В настоящее время существуют многочисленные доказательства, что нарушения межнейрональных синаптических контактов при шизофрении связаны с повреждениями олигодендроцитов и миелиновых волокон [1]. Показаны дистрофические изменения и снижение численной плотности олигодендроцитов и их предшественников в сером и белом веществе различных структур мозга при шизофрении [2—4]. Иммуногистохимические исследования белков олигодендроцитов и миелиновых волокон свидетельствуют о нарушенной миелинизации при шизофрении, что может приводить к нарушению синаптических связей [5]. Нейровизуализационные исследования показали прогрессирующее снижение объема белого вещества лобной доли при шизофрении [5], нарушения целостности белого вещества мозга, коррелирующие с тяжестью когнитивных нарушений и их возможную связь с гипомиелинизацией [6]. Поле 10 префронтальной коры (ПФК) участвует в когнитивных функциях, таких как рабочая память, планирование поведения, принятие решений, благодаря многочисленным связям ее нейронов с корковыми и подкорковыми структурами мозга [7]. Повреждения в белом веществе участвуют в генезе позитивных, негативных симптомов и когнитивных расстройств при шизофрении и могут быть связаны с нейровоспалением [8].

В нашем предыдущем исследовании [9] были показаны нарушения целостности оболочек миелиновых волокон и их взаимоотношений с аксонами в сером и белом веществе ПФК, приводились доказательства дегенерации миелиновых волокон в белом веществе ПФК и корреляции этих нарушений с длительностью болезни [9]. Такие изменения могут приводить к десинхронизации при проведении импульсов по аксонам, нарушать передачу информации и, таким образом, участвовать в генезе различных симптомов шизофрении [9, 10].

Известно, что шизофрения связана с дисфункцией иммунной системы. В настоящее время одним из наиболее важных звеньев патогенеза шизофрении, включая белое вещество, считается наличие хронического умеренного нейровоспаления, связанного с активацией микроглии и изменением периферических иммунных маркеров [11—13]. Кататония также может быть связана с воспалением в трактах белого вещества [14].

Микроглия вовлечена в развитие белого вещества, миелиногенез, метаболическую поддержку олигодендроцитов и их предшественников [15]. Микроглиальные клетки участвуют в обучении и памяти, продуцируя трофические факторы, включая нейротрофический фактор мозга (brain derived neurotrophic factor, BDNF), в обрезке избыточных синаптических связей, помогая формированию и функционированию зрелых нейронных сетей, влияют на синаптическую пластичность [16]. Фагоцитарная активность микроглии участвует как в демиелинизации, так и в ремиелинизации, поскольку стимулирует дифференцировку олигодендроцитов [17].

Известно, что повреждения олигодендроцитов отмечаются при различных заболеваниях в мозге, таких как рассеянный склероз, демиелинизирующий энцефаломиелит, вирусные инфекции [18]. Микроглия регулирует уровень про- и антивоспалительных цитокинов. Активация микроглии в пренатальный период нарушает развитие белого вещества, поскольку способна снижать пролиферацию предшественников олигодендроцитов [19].

Аутопсийные исследования белого вещества при шизофрении показали выраженное снижение численной плотности олигодендроцитов в белом веществе полей 10 [4], 9 [2] ПФК, кластеризации олигодендроцитов в белом веществе поля 9 ПФК [2]. Однако C. Hercher и соавт. [20] не нашли изменений численной плотности олигодендроцитов в белом веществе поля 9 ПФК, а H. Bernstein и соавт. [21], напротив, обнаружили повышенную плотность DISC1-иммунореактивные «нарушенных при шизофрении 1» (Disrupted In Schizophrenia 1, DISC1) иммунопозитивных олигодендроцитов в белом веществе лобно-теменной коры при шизофрении. Интересно, что в белом веществе поля 9 ПФК была найдена повышенная плотность микроглии в 40% случаев шизофрении, коррелирующая с экспрессией интерлейкина-1β [22]. Повышение численной плотности Iba1-иммунопозитивной микроглии также было показано в белом веществе, подлежащем к фронтальной коре, при шизофрении, в отличие от белого вещества височной цингулярной коры и мозолистого тела, в которых не было обнаружено изменений при шизофрении [23]. В проведенном нами ранее ультраструктурном морфометрическом исследовании микроглии в слое 5 ПФК [24] было найдено повышение численной плотности микроглии, связанное с возрастом, длительностью болезни, возрастом начала болезни, показаны прогрессирующая дистрофия и ускоренное старение микроглии при шизофрении по сравнению с контролем.

Реактивность микроглии может быть связана с различиями в клинических типах шизофрении. Так, ранее нами были выявлены особенности реактивности микроглии в слое 5 поля 10 ПФК, связанные с различиями в типах течения шизофрении [25], показаны дистрофические повреждения олигодендроцитов, контактирующих с микроглией, в белом веществе поля 10 как при непрерывнотекущей шизофрении (НТШ) [26], так и при приступообразно-прогредиентной шизофрении (ППШ) [27].

Цель настоящей работы — выявление особенностей реактивности микроглии в белом веществе при НТШ по сравнению с контролем и ППШ и анализ корреляционных связей между параметрами микроглии и исследованных ранее олигодендроцитов в контроле и при разных типах течения шизофрении.

Материал и методы

В исследовании использована коллекция структур аутопсийного мозга лаборатории клинической нейроморфологии Научного центра психического здоровья. Диагностику шизофрении при жизни проводили по МКБ-10. Группа параноидной НТШ (F20.00) включала 9 случаев (6 мужчин, 3 женщины, возраст 58,8±17,3 года, длительность болезни 32,4±12,3 года). В группу ППШ (F20.01—F20.02) вошли 8 случаев (5 мужчин, 3 женщины, возраст 53±12,2 года, длительность болезни 24,4±13,7 года). Контрольная группа представлена 20 случаями без психической и неврологической патологии. Причины смерти были сходными в обеих группах. Для оценки возможного влияния нейролептической терапии на исследованные параметры применялся хлорпромазиновый эквивалент.

Подготовка ткани мозга к исследованию была описана нами ранее [26]. Исследовали поверхностное белое вещество, подлежащее к слою 6 поля 10 ПФК. Исследование проводили с помощью электронного микроскопа JEM-100B («JEOL», Япония). Трансмиссионная электронная микроскопия позволяет идентифицировать микроглию без применения иммуноцитохимических методов. Тела клеток микроглии можно отличить от других типов клеток по их небольшому размеру (3—5 мкм), электронно-плотной цитоплазме и бобовидному или палочковидному ядру с большим количеством гетерохроматина и темной цитоплазме, содержащей митохондрии, единичные гранулы липофусцина в отдельных клетках и мелкие цистерны и вакуоли эндоплазматического ретикулума, представляющего собой сложную систему канальцев, цистерн и вакуолей.

Методика морфометрии подробно описана ранее [26]. Среднее число микроглии, контактирующей с олигодендроцитами, на случай было не менее 10 клеток. Плотность микроглии определяли как число клеток в единице площади ткани (n/мм2). Измеряли размер клеток, объемную фракцию (Vv) и количество (n) органелл.

Исследование соответствовало всем положениям Хельсинкской декларации и было одобрено локальным Этическим комитетом НЦПЗ.

Для статистического анализа применяли пакет Statistica 7. Критерий Колмогорова—Смирнова использовали для оценки нормальности распределения оцениваемых параметров. Корреляционный анализ Пирсона применяли для выяснения наличия или отсутствия корреляций параметров с возрастом, постмортальным интервалом, хлорпромазиновым эквивалентом, возрастом начала и длительностью болезни, а также для исследования взаимоотношений параметров микроглии и олигодендроцитов. Группы не различались по возрасту и постмортальному интервалу (p>0,6). Ковариационный анализ (ANCOVA) использовали для сравнения клинических групп с контрольной и между клиническими группами с клеточными параметрами как зависимые переменные, клиническими группами как зависимый фактор и возрастом и постмортальным интервалом в качестве ковариат, а также для оценки влияния возраста, пола, возраста начала и длительности болезни на параметры микроглии. После ANCOVA применяли тест Дункана (post-hoc Duncan test). Значения p<0,05 были приняты как статистически значимые.

Результаты

Микроглия в контрольных случаях часто имела палочковидную форму. Ядра микроглии содержали эухроматин в центре ядра и гетерохроматин на периферии в виде темных глыбок (рис. 1, а).

Рис. 1. Микрофотографии микроглии, контактирующей с олигодендроцитами, в белом веществе префронтальной коры в контроле (а) и при НТШ (б—г).

Контакты микроглии с большой частью цитоплазмы олигодендроцитов (б). Контакты ядра микроглии с ядром олигодендроцита (в) и цитоплазмы микроглии с ядром олигодендроцита (г).

Тонкие стрелки — митохондрии, толстые стрелки — вакуоли эндоплазматического ретикулума; М — микроглия; Ол — олигодендроцит; Лг — гранулы липофусцина; масштаб =1 мкм.

Цитоплазма включала митохондрии разных размеров, единичные гранулы липофусцина в отдельных клетках и мелкие вакуоли (см. рис. 1, а). В случаях шизофрении в микроглиальных клетках обращало на себя внимание повышенное содержание гетерохроматина в ядрах, что придавало им более темный вид по сравнению с контролем (см. рис. 1, б—г). В цитоплазме микроглиальных клеток при шизофрении митохондрии встречались реже, чем в контрольных случаях, характерными признаками при шизофрении были повышенное содержание липофусцина (см. рис. 1, б), часто наблюдаемый контакт ядер микроглии и олигодендроцитов (см. рис. 1, в). Также отмечено набухание цистерн эндоплазматического ретикулума, приобретающих вид вакуолей (вакуолизация) (см. рис. 1, г), и связанное с ним повышенное содержание вакуолей. Что касается олигодендроцитов, то, в отличие от контрольных случаев с сохранной ультраструктурой (см. рис. 1, а), в случаях шизофрении часто наблюдали набухание цитоплазмы и вакуолизацию эндоплазматического ретикулума, обеднение цитоплазмы рибосомами, скопления гранул липофусцина (см. рис. 1, б—г). Ультраструктурных признаков деструкции микроглии в виде апоптоза или некроза микроглии и олигодендроцитов не обнаружено.

Статистический анализ показал влияние клинических групп на объемную фракцию (Vv) и количество митохондрий, липофусцина и вакуолей и площадь гетерохроматина в микроглии [все F(2,33)=4,36—6,77, p<0,05—0,01]. В обеих группах шизофрении найдены сниженные Vv и количество митохондрий (p<0,01) (рис. 2, а, б). Только в группе НТШ показаны повышение Vv (p<0,05) и количества (p<0,01) липофусциновых гранул (см. рис. 2, в, г). Площадь липофусциновых гранул не была изменена в обеих группах (см. рис. 2, д), а площадь вакуолей оказалась повышенной в обеих группах по сравнению с контрольной группой (p<0,05) (см. рис. 2, е). Плотность микроглии в обеих группах не была изменена по сравнению с контролем (p>0,5).

Рис. 2. Графики индивидуальных и средних значений для объемной фракции (Vv) митохондрий (а), количества митохондрий (б), Vv липофусциновых гранул (в), количества липофусциновых гранул (г), площади липофусциновых гранул (д) и площади вакуолей (е) в микроглии в контрольной группе и в группах шизофрении.

* — p<0,05; ** — p<0,01; ∆1 — контроль; •2 — НТШ, ○3 — ППШ.

Показано снижение Vv митохондрий в подгруппе НТШ старше 50 лет по сравнению с контрольной подгруппой моложе 50 лет (60%, p<0,05), в отличие от группы ППШ (рис. 3, а). Количество митохондрий в микроглии было снижено в обеих группах шизофрении в подгруппе старше 50 лет по сравнению с контрольной подгруппой старше 50 лет (см. рис. 3, б). Vv и количество липофусциновых гранул оказались повышенными только при НТШ в подгруппе старше 50 лет по сравнению с контрольной подгруппой старше 50 лет (470%, 606%, p<0,001) (см. рис. 3, в, г). Площадь и количество вакуолей были повышены в обеих группах в подгруппах старше 50 лет по сравнению с контрольной подгруппой старше 50 лет. Эти параметры вакуолей были снижены только в подгруппе НТШ моложе 50 лет по сравнению с контрольной подгруппой старше 50 лет (см. рис. 3, д, е).

Рис. 3. Графики индивидуальных и средних значений для объемной фракции (Vv) (а) и количества митохондрий (б), липофусциновых гранул (в, г), площади вакуолей (д) и количества вакуолей (е) в микроглии в разных возрастных подгруппах в контрольной группе и группах шизофрении.

* — p<0,05; ** — p<0,01; *** — p< 0,001. Здесь и на рис. 4: 1 — контроль; 2 — НТШ; 3 — ППШ.

Площадь гетерохроматина в микроглии была повышена при НТШ (42%) и ППШ (43%) по сравнению с контрольной группой (p<0,05) (рис. 4, а). Отмечено повышение площади гетерохроматина в микроглии в подгруппе моложе 50 лет по сравнению с контрольной подгруппой старше 50 лет при обоих типах течения шизофрении (p<0,05). Корреляционный анализ Пирсона показал положительную корреляцию площади гетерохроматина с площадью липофусциновых гранул (r=0,76, p<0,05) и отрицательную — с объемной фракцией митохондрий (r=–0,9, p<0,0001) и количеством митохондрий (–0,72, p<0,05) в микроглии при НТШ (см. рис. 4, б—г), а площадь липофусцина коррелировала положительно с длительностью болезни (r=0,73, p<0,05) только в группе НТШ.

Рис. 4. Площадь гетерохроматина в микроглии в контрольной группе (1) и группах шизофрении (а).

Корреляции Пирсона между площадью гетерохроматина в микроглии и площадью липофусциновых гранул в микроглии в контрольной группе и группах шизофрении (б). Корреляции Пирсона между площадью гетерохроматина в микроглии и объемной фракцией митохондрий в микроглии (в) и количеством митохондрий в микроглии (г) в контрольной группе и группах шизофрении.

Корреляционный анализ ультраструктурных параметров контактирующих микроглии и олигодендроцитов позволил выявить значимые корреляции в группе НТШ, отсутствующие в группе ППШ. Так, количество митохондрий в олигодендроцитах коррелировало положительно с количеством митохондрий в микроглии в группе НТШ и контрольной группе и отрицательно с Vv липофусциновых гранул в микроглии только в группе НТШ (см. таблицу). В группе НТШ, в отличие от групп контрольной и ППШ, Vv митохондрий в олигодендроцитах коррелировала с Vv липофусциновых гранул в микроглии. Найдена также отрицательная корреляция между площадью гетерохроматина в микроглии и численной плотностью микроглии и положительная — между площадью гетерохроматина и площадью ядра микроглии только в группе НТШ. При этом только в группе НТШ площадь ядра микроглии коррелировала отрицательно с площадью и количеством митохондрий в олигодендроцитах (см. таблицу).

Коэффициенты корреляций Пирсона между ультраструктурными параметрами микроглии и между параметрами контактирующих микроглии и олигодендроцитов в контрольной группе, в группах НТШ и ППШ

Обсуждение

Проведенное исследование позволило выявить особенности реактивности микроглии, контактирующей с олигодендроцитами, при НТШ по сравнению с контролем и ППШ. Показанное повышение Vv и количества липофусциновых гранул было достоверным только при НТШ по сравнению с контролем, однако снижение Vv и количества митохондрий и повышение площади вакуолей эндоплазматичекого ретикулума были найдены при обоих типах течения шизофрении. Важно отметить влияние возраста на эти показатели. Снижение Vv митохондрий в микроглии было отмечено в группе НТШ в подгруппе старше 50 лет по сравнению с контрольной подгруппой моложе 50 лет. Количество митохондрий было снижено в подгруппе старше 50 лет по сравнению с контрольной подгруппой старше 50 лет при обоих типах течения шизофрении. Что касается других показателей, то Vv и количество липофусциновых гранул были повышены только при НТШ в подгруппе старше 50 лет по сравнению с контрольной подгруппой старше 50 лет, а площадь и количество вакуолей были повышены в обеих подгруппах старше 50 лет по сравнению с контрольной подгруппой старше 50 лет.

Важно отметить, что в настоящем исследовании выявленные ультраструктурные нарушения микроглии, контактирующей с олигодендроцитами, при шизофрении не связаны с влиянием постмортального интервала, пола, возраста начала болезни и нейролептической терапии (оцениваемой по хлорпромазиновому эквиваленту), поэтому предполагается их связь с болезненным процессом при шизофрении. О последнем свидетельствуют полученные результаты корреляционного анализа, показавшие, что Vv и количество липофусциновых гранул в микроглии положительно коррелировали с длительностью болезни в группе НТШ, что показывает прогрессирующий характер дистрофических нарушений в микроглии при этом типе течения шизофрении и отражает ее более тяжелые клинические проявления.

Одним из наиболее важных результатов проведенного исследования является достоверное повышение содержания гетерохроматина в микроглии при обоих типах течения шизофрении и обнаруженная отрицательная корреляционная связь между площадью гетерохроматина и численной плотностью микроглии только при НТШ, при этом численная плотность и размеры микроглии не были изменены при данном типе течения шизофрении. Эти результаты не только показывают отсутствие выраженной активации микроглии при НТШ, но и указывают на прямую связь неспособности микроглии к пролиферации с изменением состояния хроматина при этом наиболее тяжелом типе течения шизофрении. Следует отметить повышение площади гетерохроматина в микроглии в подгруппе моложе 50 лет по сравнению с контрольной подгруппой старше 50 лет при обоих типах течения шизофрении. Обращает на себя внимание, что только при НТШ найдены достоверные положительные корреляции площади гетерохроматина с площадью липофусциновых гранул и отрицательные — с Vv и количеством митохондрий в микроглии. Все эти результаты в совокупности с показанным дефицитом митохондрий и повышенным содержанием липофусцина в микроглии при этом типе течения шизофрении позволяют предположить ускоренное старение микроглии, контактирующей с олигодендроцитами, в белом веществе ПФК при НТШ. Стареющие клетки имеют нарушенную структуру хроматина, регулируемую как эпигенетической модификацией ДНК, так и посттрансляционной модификацией гистонов, влияющими на экспрессию генов [28]. Ядерные изменения при старении проявляются конденсацией хроматина, связанной с метилированием гистонов [28] и образованием гетерохроматиновых очагов [29, 30].

Эпигенетические модификации (метилирование ДНК и модификация гистонов) являются ключевыми механизмами регуляции экспрессии генов. При шизофрении нарушена активность ферментов ацетилирования и метилирования гистонов [31]. Среди разных модификаций гистонов ацетилирование и метилирование при шизофрении может привести к длительным изменениям в экспрессии генов [32]. Нейролептики регулируют ацетилирование и метилирование гистонов в генах, связанных с шизофренией [33, 34]. При шизофрении показаны низкие уровни экспрессии ряда генов микроглиальных маркеров, воспалительных цитокинов и рецептора колониестимулирующего фактора 1 (CSF1R), который, как известно, регулирует плотность микроглии в мозолистом теле [35]. Авторы также обнаружили низкие уровни экспрессии генов, связанных с метаболизмом липидов, и их потенциальных факторов транскрипции в мозолистом теле при шизофрении. Снижение экспрессии нескольких специфичных для микроглии генов, таких как CX3CR1, CSF1R, IRF8, OLR1 и TMEM119, было также найдено при шизофрении [36].

Недавние исследования показывают, что старение клеток включает клеточное ремоделирование, сокращение теломер, образование гетерохроматина, нарушения в митохондрях и лизосомах [29]. Была показана связь повышения площади гетерохроматина в микроглии с патологией митохондрий и липофусцина в микроглии при шизофрении. Так, найдены положительные корреляции площади гетерохроматина с площадью липофусцина и отрицательные — с фракцией и количеством митохондрий в микроглии только при НТШ. Очевидно, что повышение содержания гетерохроматина в микроглии, связанное с патологией митохондриального и липидного метаболизма, свидетельствует о дисфункции ядер микроглиальных клеток, что не только является важнейшим элементом патогенеза шизофрении, специфичным для НТШ, но также может быть одним из объяснений более тяжелых клинических проявлений при этом типе течения болезни.

Анализ корреляционных связей также выявил специфические взаимодействия микроглии с олигодендроцитами при НТШ. Так, только при этом типе течения болезни количество митохондрий в олигодендроцитах (сниженное, как показано ранее) коррелировало положительно с количеством митохондрий в микроглии и отрицательно с Vv липофусциновых гранул в микроглии, а Vv липофусциновых гранул в микроглии коррелировала отрицательно с Vv митохондрий в олигодендроцитах с высокими коэффициентами корреляций. Интересно, что площадь гетерохроматина коррелировала положительно с площадью ядра микроглии, а площадь ядра микроглии коррелировала положительно с количеством и площадью митохондрий в олигодендроцитах только при НТШ. Эти результаты дают основание предполагать опосредованное влияние повышения содержания гетерохроматина в микроглии на сниженный митохондриальный метаболизм олигодендроцитов при НТШ. В пользу важной роли ядер микроглии на метаболизм олигодендроцитов может также указывать часто наблюдаемый в случаях шизофрении прямой контакт ядра микроглии с ядром олигодендроцитов. Снижение содержания митохондрий и аккумуляция липофусцина, показанные в олигодендроцитах при НТШ наряду с дефицитом митохондрий и повышенным содержанием липофусцина в микроглии и наличием достоверных взаимосвязей этих показателей в микроглии и олигодендроцитах, позволяют предположить, что дистрофия микроглии может способствовать ускоренному старению олигодендроцитов. Такое предположение согласуется с гипотезой ускоренного старения мозга при шизофрении [37, 38].

Сравнение результатов настоящего исследования с предыдущим исследованием реактивности микроглии в слое 5 ПФК при ППШ и НТШ [25] показало отсутствие прогрессирования изменений микроглии при НТШ и повышение численной плотности микроглии в подгруппе НТШ моложе 50 лет в сочетании с прогрессирующими дистрофическими нарушениями микроглии с возрастом при ППШ, соответствующие разной степени прогредиентности этих типов течения болезни. Сопоставление этих результатов с данными настоящего исследования показывают различия в реактивности микроглии в сером и белом веществе и их связь с типами течения шизофрении, что согласуется с результатами более ранних исследований И.И. Глезер и Л.И. Сухоруковой [39] и Л.И. Сухоруковой [40]. Авторы приводят доказательства пролиферативно-дистрофической реактивности микроглии при периодическом типе течения шизофрении и дистрофиии без пролиферации микроглии при непрерывном типе течения болезни.

Проведенное исследование ограничено сравнительно небольшой выборкой клинических групп шизофрении. Не было найдено влияния нейролептической терапии, поскольку ее оценка по хлорпромазиновому эквиваленту была возможна только в течение 1 мес до момента смерти, и невозможно оценить влияние нейролептической терапии в течение всей жизни.

Причины и патогенетические механизмы нарушенной реактивности микроглии при шизофрении остаются малоизученными. Известно, что на реактивность микроглии при шизофрении могут влиять генетические факторы, пренатальная гипоксия, инфекции, травмы, пре- и постнатальные стресс-факторы [41]. Аутоиммунные механизмы также принимают участие в патогенезе шизофрении [42]. В настоящее время признанным механизмом измененной реактивности микроглии при шизофрении считается «сенситизация» — процесс, в котором первичный иммунный ответ на стресс-стимулы, инфекционные или другие агенты повышает чувствительность к ответу на последующие сходные стимулы [13].

Заключение

В заключение следует отметить, что изменения гетерохроматина, митохондрий и липофусцина в микроглии при НТШ могут играть ведущую роль в нарушении митохондриального и липидного метаболизма не только в микроглии, но и в контактирующих с ней олигодендроцитах, и могут быть новой мишенью для терапии шизофрении, связанной с непрерывным типом течения болезни. Дальнейшее изучение механизмов взаимодействия микроглии и олигодендроцитов при шизофрении с учетом типов течения, степени прогредиентности болезни и влияния нейролептиков на эти взаимодействия будет способствовать пониманию этиопатогенеза шизофрении и разработке новых подходов к лечению.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.