Шизофрения — это тяжелое психическое заболевание, в этиологию и патогенез которого значительный вклад вносят наследственные факторы. В исследованиях на близнецах и семьях с отягощением по шизофрении показана очень высокая доля наследственной компоненты в развитии этого заболевания, которая может доходить до 70—85% [1, 2]. В представлениях о генетической архитектуре шизофрении в настоящее время доминирует гипотеза о ее полигенности. Эту гипотезу подтверждают данные современных масштабных исследований, посвященных полногеномному поиску генетических вариантов (GWAS — от англ. genome-wide association studies), ассоциированных с шизофренией. Полученные данные указывают на большую роль некодирующих областей, содержащих такие регуляторные элементы, как энхансеры, сайленсеры, длинные некодирующие РНК [3]. В свою очередь подобные регуляторные элементы через взаимодействующие с ними регуляторные белки и их комплексы могут влиять на экспрессию множества генов, вовлеченных в нормальное функционирование нейронов [4—6]. Следует отметить, что с помощью GWAS можно выявить десятки, сотни и тысячи генетических вариантов, ассоциированных с шизофренией [7, 8]. В связи с этим возникает проблема поиска так называемых каузальных вариантов, т.е. тех генетических вариантов, которые связаны с заболеванием причинно-следственной связью, и, следовательно, играют важную роль в его патогенезе [9]. Для поиска таких вариантов применяют различные подходы, в том числе исследования с использованием клеточных моделей, позволяющих изучить на молекулярном уровне связь выявленных в GWAS полиморфизмов с патогенезом шизофрении. В случае клеточных моделей каузальным можно назвать тот вариант, который приводит к нарушению таких же молекулярных, клеточных и/или межклеточных процессов и структур, как и в клетках пациентов с шизофренией.

Цель настоящего обзора — краткое рассмотрение клеточных и надклеточных моделей, которые благодаря своей простоте, низким стоимости и трудоемкости помогают эффективно исследовать сложные молекулярные механизмы, ассоциированные с шизофренией.

Клеточные культуры как адекватные модели в поиске каузальных генетических вариантов, ассоциированных с шизофренией

Классическими моделями в исследованиях шизофрении служат различные животные, такие как мыши, крысы, рыбы, мини-свиньи и нечеловекообразные приматы. Они удовлетворяют классической триаде валидностей модели, т.е. имеют внешнюю (воспроизводимость симптомов), конструктную (воспроизводимость ассоциированных молекулярных механизмов и некоторых диагностических признаков) и прогностическую (способность реагировать на лекарственное средство таким же образом, как и пациенты) [10]. Эти модели полезны в исследовании единичных хорошо известных генетических вариантов, ассоциированных с шизофренией. Они не подходят для поиска каузальных вариантов в силу дороговизны содержания большого количества животных и длительности их выращивания. Гораздо более простыми, дешевыми, удобными и высокопроизводительными моделями могут служить культуры клеток. Однако цена такой простоты и высокой производительности — это потеря внешней валидности, поскольку клетки не обладают теми симптомами, которые есть у больных шизофренией. Тем не менее клеточные модели способны проявлять внешнюю и конструктную валидности, а аналогом внешней валидности могут служить нарушения молекулярных, клеточных и/или межклеточных процессов и структур, которые ассоциированы с шизофренией и в конечном итоге ведут к нарушению функционирования центральной нервной системы и тем симптомам, которые наблюдаются у больных шизофренией. Таким образом, клеточные модели помогают не только в поиске каузальных вариантов, но и в изучении биохимических, молекулярных и клеточных механизмов, ассоциированных с шизофренией, что позволяет не только разобраться в механизмах действия существующих лекарственных препаратов, но и предложить пути к разработке новых более специфичных и эффективных лекарств.

В исследованиях молекулярных, биохимических и физиологических процессов, которые могут иметь отношение к патогенезу шизофрении, используются несколько видов клеточных моделей [11]. Одной из самых распространенных моделей служит клеточная линия нейробластомы SH-SY5Y [12]. Клетки SH-SY5Y имеют сходство с незрелыми нейронами и обладают маркером пролиферации (PCNA) и маркером незрелых нейронов (нестин). SH-SY5Y используются для моделирования свойств дофаминергических нейронов. Большое значение в получении генетически модифицированных нейрональных клеток различных типов и при этом специфичных для конкретных пациентов, таких как предшественники нейронов, глутаматергических, дофаминергических и ГАМКергических нейронов, а также олигодендроцитов, имеют индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) [13, 14]. ИПСК получают из соматических клеток (фибробластов или клеток периферической крови) путем сверхэкспрессии в них определенного набора генов, кодирующих факторы транскрипции (обычно это набор из четырех факторов: Myc, Oct3/4, Sox2 и Klf4, называемый также коктейлем Эманаки) [15]. Однако следует внимательно относиться к результатам экспериментов, проведенных на ИПСК-производных, поскольку на них могут влиять соматические мутации, имевшиеся в исходных клетках, из которых в свою очередь были получены ИПСК. Другим недостатком может быть несовершенство протоколов дифференцировки нейронов из ИПСК, которые часто ведут к получению смешанной популяции нейронов. Клеточные культуры, не имеющие нейрональной природы, но близкие к ним биохимически и по молекулярным процессам, такие как HEK293, также полезны для исследования молекулярных механизмов, ассоциированных с шизофренией [16]. Линия HEK293 относительно неприхотлива, стабильна и, в отличие от нейрональных линий, в эти клетки легче вводить нуклеиновую кислоту, т.е. осуществлять процесс трансфекции, что значительно повышает эффективность методов геномного редактирования, а значит, и шансы получить модифицированные линии, несущие целевые изменения. Однако эта линия не обладает морфологическими признаками нейрональных линий, и с ней невозможно проводить электрофизиологические исследования.

Описанные ограничения указывают, что необходим грамотный выбор клеточных моделей для исследования заданных процессов. Только правильно выбранные клеточные модели дают ценную информацию об ассоциированных с патогенезом шизофрении клеточных, межклеточных, молекулярных, биохимических и электрофизиологических процессах, которая подтверждается и в исследованиях с использованием биологического материала пациентов с шизофренией (как на прижизненно отобранных образцах, так и в аутопсийных образцах головного мозга). Хорошим примером может служить факт сокращения количества и структуры аксонов, наблюдаемый как в клеточных моделях шизофрении [17], так и при посмертных исследованиях головного мозга таких больных [18]. Эти данные подтверждают конструктную валидность клеточных моделей на субклеточном уровне.

Исследование молекулярных механизмов, ассоциированных с шизофренией, с использованием системы CRISPR/Cas9

Клеточные модели позволяют вносить целевые изменения в геном (вставки, делеции, однонуклеотидные мутации и т.д.) и исследовать их влияние на клеточные процессы, чтобы глубже понять механизмы, ассоциированные с шизофренией. Эффективность внесения генетических изменений определяет производительность и удобство работы с данной моделью. С разработкой технологии редактирования генома на основе системы CRISPR/Cas9 многократно повышена эффективность получения целевых генетически модифицированных линий [19]. Используемая в технологии редактирования генома система CRISPR/Cas9 является бактериальным комплексом, состоящим из направляющей РНК и нуклеазы Cas9. Направляющая РНК служит адресом, нацеливающим нуклеазу Cas9 на определенный участок генома. После связывания с целевым участком генома Cas9 вносит двухцепочечный разрыв в ДНК, который активирует клеточные пути устранения повреждений в ДНК. Если вместе с системой CRISPR/Cas9 внутрь клеток доставляется так называемый донорный фрагмент ДНК, то в ходе исправления повреждения ДНК он может встроиться в геном. Если же вместе с системой не доставляется других фрагментов, тогда полученное повреждение исправляется с удалением или вставкой некоторого количества нуклеотидов, что ведет, например, к инактивации гена. С помощью системы CRISPR/Cas9 можно также модифицировать и эпигеном, т.е. проводить химические модификации ДНК, и влиять на уровень содержания РНК, менять расположение взаимных частей генома и при этом не менять его последовательность [20]. Таким образом, CRISPR/Cas9 представляется мультифункциональным инструментом, позволяющим выполнять ранее невозможные манипуляции с потоком генетической информации и тем самым воспроизводить широкий спектр наследственных изменений, наблюдаемых у пациентов с шизофренией для того, чтобы глубже и детальнее понять ее генетическую архитектуру.

Общий план экспериментов по использованию клеточных моделей и системы CRISPR/Cas9 для исследования наследственных факторов, ассоциированных с шизофренией, представляется следующим [11]. На первом этапе происходит сбор данных для выявления пациентов, больных шизофренией. На втором этапе у пациентов отбирается кровь для последующего выделения ДНК и определения ее структуры (секвенирования). На третьем этапе проводится анализ данных с выявлением потенциальных полиморфизмов и иных структурных вариантов, которые могут быть ассоциированы с шизофренией. На четвертом этапе в зависимости от природы выбранных вариантов и их вероятных механизмов действия делается выбор наиболее адекватной клеточной модели и внесение на пятом этапе в ее геном/эпигеном исследуемых вариантов. Чаще всего выбор делается в пользу ИПСК, которые после геномной/эпигеномной модификации дифференцируются в нейроны и надклеточные образования, например органоиды. На шестом этапе происходит всестороннее сравнение модели с исходной, немодифицированной моделью с использованием омиксных технологий. Суммирование всех данных и их сравнение с результатами, полученными ранее на пациентах с шизофренией в прижизненных и посмертных исследованиях, позволяет сделать вывод о том, имеет ли отношение исследуемый полиморфизм к патогенезу шизофрении.

Примеров реализации описанного выше подхода пока немного. Можно привести недавнюю работу, в которой сделан глубокий анализ большого количества секвенированных транскриптомов как клеточных линий, так и клеток головного мозга пациентов, полученных в посмертных исследованиях [21]. В ходе сравнительного анализа были выявлены полиморфизм FURIN rs4702 и гены FURIN, SNAP91, TSNARE1, CLCN3, ассоциированные с высоким риском развития шизофрении. Нарушение их функций с использованием системы CRISPR/Cas9 ведет к изменению экспрессии большого количества генов, связанных с метаболизмом нейротрансмиттеров, функционированием как постсинаптических, так и пресинтаптических белков, участвующих в передаче синаптического сигнала. В конечном итоге у модифицированных нейрональных линий наблюдали снижение количества белка в синапсе и изменение его электрофизиологических свойств. Аналогичные изменения в синапсах наблюдаются и у пациентов с шизофренией. Таким образом, полученные результаты подтверждают конструктную валидность клеточных моделей на молекулярном и физиологическом уровнях.

В другой работе авторы с помощью CRISPR-редактированных ИПСК получили дофаминергические нейроны, несущие делецию или дупликацию хромосомного локуса 16p11.2, который ассоциирован с шизофренией [22]. В дальнейших исследованиях полученных нейронов авторы установили, что в зависимости от того, происходит делеция или дупликация этого участка, наблюдается изменение плотности белков на поверхности синапсов. Далее обнаружено, что делеция локуса 16p11.2 приводит к образованию групп нейронов, у которых с высокой частотой наблюдается спонтанная синхронная активация. Подобная активность так же, как и в предыдущем примере, наблюдалась у больных шизофренией. В ходе детального изучения молекулярных механизмов, обеспечивающих наблюдаемый феномен, показана ключевая роль RhoA киназы. Более того, авторами показано, что с помощью ингибитора RhoA киназы — розина активность синапсов можно вернуть в нормальное состояние. Авторы работы сделали заключение, что RhoA киназа может быть возможной мишенью для симптоматического лечения шизофрении, а клеточные линии в данном примере проявляют прогностическую валидность.

Еще одним примером использования CRISPR/Cas9-редактированных нейрональных линий в исследовании молекулярных механизмов, ассоциированных с шизофренией, может служить работа Y. Li и соавт. [23], в которой показано, что полиморфизм rs2535629, обнаруженный внутри локуса 3p21.1, ассоциированного с высоким риском возникновения шизофрении (согласно данным GWAS), находится в сайте связывания важного регуляторного белка CTCF, обеспечивающего правильную трехмерную структуру генома. Полиморфизм нарушает связывание CTCF со своим регуляторным элементом, что ведет к нарушению экспрессии большого количества генов, из которых исследователи обратили внимание на GLT8D1, SFMBT1 и NEK4, которые экспрессируются в центральной нервной системе. Далее авторами показано, что наибольший эффект имеет подавление экспрессии гена SFMBT1, который кодирует фактор, контролирующий нейрогенез, а также количество дендритных отростков. Подавление функции гена SFMBT1 ведет к нарушению экспрессии генов, участвующих в нейрогенезе, а также функционировании синапсов. На линии нейрональных стволовых клеток показано, что подавление активности SFMBT1 приводит к неспособности превращения их в астроциты. Подавление же активности SFMBT1 в первичных нейрональных клетках ведет к снижению количества синапсов. Таким образом, на моделях клеточных культур авторами работы показано, что нарушение экспрессии SFMBT1 как следствие нарушения функции важного регулятора CTCF влечет нарушение дифференцировки нейрональных линий и морфогенез синапсов, наблюдающиеся у пациентов с шизофренией [23].

Органоиды и ассемблоиды в качестве моделей шизофрении

Помимо клеток, ценными моделями могут служить надклеточные модели, такие как мозговые органоиды и ассемблоиды. Мозговые органоиды представляют собой искусственно выращенные in vitro трехмерные образования, которые по структуре и клеточному составу похожи на мозг и имеют размер около 1 см. Ассемблоиды — это объединенные in vitro органоиды, которые по клеточному составу напоминают отдельные участки головного мозга и образуют между собой межклеточные контакты. В надклеточных моделях становится возможным наблюдать влияние мутаций, ассоциированных с шизофренией, на межклеточные взаимодействия, дефекты в дифференцировке клеток, а также нарушения процессов раннего развития мозга и формирования некоторых элементов его структуры. Эти модели позволяют подойти еще ближе к пониманию механизмов патогенеза шизофрении, не нарушая этических принципов биологических исследований. Следует сразу же упомянуть, что получение органоидов — очень сложный и трудновоспроизводимый процесс. Однако в случае успеха подобные модели дают бесценные данные о механизмах и патологиях ранних стадий развития мозга человека. Так, показано, что органоиды, полученные из ИПСК здоровых людей, могут воспроизводить в основных чертах структуру коры головного мозга на ранних стадиях его развития [24]. В то же время в органоидах, полученных из клеток больного шизофренией, наблюдаются различные аномалии, например нарушены миграция предшественников нейронов и их пролиферация в кортикальных слоях, ослаблена связь между кортикальными слоями, нарушено созревание нейронов в кортексте [24]. Полученные данные хорошо согласуются с дегенерацией лобных долей головного мозга, наблюдаемой у пациентов, страдающих тяжелой формой шизофрении [25]. Дальнейший поиск молекулярных процессов, связанных с наблюдаемыми на клеточном и надклеточном уровнях дефектами при шизофрении, позволил обнаружить дисфункцию сигнального пути, запускаемого рецептором фактора роста фибробластов (FGFR1). Использование ингибитора пути PD173074 или мутантных форм рецептора подтвердило его ключевую роль в формировании кортекса мозговых органоидов [24].

Проведен анализ возможных белковых факторов, ассоциированных с развитием шизофрении, путем анализа протеомов мозговых органоидов, полученных из клеток больных шизофренией [26]. Авторами обнаружено изменение содержания нескольких десятков белков, вовлеченных в нейрогенез и участвующих, в частности, в росте и морфогенезе аксонов, регуляции дифференцировки нейронов, а также в развитии черной субстанции головного мозга (например, MAP2, TUBB3, SV2A, GAP43, CRABP1, NCAM1). В этой же работе подтверждено изменение содержания двух белков плейотропина (PTN) и подокаликсина (PODXL), на участие в патогенезе шизофрении которых указывают недавние исследования GWAS. Показана связь этих белков с нейрогенезом и канцерогенезом путем контроля формирования межклеточных контактов, миграции и пролиферации клеток, а также участие их в апоптозе [27, 28].

Недавно разработаны протоколы получения органоидов отдельных частей головного мозга, поэтому стало возможным создание моделей следующего уровня — ассемблоидов. Примером ассемблоида может служить объединение кортикального и таламического органоидов [29]. Показано, что между частями этого ассемблоида происходит прорастание аксонов нейронов. Известно, что у больных шизофренией наблюдается нарушение в образовании проекций между корой головного мозга и таламусом [30]. Следовательно, кортикоталамические ассемблоиды в дальнейших исследованиях могут быть использованы для выявления молекулярных механизмов, ассоциированных с нарушением формирования проекций между отделами головного мозга.

Заключение

Клеточные и надклеточные модели имеют определенные преимущества и ограничения в исследованиях молекулярных механизмов, ассоциированных с шизофренией, по сравнению с моделями на животных. Однако клеточные модели требуют меньше затрат времени, материалов, средств и труда в исследованиях. Грамотно выбранные модели полезны в исследованиях генетической архитектуры шизофрении и позволяют выявлять каузальные генетические варианты. Специфичные для конкретных пациентов модели, т.е. модели, в которых учтена индивидуальная анатомия пациента, теоретически могут быть использованы в подборе персональных лекарственных препаратов для лечения больных шизофренией.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.