Шизофрения представляет заболевание с существенным этиологическим вкладом генетических факторов. Вместе с тем доказана значительная роль средовых воздействий в развитии и тяжести проявлений шизофрении [1, 2]. Одним из вероятных средовых факторов риска шизофрении является неблагоприятный детский опыт (НДО) (adverse childhood experiences, ACE) — события, происходящие в семье или в социальной среде, которые причиняют вред или страдания ребенку, тем самым нарушая его физическое или психологическое здоровье и развитие [3]. К НДО относят жестокое обращение, т.е. физическое, эмоциональное и вербальное насилие, пренебрежение физическими или эмоциональными потребностями ребенка, а также дисфункциональность семьи, включая наличие у ее членов алкогольной или наркотической зависимости, психических расстройств, криминальной истории, случаи, когда ребенок становится свидетелем насилия над матерью, и разлуку с одним из родителей в силу развода или смерти. К этим 10 «основным» видам НДО на основе эмпирических исследований предложено добавить бедность, виктимизацию сверстниками, помещение в приемную семью или контакт с организацией по защите детей, насилие по соседству, физическое наказание и родительский патологический гэмблинг [4]. Обобщенные данные свидетельствуют, что травмирующие события детства существенно увеличивают риск развития психоза [1]. Кроме того, тяжесть НДО коррелирует с выраженностью психопатологических симптомов и когнитивного дефицита больных [5].

Биологические механизмы влияния на шизофрению ранних средовых факторов, в том числе НДО, остаются малоизученными. Наиболее распространенным является объяснение в рамках аллостатической модели, постулирующей изменения в ответ на стресс или в ожидании стресса в ряде систем, включая ось гипоталамус-гипофиз-надпочечники, иммунную, вегетативную и ЦНС [6]. Предполагается, в частности, что события, имеющие место на ранних стадиях онтогенеза, оказывают влияние на здоровье и поведение во взрослом возрасте через активацию гормонами стресса иммунной системы, что в свою очередь нарушает развитие мозга. Более того, неконтролируемое нейровоспаление предложено рассматривать в качестве общего для генетических и средовых эффектов патогенетического звена шизофрении [7], что согласуется с многочисленными данными об изменении концентрации иммунологических маркеров в крови больных психозами [7—9] и лиц с НДО [6]. Однако ответ организма на действие среды вариативен и зависит от ряда факторов, включая генетические особенности ребенка. В связи с этим с точки зрения разработки превентивных мер перспективным представляется изучение генетического полиморфизма иммунной системы как модификатора влияния НДО на последующее возникновение и течение шизофрении.

В опубликованных исследованиях генов-кандидатов [2, 10] генетический полиморфизм, связанный с иммунным ответом, в основном рассматривался как потенциальный модификатор действия биологических факторов риска шизофрении, включая родовые осложнения, сезон рождения и инфекцию. В то же время в связи с НДО исследователи преимущественно обращались к генам, вовлеченным в пластичность нервной системы и ответ на психологический стресс, в частности BDNF и FKBP5. Недавно проведенные исследования эффектов взаимодействия НДО с полигенными показателями риска (PRS) шизофрении, полученными на основе полногеномных исследований (GWAS), указывают на возможность взаимодействия PRS и НДО в развитии заболевания [2], но не проливают свет на конкретные генетические варианты, вовлеченные в ответ организма на НДО.

Учитывая сказанное и основываясь на ряде современных иммунных гипотез шизофрении [9], в данной работе оценивалась роль в проявлениях заболевания генетических факторов, связанных с экспрессией цитокинов — ключевых посредников взаимодействия иммунных и нервных клеток. Для исследования были выбраны три полиморфных сайта, находящиеся в промоторах генов, кодирующих интерлейкины, ИЛ-1β (IL1B rs16944) и ИЛ-4 (IL4 rs2243250) и фактор некроза опухоли альфа (TNF-α rs1800629). Выбранные полиморфные сайты коррелируют с концентрацией кодируемых данными генами белков и других маркеров воспаления в крови [11—13]. Кроме того, каждый из трех генов входит в кластер из нескольких генов иммунного ответа, расположенных рядом на хромосоме и имеющих во многом общую геномную регуляцию [14]. Соответственно rs16944, rs2243250 и rs1800629, согласно данным восьмой версии проекта Genotype-Tissue Expression (GTEx v8) [15], представляют cis eQTL (т.е. влияют на экспрессию) целого ряда близлежащих генов. Так, ген IL1B, кодирующий одноименный провоспалительный цитокин, вместе с восемью другими генами семейства интерлейкина 1 образует кластер генов цитокинов на хромосоме 2. Ген IL4, кодирующий цитокин типа 2, играющий важную роль в восстановлении тканей и контроле провоспалительных цитокинов типа 1, входит в кластер генов цитокинов IL3, IL5, IL13 и CSF2 на хромосоме 5. Ген многофункционального провоспалительного цитокина TNF-α расположен в главном комплексе гистосовместимости на хромосоме 6; его промотор одновременно является энхансером для еще 60 генов этого участка генома [16].

Нужно отметить, что полиморфные сайты rs16944, rs2243250 и rs1800629 не попадают в регионы, ассоциированные с риском шизофрении по данным GWAS, хотя rs1800629 находится недалеко от локуса, показавшего самую сильную связь с заболеванием [17], и демонстрирует в европейских популяциях умеренное неравновесие по сцеплению с теговым полиморфизмом rs13195636 этого локуса (D^׀=0,64; R²=0,20) [18]. Вместе с тем продемонстрирована ассоциация выбранных полиморфных сайтов с особенностями развития ЦНС и формированием релевантных шизофрении психологических характеристик, в том числе во взаимодействии с биологическими и психосоциальными стрессорами [19—22]. Эти эмпирические данные дополняют гипотезы о роли иммунной системы в опосредовании действия средового риска на развитие шизофрении и позволяют предположить вклад выбранных полиморфизмов в модификацию влияний НДО на проявления заболевания.

Цель исследования — оценка эффектов взаимодействия полиморфных сайтов IL1B rs16944, IL4 rs2243250 и TNF-α rs1800629 с НДО на выраженность симптомов шизофрении. Для дифференцированного исследования симптоматики была использована пятифакторная модель шкалы позитивных и негативных синдромов (PANSS) с встроенной двухфакторной моделью негативного синдрома, постулирующей наличие субсиндромов снижения экспрессии и амотивированности [23]. Гипотеза исследования состояла в том, что гены иммунного ответа модифицируют эффект НДО на проявления и тяжесть шизофрении, что будет проявляться в различиях в выраженности симптомов в группе пациентов с НДО между носителями разных генотипов.

Материал и методы

В исследование вошли 546 пациентов (55% женщин, средний возраст 34,45±14,17 года), которые проходили стационарное лечение в НЦПЗ или ПКБ №1 им. Н.А. Алексеева. Средний возраст манифестации заболевания — 22,73±8,81 года; 90% пациентов страдали основными формами шизофрении (F20).

Критерии включения: диагноз шизофрении или расстройств шизофренического спектра согласно Международной классификации болезней (F20, F21, F23.1, F25), возраст не младше 16 лет, европейское этническое происхождение, возможность сбора информации об НДО.

Критерии невключения: отсутствие согласия на участие в исследовании.

Исследование было одобрено Этическим комитетом НЦПЗ. Все участники подписали информированное согласие, сдали биологические образцы для выделения ДНК и прошли стандартное клиническое обследование.

В качестве НДО рассматривали злоупотребление алкоголем или наркотиками одним из родителей, наличие психического заболевания (расстройства шизофренического и аффективного спектров) у родителя, криминальную историю родителя, случаи пережитого физического или сексуального насилия в возрасте до 16 лет включительно, насилие в семье, свидетелем которого был ребенок, воспитание в детском доме или приемной семье. Учитывая распространенность неполных семей, не включался развод и утрата родителей в результате соматических заболеваний или несчастных случаев, если это не влекло насилия над ребенком или игнорирование его нужд. Сбор данных об НДО проводили с помощью структурированного анализа медицинской документации: сведения из истории болезни заносились в специальную анкету, содержащую основную социально-демографическую информацию о пациенте, а также пункты для описания каждого из перечисленных выше видов НДО. Кроме того, после подписания информированного согласия пациентам предлагали короткий опросник, включавший пункты о родительской семье, в том числе о наличии в ней злоупотреблений психоактивными веществами и психических заболеваний. Заполненный пациентом опросник служил для последующей проверки и уточнения сведений из медицинской документации. Информацию считали достаточной для включения кандидата в выборку, если имелись данные о присутствии любого или об отсутствии всех перечисленных видов НДО.

Значения факторов PANSS вычисляли в соответствии с данными метаанализа предшествующих факторно-аналитических исследований [23]. Фактор позитивных симптомов включал пункты: П1 — бред, П3 — галлюцинации, П5 — идеи величия, П5 — подозрительность, О9 — необычное содержание мыслей и О12 — снижение критичности; когнитивно-дезорганизационный фактор: П2 — расстройства мышления, Н5 — нарушения абстрактного мышления, Н7 — стереотипное мышление, О5 — манерность, О10 — дезориентированность, О11 — нарушение внимания, О13 — расстройство воли и О15 — загруженность психическими переживаниями; депрессивно-тревожный фактор: О1 — соматическая озабоченность, О2 — тревога, О3 — чувство вины, О6 — депрессия; фактор враждебности: П4 — возбуждение, П7 — враждебность, О4 — напряженность, О8 — малоконтактность и О14 — ослабление контроля импульсивности. Негативный фактор, в соответствии с моделью С.Р. Мардера, состоял из подсиндромов снижения экспрессивности (Н1 — притупленный аффект, Н3 — трудности в общении, Н6 — нарушение спонтанности и плавности речи и О7 — моторная заторможенность) и социальной амотивированности (Н2 — эмоциональная отгороженность, Н4 — пассивно-апатическая социальная отгороженность и О16 — активная социальная отстраненность). Симптомы оценивали после начала лечения, при первичной стабилизации состояния.

Генотипирование

ДНК из образцов крови или слюны экстрагировали стандартным фенол-хлороформным методом. Генотипирование проводили на приборе Bio-Rad IQ5 методом полимеразной цепной реакции с последующим анализом полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (IL1B и IL4) или с применением флюоресцентно меченных проб (для TNF-α) в соответствии с протоколами, подробно описанными ранее [24, 25]. Генотипы в сайтах IL1B rs16944, IL4 rs2243250 и TNF-α rs1800629 были получены для 501, 400 и 379 человек соответственно. Для каждого из трех полиморфизмов соблюдалось равновесие Харди—Вайнберга (все p<0,05) и частоты минорного аллеля соответствовали ожидаемым в европейской популяции (0,35, 0,19 и 0,12 соответственно).

Статистическую обработку данных проводили с использованием программы JASP 0.16 [26]. Демографические показатели анализировали с помощью t-критерия Стьюдента и критерия χ² Пирсона. Изучение эффектов генотип-средовых взаимодействий на симптомы шизофрении проводили методом ковариационного анализа (ANCOVA). В модель для каждой группы симптомов в качестве предикторов вводили показатель НДО (0 — нет, 1 — есть хотя бы один из видов НДО), генотип по одному из полиморфных сайтов (гомозиготы по распространенному аллелю против носителей минорного аллеля) и их взаимодействие, а также пол и возраст в качестве ковариат. Поправку на множественную проверку гипотез (18 моделей=3 полиморфизма×6 групп симптомов) проводили методом Беньямини—Хохберга (FDR <0,05). Для post-hoc сравнений использовали критерий достоверно значимой разности Тьюки. Уровень значимости принимали равным α=0,05.

Результаты

Характеристики групп с НДО и без НДО в анамнезе

НДО был выявлен у 258 (47%) из 546 пациентов. Группы с НДО и без такового не различались по клинико-демографическим параметрам (табл. 1). Однако для всех факторов PANSS отмечались половые различия (p<0,05) и, за исключением тревожно-депрессивной симптоматики, корреляции с возрастом (p<0,001). Поэтому пол и возраст учитывались в дальнейшем анализе. ANCOVA, проведенный с контролем этих демографических характеристик, не обнаружил значимого эффекта НДО на выраженность синдромов PANSS. Стоит тем не менее отметить, что при наличии НДО выраженность всех симптомов была несколько выше, а для враждебности и социальной амотивированности различия приближались к порогу достоверности (p=0,090 и p=0,093 соответственно).

Таблица 1. Клинико-демографические показатели групп с НДО в анамнезе и без такового

Примечание. Для количественных признаков даны средние значения и стандартные отклонения.

Далее было изучено наличие генотип-средовых корреляций между НДО и каждым из трех полиморфных сайтов, т.е. гипотеза о том, что присутствие определенного аллеля в генотипе может быть связано с повышением риска НДО. В целом НДО и генотипы не коррелировали, хотя наблюдалась тенденция к накоплению гомозигот TNF-α rs1800629 GG среди пациентов с НДО (χ²=3,53; p=0,060).

Эффекты генотип-средовых взаимодействий на симптомы шизофрении

Результаты анализа генотип-средовых взаимодействий представлены в табл. 2. ANCOVA выявил значимый после поправки на множественность сравнений эффект взаимодействия НДО и TNF-α rs1800629 на когнитивно-дезорганизационный фактор (p_FDR<0,018; η²=0,03). Post-hoc анализ свидетельствовал о значимом повышении когнитивно-дезорганизационных симптомов в группах гомозигот GG с НДО (p_Tukey=0,030) и носителей аллеля A без НДО (p_Tukey=0,011) относительно гомозигот GG без НДО (см. рисунок, а). Далее был проведен дополнительный анализ выявленного эффекта. Во-первых, для оценки роли пола в этом эффекте оценивались различия между носителями различных генотипов в подгруппах мужчин и женщин без НДО. Значимые различия были выявлены только для женщин (F=9,05; p=0,003). Во-вторых, поскольку полимофизм TNF-α rs1800629 находится в неравновесии по сцеплению с индексным полиморфизмом GWAS шизофрении, а также учитывая тенденцию к генотип-средовой корреляции между TNF-α rs1800629 и наличием НДО, для более четкого разделения средовых и генетических влияний НДО был разделен на факторы, связанные и не связанные с насилием. К первым относились прямые указания на пережитое физическое или сексуальное насилие, криминальность, алкоголизм и наркоманию родителей, насилие над другим членом семьи независимо от наличия психического расстройства у родителей. Во вторую группу включались психические расстройства родителей, не отягощенные насилием. Воспитание в благополучной приемной семье или детском доме из анализа были исключены. Эффект взаимодействия НДО и генотипа на когнитивно-дезорганизационный синдром остался значимым (F=5,87; p=0,003; η²_p=0,03). Лица без НДО в анамнезе достоверно различались по когнитивно-дезорганизационным симптомам в зависимости от генотипа TNF-α rs1800629 (p_Tukey=0,028), а лица с НДО в виде насилия и психического расстройства родителей были сходны между собой (см. рисунок, б). Наконец, было установлено, какие симптомы когнитивно-дезорганизационного фактора вносят основной вклад в его ассоциацию с TNF-α rs1800629. Стереотипное мышление (Н7) и расстройство воли (О13) имели самые высокие корреляции с фактором (r_o=0,84 и r_o=0,82 соответственно) и самую высокую значимость различий в зависимости от взаимодействия генотипа и НДО (тест Краскела—Уоллиса, H=12,28, p=0,006 и H=12,79, p=0,005 соответственно). При этом паттерны различий были сходны для всех симптомов когнитивно-дезорганизационного фактора, с высокими оценками у носителей аллеля A без НДО (данные не представлены), достигая порога достоверности для расстройств мышления (Р2, p=0,012) и загруженности психическими переживаниями (О15, p=0,047).

Таблица 2. Зависимость выраженности факторов PANSS от НДО и генотипов (результаты ANCOVA)

Примечание. Поз — позитивный фактор; Нег СЭ — негативный, сниженная экспрессия; Нег СА — негативный, социальная амотивированность; Ког-дез — когнитивно-дезорганизационный; Депр-тр — депрессивно-тревожный; Вражд — враждебный. * — значимо при FDR=0,05.

Различия по когнитивно-дезорганизационному фактору PANSS между группами больных шизофренией с неблагоприятным детским опытом и без такового в зависимости от генотипа rs1800629 (гомозиготы GG vs. носители аллеля А). Для каждой группы показано среднее значение когнитивно-дезорганизационного фактора и его стандартная ошибка.

а — различия между пациентами без неблагоприятного детского опыта (ACE none) и с любыми видами неблагоприятного детского опыта в анамнезе (ACE any); б — различия между пациентами без неблагоприятного детского опыта (none), с неблагоприятным детским опытом, ассоциированным с насилием (abuse) и связанным с психическим расстройством у родителя, но не с насилием (psychD).

Обсуждение

Установлено, что особенности генетической регуляции экспрессии цитокинов, гены которых образуют кластеры с другими генами иммунного ответа на хромосомах 2, 5 и 6, могут опосредовать влияние НДО на выраженность шести групп симптомов шизофрении: позитивных, негативных с разделением на снижение экспрессии и социальной мотивации, враждебных, тревожно-депрессивных и когнитивно-дезорганизационных. Обнаружена ассоциация последнего с эффектом взаимодействия НДО и полиморфного сайта TNF-α rs1800629. Однако вопреки первоначальной гипотезе значимые различия между пациентами с разными генотипами наблюдались в группе без НДО: повышение выраженности когнитивно-дезорганизационного синдрома имело место у лиц с минорным аллелем A в генотипе относительно гомозигот GG, причем только среди женщин. Слабая противоположная тенденция выявлена у пациентов с НДО. Такой паттерн позволяет предположить, что НДО маскирует и, возможно, даже полностью меняет направление влияния генотипа в сайте TNF-α rs1800629 на формирование когнитивно-дезорганизационного синдрома, и этот эффект, по-видимому, зависит от пола.

Когнитивно-дезорганизационный синдром является ключевым для шизофрении, так как включает симптомы, специфичные для расстройств шизофренического круга. В семейных и близнецовых исследованиях шизофрении показано наиболее высокое сходство родственников именно по дезорганизационному синдрому и установлено, что такое сходство объясняется генетическими эффектами [27, 28]. В согласии с этими ранними данными в недавней работе с использованием PRS ряда психических расстройств и интеллекта обнаружено, что, в отличие от позитивной и негативной симптоматики, дезорганизационный синдром высокозначимо и специфически коррелирует с генетической предрасположенностью к шизофрении [29]. В совокупности эти результаты указывают, что дезорганизационный синдром является наиболее важным для понимания генетических основ шизофрении.

В связи с этим стоит отметить, что полиморфизм rs1800629, с которым была обнаружена ассоциация, находится в умеренном неравновесии по сцеплению с теговым полиморфизмом наиболее значимого локуса риска шизофрении в главном комплексе гистосовместимости. Существующие данные указывают, что rs1800629 может быть связан с регуляцией выработки TNF-α — цитокина, который участвует в широком спектре биологических процессов, включая такие существенные для патогенеза шизофрении, как клеточная пролиферация и дифференцировка, апоптоз и метаболизм липидов, и имеет нейропротективную функцию [30]. В частности, аллель A гена TNF-α связан с нейродегенерацией гиппокампа у здоровых людей [21]. Помимо этого, rs1800629 является фактором экспрессии генов-компонентов комплемента, вовлеченных в опосредованный микроглией синаптический прунинг, — C4A и C4B. Этот факт особенно интересен в свете данных, предполагающих прямой вклад C4A в патогенез шизофрении [7].

Результаты настоящей работы следует рассматривать в свете ее ограничений. Одним из них может быть размер выборки. Однако проведенный с помощью программы Quanto post hoc анализ показал, что 80%-ная мощность выявления даже небольших эффектов взаимодействия (от R²=0,02) в случае доминантной модели и размеров главных эффектов гена и среды на когнитивно-дезорганизационный фактор, равных R²=0,01, при частоте минорного аллеля 0,12 и α=0,05 обеспечивается выборкой от 381 человека, что близко к использованной в работе. Тем не менее любая ассоциация требует подтверждения на независимой когорте испытуемых. Другим ограничением является тот факт, что история болезни может не содержать всей необходимой информации для решения вопроса о наличии НДО в анамнезе пациента и самоотчет пациентов может быть не вполне достоверным в силу нарушения критичности и наличия бредовой симптоматики. Более того, нет абсолютного консенсуса между исследователями о том, какие именно события должны быть включены в список НДО [4]. Наконец, влияние НДО на когнитивные функции и, возможно, другую симптоматику более значимо на инициальных этапах развития эндогенного процесса — в группах ультравысокого риска и у пациентов с первым эпизодом, чем при хроническом течении [31], что свидетельствует в пользу связи НДО с нарушением развития мозга. Этот фактор не учитывался для сохранения мощности выборки, однако он должен быть учтен в дальнейших, более масштабных, исследованиях.

Заключение

Результаты исследования показывают, что генетические варианты полиморфного сайта rs1800629, расположенного в промоторе гена TNF-α, который одновременно является энхансером еще 60 генов, локализованных в главном комплексе гистосовместимости, связаны с выраженностью когнитивно-дезорганизационного синдрома шизофрении, однако степень и направление этого влияния зависят от наличия НДО в анамнезе пациента. В то же время полиморфные сайты в промоторах других генов цитокинов — IL1B rs16944, IL4 rs2243250 — не были ассоциированы с шизофренической симптоматикой ни у лиц с НДО, ни у больных без НДО в анамнезе. Эти результаты можно интерпретировать, скорее, в пользу модифицирующего влияния НДО на связь между rs1800629 и патогенезом шизофрении, чем в поддержку первоначальной гипотезы о генетических особенностях иммунного ответа как фактора, модифицирующего влияние НДО на выраженность шизофренической симптоматики.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.