В настоящее время многими учеными эпилепсия рассматривается как свободнорадикальная патология [1—4] с истощением ферментативных компонентов антиоксидантной защиты и активацией прооксидантных систем . В основу данного утверждения легли результаты экспериментальных исследований Г.Н. Крыжановского 1983 г. Активация перекисного окисления липидов (ПОЛ) может являться следствием эпилептического приступа и звеном механизма его генерации. Поэтому во время судорожного приступа резко возрастает количество продуктов ПОЛ, в то время как суммарная антиоксидантная активность ткани мозга снижается [5]. В экспериментальных работах показано, что вызванные судороги могут быть частично предотвращены с помощью антиоксидантов, таких как супероксиддисмутаза-миметиков, мелатонина и витамина C [6]. Каталитические антиоксиданты могут уменьшать окислительные повреждения у животных с эпилепсией, хотя не снижают продолжительность приступов или длительность межприступных периодов [7]. При лечении эпилепсии применяется антиоксидантная терапия, в том числе ферментативная в качестве аугментирующей [3, 8, 9].

Цель исследования — изучение окислительного стресса у пациентов молодого возраста с фокальной симптоматической и криптогенной эпилепсией.

Материал и методы

Все пациенты в возрасте от 19 до 44 лет были распределены в 3 группы по 30 больных. После единичных (первых) эпилептических приступов (1-я группа), с клинической ремиссией в течение 1 года и более (2 я группа) и вторично-генерализованных эпилептических приступов, резистентных к лечению, с частотой вторично-генерализованных приступов от 4 в 1 год до 1—2 в 1 нед, парциальных — от 2 в 1 нед до 5 в 1 день (3-я группа). Общее количество эпилептических приступов в 1-й группе пациентов с дебютом заболевания не превышало 5, причем сюда входили приступы, наблюдавшиеся по 2—3 раза в течение 1 дня. Давность развития приступов на момент включения в исследование составляла не более 0,5 года.

Средняя длительность заболевания в группе пациентов с эпилептическими приступами, резистентными к лечению, составляла 19 лет, у пациентов с ремиссией — 12 лет. Пациенты 1-й группы противоэпилептическую терапию не получали, пациенты 2-й и 3-й групп получали противоэпилептические препараты (ПЭП) в виде моно- и политерапии. Наряду с этим в работу были включены практически здоровые лица (20 человек), которые составляли контрольную группу.

Биохимический анализ крови (общий белок, альбумин, мочевая кислота) проводили на биохимическом анализаторе Sapphire-400 (Япония).

Исследованы показатели прооксидантного статуса — ТБК-активные продукты, а также антиоксидантной защиты — общая супероксид-перехватывающая активность плазмы, каталаза, общая антиоксидантная активность плазмы крови и восстановленные тиолы (SH-группы) плазмы крови. Определение ТБК-активных продуктов осуществляли спектрофотометрическим методом [10]; концентрацию SH-групп определяли спектрофотометрическим методом при измерении оптической плотности при длине волны 412 нм [11]; общую супероксид-перехватывающую активность плазмы и активность каталазы определяли при помощи колориметрического метода с использованием набора реагентов Superoxide Dismutase Assay Kit («Cayman Chemical», США), каталожный номер 706002, и Catalase Assay Kit («Cayman Chemical», США), каталожный номер 707002. Регистрацию общей антиоксидантной активности плазмы крови проводили на хемилюминометре LUM-1200 (Россия), в качестве активатора использовали люминол.

Стандартный образец содержал 10 мМ боратного буфера (рН 9,0), 10 мкМ люминола, 100 мкл плазмы, разбавленной в 100 раз, 10 мкМ водорастворимого азоинициатора ААРН. Общий объем пробы составлял 1000 мкл. Реакцию запускали добавлением 10 мкМ ААРН. Измеряли интеграл под кривой спектра хемилюминесценции (ХЛ) — светосумму — в интервале времени с 0-й по 12-ю минуту. Далее рассчитывали светосумму свечения (ΔS) — разность светосуммы контрольного (без плазмы) и опытного (с плазмой) образцов в период измерения с 0-й по 12-ю минуту.

Длительность измерения составляла 16 мин.

Клиническое исследование проводили в соответствии с принципами Хельсинкской декларации последнего пересмотра (2000 г.) и требованиями качественной клинической практики.

Полученные результаты обрабатывали с помощью программ Excel и Statistica, версия 6. Для анализа различий количественных признаков в трех несвязанных группах и более использовали статистический критерий Краскела—Уоллиса ANOVA, в двух несвязанных группах применяли критерий Манна—Уитни. Достоверными считали различия при p<0,05.

Результаты и обсуждение

При исследовании было выявлено отсутствие достоверных различий концентрации ТБК-активных продуктов в плазме крови у пациентов с эпилепсией и контрольной группы. По остальным исследуемым параметрам (концентрации восстановленных SH-групп, общая супероксид-перехватывающая активность плазмы, активность каталазы, общая антиоксидантная активность плазмы) выявлено их достоверное снижение по сравнению с контролем.

Достоверное снижение концентрации восстановленных SH-групп во всех трех группах пациентов с эпилепсией по сравнению с пациентами контрольной группы свидетельствует об окислительном повреждении тиолсодержащих низкомолекулярных соединений плазмы крови. Считается, что в состоянии окислительного стресса атаке активными формами кислорода в первую очередь подвергаются не липиды, а белки плазматических мембран [12, 13]. Концентрация восстановленных SH-групп в плазме крови у пациентов 1-й группы составляла Me 0,29 мМ [LQ=0,26; UQ=0,31]; 2-й — Me 0,24 мМ [LQ=0,22; UQ=0,29]; 3-й — Me 0,27 мМ [LQ=0,24; UQ=0,29]; контрольной — Me 0,41 мМ [LQ=0,37; UQ=0,51] (рис. 1). Кроме того, выявлено достоверное повышение концентрации восстановленных SH-групп у пациентов 1-й группы по сравнению со 2-й группой (p=0,043) и 3-й (p=0,049). Данный факт может быть связан с длительностью течения заболевания: чем больше времени прошло с момента начала заболевания, тем выше уровень окислительного повреждения низкомолекулярных тиолов.

Рис. 1. Концентрация восстановленных SH-групп в плазме крови.

* — p<0,05 по сравнению с контрольной группой; ** — p<0,05 по сравнению с 3-й группой; *** — p<0,05 по сравнению со 2-й группой. Здесь и на рис. 3 и 4: 1 — 1-я группа; 2 — 2-я группа; 3 — 3-я группа; 4 — контрольная группа.

При исследовании общей антиоксидантной активности плазмы крови за количественный критерий степени тушения ХЛ была принята ΔS. Величина ΔS прямо пропорциональна объему добавленной в образец плазмы крови в исследуемом нами диапазоне объемов (рис. 2), а значит линейно зависит и от количества содержащихся в плазме антиоксидантных соединений. Данный факт позволяет использовать ΔS как критерий оценки уровня содержания плазменных антиоксидантов [14].

Рис. 2. Зависимость ΔS от объема плазмы крови в образце.

Общая антиоксидантная активность плазмы крови, о которой судили по ХЛ (рис. 3), также была достоверно ниже у всех трех групп пациентов с эпилепсией по сравнению с контролем (p=0,008). Этот факт позволяет сделать вывод о том, что общая антиоксидантная активность плазмы крови у пациентов с эпилепсией снижается вне зависимости от длительности, стадии и тяжести заболевания.

Рис. 3. Величина ΔS.

* — p<0,05 по сравнению с контрольной группой; ** — p<0,05 по сравнению со 2-й группой; *** — p<0,05 по сравнению с 3-й группой.

Величина площади подавления ХЛ составляла МЕ=3710 отн. ед. [LQ=2320; UQ=4695]; Ме=8315 отн. ед. [LQ=6143; UQ=12300]; Ме=7415 отн. ед. [LQ=5437; UQ=10 239] в 1, 2 и 3-й группах больных с эпилепсией и Ме=14 371 отн. ед. [LQ=12 706; UQ=16 865] в контрольной группе. При попарном сравнении групп пациентов с эпилепсией были выявлены достоверно более низкие значения ∆S в 1-й группе по сравнению со 2-й (p=0,0001) и 3-й (p=0,009). Исходя из данных результатов, можно сделать заключение, что пациенты в стадии манифестации заболевания имеют более низкий уровень общей антиоксидантной активности плазмы крови по сравнению с пациентами с более продолжительным течением эпилепсии. Вероятно, это связано со следующими факторами:

1. Пациенты с впервые возникшими приступами не находились на какой-либо лекарственной терапии, которая, возможно, способствует повышению антиоксидантной устойчивости организма. Это согласуется с установленными нами более высокими уровнями антиоксидантной устойчивости плазмы крови у пациентов в ремиссии и пациентов с резистентной формой заболевания, которые принимали ПЭП.

2. У пациентов на стадии манифестации эпилепсии наблюдается дисбаланс активации окислительных и антиоксидантных физиологических процессов: антиокислительные системы не успевают должным образом активироваться в ответ на интенсивные свободнорадикальные процессы, инициируемые эпилептическими приступами.

Из данных литературы [15] известно, что общая антиоксидантная активность плазмы крови в основном определяется содержанием в ней таких веществ, как мочевая кислота, мочевина и альбумин. Помимо этого, в меньшей мере данное свойство плазмы крови зависит от концентрации в плазме альфа-токоферола, аскорбата, восстановленного глутатиона, билирубина и коэнзима Q [16].

Нами были изучены плазменные концентрации мочевой кислоты, альбумина, билирубина и мочевины, которые у обследованных пациентов оказались в пределах нормы.

Учитывая данный факт, а также снижение концентрации восстановленных сульфгидрильных групп в плазме крови всех трех групп пациентов, можно сделать предположение, что именно снижение содержания восстановленных тиолсодержащих низкомолекулярных антиоксидантов (глутатион, цистеин и т.д.), вызванное интенсивно протекающими окислительными процессами, оказывает существенное влияние на уровень общей антиоксидантной активности плазмы крови. Помимо этого, альбумин, который играет важную роль в системе антиоксидантной защиты плазмы, может находиться в крови как в восстановленном, так и окисленном состоянии. Только восстановленная форма альбумина способна оказывать антиоксидантный эффект. Биохимический анализ крови, на который мы опирались при анализе результатов, дает информацию о суммарной фракции альбумина без учета степени его окисленности. Вероятно, у пациентов с эпилепсией повышена доля окисленного альбумина, что сказывается на уровне общей антиоксидантной активности плазмы крови. Данные предположения требуют более детального исследования.

Для выявления антиоксидантного статуса организма также определяли общую супероксид-перехватывающую активность плазмы крови. Как известно, при участии супероксиддисмутазы прерывается цепь свободнорадикальных процессов на стадии одноэлектронного восстановления кислорода с образованием супероксидного анион-радикала.

Проведено сравнение уровней общей супероксид-перехватывающей активности в сыворотке крови больных эпилепсией и условно здоровых людей, приведенных в соответствии с источниками литературы [17]. Общая супероксид-перехватывающая активность плазмы крови пациентов с эпилепсией составляла МЕ=0,021 ед.акт./мл [LQ=0,012; UQ=0,025]; Ме=0,013 ед. акт./мл [LQ=0,008; UQ=0,018]; Ме=0,024 ед. акт./мл [LQ=0,019; UQ=0,025] в 1, 2 и 3-й группах соответственно и Ме=0,100 ед. акт./мл [LQ=0,047; UQ=0,257] в группе здоровых. Было выявлено существенное снижение общей супероксид-перехватывающей активности в плазме крови у пациентов всех трех групп по сравнению с показателями нормы, что согласуется с данными исследований других авторов [18—20].

Кроме того, общая супероксид-перехватывающая активность у пациентов, находящихся в медикаментозной ремиссии, оказалась достоверно ниже данного показателя у пациентов с впервые возникшими приступами (p=0,041) и резистентной к лечению формой заболевания (p=0,003) (рис. 4).

Рис. 4. Общая супероксид-перехватывающая активность плазмы крови у пациентов с эпилепсией (ед. акт./мл), 1, 2, 3-я группы.

* — p<0,05 по сравнению с нормой; ** — p<0,05 по сравнению с 3-й группой; *** — p<0,05 по сравнению с 1-й группой.

При измерении активности каталазы, как и в случае с общей супероксид-перехватывающей активностью, установлено снижение данного показателя в плазме крови у пациентов с эпилепсией в сравнении с таковым у здоровых (p<0,05). Достоверные различия при сравнении активности каталазы у пациентов трех обследуемых групп в данном случае не найдены.

Результаты данной работы согласуются с результатами подобного исследования, в котором не было выявлено какой-либо разницы в уровне активности каталазы плазмы крови у леченых и нелеченых ПЭП пациентов [21].

Заключение

Полученные результаты могут объясняться, с одной стороны, первичными изменениями свободнорадикальных процессов, а с другой — приемом лекарственной терапии, влияющей на антиоксидантную устойчивость организма в целом, в группах больных с клинической ремиссией и пациентов с резистентной формой заболевания [21—25].

Тем не менее с учетом всего вышеизложенного можно сделать заключение, что изменения свободнорадикальных процессов по сравнению с нормой выявлены уже после первых приступов, сохраняются при резистентной эпилепсии и клинической ремиссии. Учитывая, что в разных группах пациентов с эпилепсией показатели активности антиоксидантной защиты достоверно отличаются между собой, можно предположить, что после первых эпилептических приступов, а также при различном течении болезни реализуются разные звенья окислительного стресса.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

<