеси полученных разными исследователями аттенуированных штаммов Y. pestis #46-S, M #74 или MP-40 (F1⁻) обеспечивало достоверно большую защиту зараженных мышей, чем эти же штаммы, но использованные для вакцинации по отдельности. Однако молекулярные механизмы как аттенуации, так и потенцирования протективного иммунного ответа были в то время неизвестны. Бурное развитие молекулярной микробиологии, геномики и постгеномных технологий дает возможность вернуться к рассмотрению феномена потенцирования иммунного ответа, но уже на новом молекулярном уровне. В настоящем исследовании мы оценили индукцию иммунного ответа аттенуированными штаммами EVΔlpxM (Δpgm) и 231ΔnlpD у двух видов лабораторных животных.

Межвидовые [22] и внутривидовые [22—25] различия иммунного ответа млекопитающих на контакт с возбудителем чумы свидетельствуют о целесообразности конструирования комбинированных (поликомпонентных) вакцин. Так, по мнению одного из наиболее креативных разработчиков современных чумных вакцин, Wei Sun [26], механизмы протективного иммунитета сложны и зависят от состава вакцины, способов и сроков ее введения, а также от отличий иммунной системы вакцинируемых. Автор особо обращает внимание на то, что гетерологичные «прайм-буст» иммунизации в целом ряде случаев достоверно более иммуногенны, чем гомологичные «прайм-буст» иммунизации. А комбинации различных форм вакцин с использованием стратегии гетерологичного «прайм-буста», например, субъединичной вакцины в сочетании с аттенуированным штаммом Y. pestis, могут повышать эффективность иммунизации как в отношении людей, у которых аллельный полиморфизм генов может быть причиной неудовлетворительного иммунного ответа на присутствующие в малокомпонентной вакцине антигены [27], так и в отношении нескольких антигенных вариантов возбудителя чумы [10, 11]. Его предположения были подтверждены сотрудниками отдела бактериологии Медицинского научно-исследовательского института инфекционных заболеваний армии США (USAMRIID), использовавшими для иммунизации комбинации аттенуированных штаммов Y. pestis CO92Pgm¯pPst¯Δcaf1 и CO92Pgm¯pPst¯Δcaf1/ΔyopD [28] или Y. pestis CO92ΔyscN и его бескапсульный вариант C12ΔyscN [29]. Как и ожидалось, наилучший протективный эффект обеспечила иммунизация комбинацией штаммов F1⁺ и F1⁻. Так, F1⁺ штамм Y. pestis CO92ΔyscN индуцировал ответ на капсульный антиген — основной иммуноген чумного микроба, а его бескапсульный вариант обеспечивал ответ на другие антигены, не скрытые у F1⁻ штамма C12ΔyscN капсулой. Хотя одна доза F1⁻ штамма Y. pestis C12ΔyscN не обеспечивала защиты мышей, вакцинация двумя дозами Y. pestis CO92ΔyscN с интервалом в 3—4 нед или комбинацией мутантов Y. pestis C12ΔyscN и CO92ΔyscN обеспечивала оптимальную защиту от бубонной или легочной чумы. Защита от F1+ штамма Y. pestis CO92 требовала включения в вакцинный препарат антигена F1 и была связана с высокими титрами анти-F1 [29].

Чисто теоретически два аттенуированных по разным генам штамма чумного микроба при контакте в одном шприце или организме вакцинируемого могут обменяться утраченными при аттенуации генами и реверсировать к вирулентности. Нам не удалось найти публикаций на эту тему, но передача плазмиды устойчивости к антибиотикам от донора Escherichia coli к Y. pestis происходила в средней кишке блохи с частотой 10⁻³ через 3 сут коинфекции, а через 4 нед 95% коинфицированных блох содержали в среднем 10³ трансконъюгантов Y. pestis, устойчивых к антибиотикам [30].

Однако известно, что при подкожном введении лабораторным животным в одном шприце смеси вирулентных и авирулентных бактерий чумного микроба, при содержании в смеси первых менее 1/1000, происходит развитие так называемого «феномена переживания» Н.Н. Гинсбурга [31], при котором процесс в организме животного протекает не как инфекционный, а как вакцинальный — накопления вирулентных бактерий не происходит.

Живые вакцины на основе нескольких штаммов, аттенуированных по разным молекулярным мишеням, показали свою эффективность еще в первой половине прошлого века. В наше время интерес к ним возвращается, а исследования ведутся уже с использованием прецизионного редактирования генома и постгеномных технологий, но по-прежнему первостепенное внимание необходимо уделять безопасности разрабатываемых препаратов для человека.

Заключение

Данное исследование влияния состава кандидатной живой чумной вакцины выявило усиление протективности в отношении двух видов лабораторных животных при включении в ее состав двух аттенуированных штаммов, отличающихся по антигенному составу и способности индуцировать напряженный иммунитет у мышей или морских свинок. Результаты, представленные в этом исследовании, устанавливают четкую связь между повышением содержания в препарате протективных антигенов и расширением спектра эффективно иммунизируемых индивидуумов. Будущие исследования должны быть направлены на поиск оптимальных комбинаций штаммов, аттенуированных за счет нокаутов различных молекулярных мишеней — генов, кодирующих факторы патогенности, и определение предпочтительного числа аттенуированных штаммов — компонентов такой поливалентной вакцины.

Финансирование. Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант 23-15-00132).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.