Введение
Нейропептиды осуществляют регуляцию болевой чувствительности и выступают в качестве нейротрансмиттеров в ноцицептивной и антиноцицептивной системе [1, 2]. Эндогенный циклический дипептид цикло-L-пролилглицин (ЦПГ), обнаруженный в мозге крыс в микромолярной концентрации [3], может образовываться из глицилпролилглутамата, отщепляющегося от N-конца инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-1) [4], который при интратекальном введении повышает болевой порог у крыс [5]. ЦПГ при внутрибрюшинном введении снижает выраженность острой висцеральной и соматической боли и острого экссудативного воспаления у мышей [6].
Ранее в ФГБНУ «ФИЦ оригинальных и перспективных биомедицинских и фармацевтических технологий» был сконструирован и синтезирован линейный аналог ЦПГ, этиловый эфир N-фенилацетилглицил-L-пролина (ГЗК-111). Он содержит последовательность Gly-Pro, в которой наличие имидной связи при пролине способствует циклизации Gly-Pro. Установлено, что ГЗК-111 может метаболизироваться до ЦПГ. В экспериментах на животных показано, что ГЗК-111, как и ЦПГ, при внутрибрюшинном введении оказывает антиамнестическое, антигипоксическое и анксиолитическое действие, что позволяет рассматривать ГЗК-111 как «пролекарство» ЦПГ [7]. В тесте «Горячая пластина» у мышей, моделирующем острую соматическую боль на супраспинальном уровне, ГЗК-111 эффективен в дозах 1 мг/кг, 2 мг/кг и 4 мг/кг [8]. Известно, что ЦПГ дозозависимо снижает проявления болевых реакций у мышей в тесте формалиновой боли, патогенез которой обусловлен действием формалина на ноцицепторы кожи, развитием воспаления и центральной сенситизацией [9, 10].
В продолжение изучения противоболевого действия ГЗК-111 целью настоящей работы явилась оценка противоболевого эффекта ГЗК-111 в сравнении с ЦПГ в формалиновом тесте у мышей.
Материал и методы
Животные. Эксперименты выполнены на белых мышах-самцах ICR массой 24—28 г, полученных из питомника филиала «Столбовая» ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России». Организацию и проведение работ осуществляли в соответствии с ГОСТ 33216-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами», ГОСТ 33215-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными» и директивой 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях.
Изучаемые соединения. Этиловый эфир N-фенилацетилглицил-L-пролина (ГЗК-111, серия 03.19, т.пл. 111—112 °C, [α]20D —88,0° (с=1% (m/V), метанол)) и цикло-L-пролилглицин (ЦПГ, серия КЗ-36, т.пл. 203—206 °C, [α]20D —202,0° (с=1% (m/V), вода)) были синтезированы и предоставлены для исследования лабораторией пептидных регуляторов отдела химии лекарственных средств ФГБНУ «ФИЦ оригинальных и перспективных биомедицинских и фармацевтических технологий».
Формалиновый тест. Применяли 2,5% раствор формалина, который вводили в объеме 20 мкл в область плюсны мышей с помощью шприца Гамильтона [11]. Сразу после введения 2,5% раствора формалина в лапу мышей помещали в индивидуальные прозрачные плексигласовые камеры, на подставку, под которой располагали зеркало для обеспечения обзора лап через пол камер, и с помощью программного обеспечения Real Timer (процедурный таймер, НПК «Открытая наука», Россия) в течение 30 мин регистрировали длительность (в секундах) свидетельствующего о боли поведения. Фиксировали следующие реакции: лапа поднята над полом камеры полностью; лапа поджата, то есть животное касается поверхности пола камеры только латеральной стороной лапы; облизывание лапы. Длительность свидетельствующего о боли поведения мышей регистрировали по фазам боли: I фаза боли длится первые 5 мин после введения 2,5% раствора формалина; интерфаза — с 5-й по 15-ю минуту; II фаза боли — с 15-й по 30-ю минуту после введения формалина. Для детального анализа и построения графиков динамики влияния ГЗК-111 и ЦПГ на поведение мышей подсчитывали длительность поведенческих реакций, свидетельствующих о боли в отдельные пятиминутные интервалы (рис. 1).
Рис. 1. Временные интервалы после введения в лапу мышей ICR 2,5% раствора формалина, в течение которых подсчитывали длительность свидетельствующего о боли поведения животных.
Противоболевой эффект ГЗК-111 и ЦПГ оценивали при однократном внутрибрюшинном введении соединений за 1 ч до тестирования в дозах 2 мг/кг и 4 мг/кг. Выбор доз ГЗК-111 и ЦПГ осуществлен на основании ранее проведенных исследований [12]. Контрольным животным внутрибрюшинно вводили эквивалентный объем растворителя — физиологического раствора натрия хлорида (10 мл/кг).
Статистический анализ. Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью программы Statistica 10.0. Нормальность распределения данных проверяли критерием Шапиро—Уилка с последующей оценкой межгруппового равенства дисперсий критерием Левена. При нормальном распределении в группах и соблюдении межгруппового равенства дисперсий дальнейшую статистическую обработку проводили путем однофакторного дисперсионного анализа с последующим сравнением групп с помощью критерия Ньюмена—Кейлса и t-критерия Стьюдента. При отсутствии нормального распределения использовали критерий Краскела—Уоллиса с последующим статистическим анализом данных методом сравнения средних рангов для всех групп и критерий Манна—Уитни. Различия между группами считали статистически значимыми при p≤0,05. Результаты представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (стандартное отклонение).
Результаты
После введения в заднюю лапу 2,5% раствора формалина у мышей ICR регистрировали два типа болевого поведения: свидетельствующее о более выраженной реакции облизывание лапы и о менее выраженной реакции поднятие и поджатие лапы. В I фазу боли (0—5 мин после введения формалина) длительность болевых реакций мышей (сумма длительности поднятия и поджатия лапы и ее облизывания) в контрольной группе составляла 256,6 с. Далее наблюдали интерфазу — минимальное проявление болевых реакций вследствие гиперполяризации и временной инактивации нейронов, последующее повышение возбудимости которых и центробежное распространение формалина в коже вызывает II фазу боли [10]. Так, в интервал 5—10 мин после введения альгогена длительность болевых реакций в контрольной группе составляла 152,2 с, а в интервал 10—15 мин время болевых реакций в контрольной группе было равно 228,1 с. Длительность болевых реакций у животных контрольной группы во II фазу боли (15—30 мин после введения формалина) с 15-й по 20-ю минуту после введения формалина составляла 273,9 с, с 20-й по 25-ю минуту — 287,3 с, с 25-й по 30-ю минуту — 270,9 с (таблица). Зарегистрированная двухфазная болевая реакция обусловлена динамикой появления у животных выраженной болевой реакции — облизывания поврежденной лапы. Так, в контрольной группе длительность облизывания лапы мышами в острую фазу боли составляла 116,8 с; в периоды с 5-й по 10-ю и с 10-й по 15-ю минуту она снижалась соответственно до 16,3 с и 59,4 с, а в интервалы с 15-й по 20-ю и с 20-й по 25-ю минуту после введения альгогена достигала максимума, соответствующего 131,0 с и 137,5 с (рис. 2). Длительность поднятия и поджатия лапы мышами в отдельные пятиминутные интервалы регистрации варьировала не так выраженно, как длительность облизывания лапы. Так, минимальное время поднятия и поджатия лапы за пятиминутный интервал на протяжении 30 мин наблюдения в контрольной группе зафиксировано в I фазу боли и составляло 116,8 с, максимальное — в интервал с 10-й по 15-ю минуту, оно составляло 168,7 с (рис. 3).
Рис. 2. Влияние ГЗК-111 (а) и ЦПГ (б) на длительность облизывания лапы мышами после введения им в лапу 2,5% формалина.
Примечание. * — p<0,05 по сравнению с группой «Контроль, физраствор», критерий Манна—Уитни; # — p<0,05 по сравнению с группой «ГЗК-111 4 мг/кг» или «ЦПГ 4 мг/кг» (в зависимости от графика), критерий Манна—Уитни (при отсутствии нормального распределения) / t-критерий Стьюдента (при наличии нормального распределения и межгрупповом равенстве дисперсий Левена: 10—15-я минуты после введения формалина, график для ЦПГ).
Рис. 3. Влияние ГЗК-111 (а) и ЦПГ (б) на длительность поднятия и поджатия лапы мышами после введения им в лапу 2,5% формалина.
Примечание. * — p<0,05 по сравнению с группой «Контроль, физраствор», критерий Манна—Уитни (при отсутствии нормального распределения) / t-критерий Стьюдента (при наличии нормального распределения и межгрупповом равенстве дисперсий Левена: 15—20-я (поднятие и поджатие лапы), 20—25-я, 25—30-я минуты после введения формалина, график для ЦПГ); ** — p<0,05 по сравнению с группой «Контроль, физраствор», критерий Краскела—Уоллиса с последующим статистическим анализом данных методом сравнения средних рангов для всех групп (при отсутствии нормального распределения); # — p<0,05 по сравнению с группой «ГЗК-111 4 мг/кг» или «ЦПГ 4 мг/кг», критерий Манна—Уитни (при отсутствии нормального распределения).
ГЗК-111 при однократном внутрибрюшинном введении мышам ICR в обеих изученных дозах — 2 мг/кг и 4 мг/кг оказывал значимое действие на болевое поведение животных. Более выраженный эффект дипептида зарегистрирован при его применении в дозе 2 мг/кг. Методом множественных сравнений (в зависимости от наличия нормального распределения использовали критерий Ньюмена—Кейлса или критерий Краскела—Уоллиса с последующим статистическим анализом данных методом сравнения средних рангов для всех групп) выявлено значимое снижение длительности болевых реакций мышей (сумма длительности поднятия и поджатия лапы и ее облизывания) после введения им ГЗК-111 относительно контрольной группы как в отдельные пятиминутные интервалы (10—15 мин, 15—20 мин), так и за весь период интерфазы (5—15 мин) и II фазы боли (15—30 мин). Так, ГЗК-111 в дозе 2 мг/кг значимо снизил время болевых реакций в интерфазу — в 3,5 раза, в том числе уменьшил время болевых реакций в период с 10-й по 15-ю минуту после введения альгогена в 4,3 раза. Длительность болевых реакций во II фазу боли при применении ГЗК-111 в дозе 2 мг/кг значимо уменьшилась — на 30,2%, в частности в период с 15-й по 20-ю минуту после введения формалина время болевых реакций значимо снизилось — на 41,3% (см. таблицу). В периоды с 5-й по 10-ю минуту, с 20-й по 25-ю минуту и с 25-й по 30-ю минуту ГЗК-111 снижал время болевых реакций (сумма длительности поднятия и поджатия лапы и ее облизывания) соответственно в 2,7 раза и на 22,0% и 28,1% (p≤0,05, критерий Манна—Уитни). ГЗК-111 в дозе 4 мг/кг значимо уменьшал длительность болевых реакций по сравнению с контрольной группой — в 2,2 раза в период с 10-й по 15-ю минуту после введения формалина (p≤0,05, критерий Краскела—Уоллиса с последующим статистическим анализом данных методом сравнения средних рангов для всех групп) и на 39,8% за весь период интерфазы (p≤0,05, критерий Манна—Уитни) (см. таблицу). ГЗК-111 проявлял противоболевой эффект преимущественно за счет влияния на время поднятия и поджатия лапы; значимое влияние дипептида в дозе 2 мг/кг на время облизывания лапы зарегистрировано в период с 5-й по 10-ю минуту после введения формалина (см. рис. 2, 3). Противоболевой эффект ГЗК-111 в дозе 2 мг/кг был более выражен, чем при его введении в дозе 4 мг/кг (см. рис. 2, таблицу).
Влияние ГЗК-111 и ЦПГ при однократном внутрибрюшинном введении на длительность болевых реакций у мышей (сумма длительности поднятия и поджатия лапы и ее облизывания) после введения им в заднюю лапу 2,5% раствора формалина.
| Группа | Число мышей | I фаза (0—5-я минуты), с | Интерфаза, сумма болевых реакций в отдельные промежутки (5—10-я, 10—15-я минуты) и за весь ее период (5—15-я минуты), с | II фаза боли, сумма болевых реакций в отдельные промежутки (15—20-я, 20—25-я, 25—30-я минуты) и за весь ее период (15—30-я минуты), с | |||||
| У0—5-я минуты | У5—10-я минуты | У10—15-я минуты | У5—15-я минуты | У15—20-я минуты | У20—25-я минуты | У25—30-я минуты | У15—30-я минуты | ||
| Контроль, физраствор | 10 | 256,6±12,0 (37,9) | 152,2±27,7 (87,15) | 228,1±22,7 (71,8) | 380,3±47,2 (149,1) | 273,9±10,7 (33,9) | 287,3±4,8 (15,1) | 270,9±14,8 (46,8) | 832,1±20,6 (65,0) |
| ГЗК-111, 2 мг/кг | 10 | 228,1±17,6 (55,5) | 55,5±28,1 (88,9)* | 53,2±13,0 (41,1)** | 108,7±34,5 (109,0)** | 160,9±16,2 (51,1)** | 224,2±25,3 (80,0)* | 194,9±24,2 (76,6)* | 580,0±52,9 (167,2)** |
| ГЗК-111, 4 мг/кг | 10 | 269,6±7,0 (22,3) | 126,6±19,7 (62,4)# | 102,3±30,8 (97,5)** | 229,0±41,1 (130,0)*# | 207,0±25,0 (79,1) | 253,8±17,8 (56,3) | 282,3±6,7 (21,1) | 743,2±41,5 (131,4) |
| ЦПГ, 2 мг/кг | 9 | 264,0±10,5 (31,5) | 141,3±23,4 (70,2)# | 157,9±30,9 (92,7)# | 299,1±43,5 (130,5)# | 228,5±20,7 (62,2)# | 266,3±17,7 (53,2) | 258,4±23,4 (70,2) | 753,2±47,4 (142,1) |
| ЦПГ, 4 мг/кг | 9 | 253,2±18,2 (54,5) | 101,7±30,9 (92,7) | 105,5±27,9 (83,7)* | 207,1±52,2 (156,6) | 253,1±17,0 (51,0)# | 292,0±5,3 (15,8) | 291,3±5,4 (16,2)# | 836,4±25,6 (76,9)## |
Примечание. Данные представлены в виде среднего значения и стандартной ошибки среднего (стандартного отклонения): M±SD. ГЗК-111 — этиловый эфир N-фенилацетилглицил-L-пролина; ЦПГ — цикло-L-пролилглицин; * — p≤0,05 по сравнению с группой «Контроль, физраствор», критерий Манна—Уитни; ** — p≤0,05 по сравнению с группой «Контроль, физраствор», критерий Краскела—Уоллиса с последующим статистическим анализом данных методом сравнения средних рангов для всех групп; # — p≤0,05 по сравнению с группой «ГЗК-111 2 мг/кг», критерий Манна—Уитни; ## — p≤0,005 по сравнению с группой «ГЗК-111 2 мг/кг», критерий Краскела—Уоллиса с последующим статистическим анализом данных методом сравнения средних рангов для всех групп.
ЦПГ при однократном внутрибрюшинном введении в дозах 2 мг/кг и 4 мг/кг мышам ICR менее выраженно по сравнению с ГЗК-111 в этих дозах влиял на болевое поведение мышей (см. таблицу). Показатель суммы длительности болевых реакций был значимо, в 2,2 раза, ниже контрольных значений только при введении ЦПГ в дозе 4 мг/кг в период с 10-й по 15-ю минуту после введения формалина (p≤0,05, критерий Манна—Уитни) (см. таблицу). ЦПГ в меньшей дозе, 2 мг/кг, уменьшал длительность поднятия и поджатия лапы в интервалы с 15-й по 20-ю минуту, с 20-й по 25-ю минуту и с 25-й по 30-ю минуту после введения альгогена соответственно на 37,6%, 45,5% и 36,8% по сравнению с контрольной группой (p≤0,05, критерий Манна—Уитни) (см. рис. 3). Показатель суммы длительности болевых реакций при введении ЦПГ в дозе 2 мг/кг был значимо ниже (p≤0,05, критерий Манна—Уитни) по сравнению с таковым при введении ГЗК-111 в этой же дозе на протяжении всей интерфазы и в период с 15-й по 20-ю минуту после введения формалина (см. таблицу). ГЗК-111 в дозе 2 мг/кг также значимо более выраженно (p≤0,05, критерий Манна—Уитни) влиял на сумму длительности болевых реакций по сравнению с ЦПГ в дозе 4 мг/кг в периоды с 15-й по 20-ю минуту, с 25-й по 30-ю минуту после введения формалина и за весь период II фазы боли (см. таблицу).
Обсуждение
Боль, развивающаяся у мышей после введения им в лапу раствора формалина, имитирует реакции, вызванные разрезом кожи во время операции. Формалиновый тест позволяет оценить влияние веществ на спонтанное болевое поведение животных, характеризующееся двумя фазами. Первая фаза обусловлена действием альгогена на первичные ноцицептивные афференты, а именно стимуляцией формалином ионного канала TRPA1 нервных окончаний; вторая фаза отодвинута по времени, механизм ее развития связывают с развивающейся воспалительной реакцией и центральной сенситизацией [9, 10]. Концентрация раствора формалина в формалиновом тесте может варьировать от 0,5% до 15% [11]. В проведенном нами исследовании использовали 2,5% раствор формалина, так как ранее было показано, что ЦПГ снижал длительность болевых реакций у мышей, вызванных введением им в лапу раствора формалина именно этой концентрации [6].
Установлено, что ЦПГ при однократном внутрибрюшинном введении в дозах 2 мг/кг и 4 мг/кг проявил способность значимо снижать длительность болевых реакций у мышей с формалиновой болью в отдельные пятиминутные интервалы регистрации болевой чувствительности. Причем длительность суммы болевых реакций (сумма длительности поднятия и поджатия лапы и ее облизывания) ЦПГ снижал только при введении в дозе 4 мг/кг в период с 10-й по 15-ю минуту после введения формалина за счет длительности поднятия, поджатия и облизывания лапы, а в дозе 2 мг/кг ЦПГ уменьшал только время поднятия и поджатия лапы во II фазу боли (см. рис. 2, 3, таблицу). Облизывание лапы животными после введения в нее раствора формалина рассматривается в качестве поведенческой реакции, свидетельствующей о боли большей выраженности, чем поднятие и поджатие лапы [13]. Ее регуляция осуществляется на супраспинальном уровне, включающем переднюю поясную кору [14]. J.N. Ferro и соавт. [6] установили, что ЦПГ при однократном внутрибрюшинном введении оказывал дозозависимое противоболевое действие в диапазоне доз 0,1—10 мкмоль/кг в формалиновом тесте у мышей и значимо снижал длительность облизывания лап в I и II фазы формалинового теста. Используемые нами дозы ЦПГ 2 мг/кг и 4 мг/кг соответствуют дозам 13 мкмоль/кг и 26 мкмоль/кг. Отсутствие значимого влияния ЦПГ в дозах 2 мг/кг и 4 мг/кг в I фазу боли и на время облизывания лап во II фазу боли в проведенном нами опыте мы связываем с развитием более выраженной боли, чем в эксперименте, проведенном J.N. Ferro и соавт. [6]. Так, время облизывания лапы мышами контрольной группы (среднее значение) в I и II фазы формалинового теста в проведенном нами опыте соответствовало 117 с и 359 с, а в эксперименте, описанном J.N. Ferro и соавт., в I фазу формалинового теста оно было менее 75 с, во II фазу — менее 250 с. Более выраженная болевая реакция, которая развилась у животных в проведенном нами эксперименте, может быть отчасти обусловлена тем, что были использованы мыши разных линий и возрастов. Так, в нашем эксперименте работа выполнена на мышах ICR (24—28 г), а у J.N. Ferro и соавт. — на мышах Swiss (18—22 г.). Поскольку сублинии мышей C57BL/6, C57BL/6J и C57BL/6N различаются по проявлениям болевого поведения в формалиновом тесте [15], нельзя исключить наличия у мышей ICR и Swiss определенных различий в чувствительности к формалиновой боли.
ГЗК-111 при однократном внутрибрюшинном введении в дозах 2 мг/кг и 4 мг/кг мышам ICR оказывал более выраженное противоболевое действие, чем ЦПГ в этих дозах. Фармакокинетическое исследование показало, что ГЗК-111 подвергается интенсивной биотрансформации; его концентрацию в крови удается зафиксировать в течение 1 ч после однократного внутрижелудочного введения крысам в дозе 20 мг/кг [16 ]. Наряду с ЦПГ метаболитами ГЗК-111 являются N-фенилацетилглицил-L-пролин, образующийся из него N-фенилацетилглицин и фенилуксусная кислота [17]. При этом степень превращения ГЗК-111 в N-фенилацетилглицил-L-пролин и N-фенилацетилглицин гораздо выше, чем в ЦПГ, а концентрация фенилуксусной кислоты не намного превышает фоновый уровень. Так, величина степени превращения ГЗК-111 в N-фенилацетилглицил-L-пролин соответствует 46 586, в N-фенилацетилглицин — 474, в ЦПГ — 67 [16]. Ввиду того, что эффект ГЗК-111 в формалиновом тесте у мышей превосходит эффект ЦПГ и для ЦПГ ранее был зарегистрирован дозозависимый противоболевой эффект в формалиновом тесте [6], можно полагать, что противоболевой эффект ГЗК-111 объясняется как его собственным действием, так и действием других активных метаболитов. ЦПГ оказывает положительное модулирующее влияние на AMPA-рецептор [18], и положительные аллостерические модуляторы АМРА-рецептора обладают анальгетическим действием [19]. Не исключено, что ГЗК-111 и его другие активные метаболиты могут оказывать влияние на АМРА-рецептор, что требует дальнейшего изучения.
Заключение
Линейный аналог эндогенного нейропептида цикло-L-пролилглицина, этиловый эфир N-фенилацетилглицил-L-пролина (ГЗК-111), в дозах 2 мг/кг и 4 мг/кг проявляет противоболевое действие на модели острой соматической боли у мышей, вызванной введением в лапу 2,5% раствора формалина. Выраженность и динамика развития эффекта ГЗК-111 превосходит эффект цикло-L-пролилглицина: эффект ГЗК-111 наступает раньше и сохраняется с 5-й по 30-ю минуту после введения альгогена.
Работа выполнена в рамках госзадания по теме №FGFG-2024-0001.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.