Исследования, посвященные роли нарушений оксидантно-антиоксидантного равновесия в патогенезе шизофрении, активно ведутся в мире в течение нескольких десятков лет. Подавляющее число авторов, изучающих уровень маркеров окислительного повреждения, утверждают, что при шизофрении имеет место окислительный стресс — состояние избыточной продукции активных форм кислорода (АФК), причем уже на ранних стадиях [1, 2]. Достаточно большое количество работ касается также антиоксидантной терапии. В одной из них [3] был сделан вывод об отсутствии эффекта. Это противоречит данным о значимом снижении общей антиоксидантной емкости по сравнению со здоровым контролем при первом эпизоде шизофрении [4, 5], у больных без лекарственной терапии [6], с длительно текущим заболеванием [7], о снижении активности супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы [8], системы глутатиона в крови [9] и ткани мозга [10, 11], снижении уровня основного антиоксиданта плазмы крови, мочевой кислоты [12]. Ряд исследований был посвящен изучению антиоксидантных свойств антипсихотиков и их влияния на антиоксидантный статус. Из изученных препаратов (клозапин, кветиапин, оланзапин, рисперидон, зипрасидон, галоперидол) антиоксидантными свойствами обладали оланзапин и в меньшей степени клозапин [13]. Полагают, что назначение антипсихотиков мало влияет на общую антиоксидантную емкость и уровень глутатиона в крови [12, 14].
Неоднозначно мнение исследователей по поводу роли окислительного стресса при болезни Альцгеймера (БА), в частности неясным остается вопрос — является ли он значимым звеном патогенеза, фактором прогрессирования заболевания или его следствием [15]. Ситуация усложняется тем, что этиология этого заболевания до сих пор не выяснена, и встречается оно в основном у пациентов, у которых системный окислительный стресс выражен в силу возрастных изменений. В литературе обсуждается роль окислительной модификации метионина в образовании амилоида [16], влияние металлов-катализаторов реакций АФК — меди, железа, цинка [17], нитрозативного стресса [18], нарушений функции митохондрий и энергетического обмена [19]. Обращают внимание на сниженный уровень глутатиона в ткани мозга при БА [20], дефект генов, кодирующих глутатион-редуктазу [21]. Данных об эффективности антиоксидантной терапии при БА в литературе мало. Из заслуживающих внимания подходов — применение антиоксидантов, улучшающих функцию митохондрий, таких как ацетил-L-карнитин и альфа-липоевая кислота [22], и антиоксидантов, восстанавливающих баланс системы глутатиона [23, 24], но определенных выводов в отношении их эффективнсти пока нет.
Цель настоящего исследования — изучение показателей антиоксидантного профиля плазмы крови пациентов с параноидной шизофренией и БА и оценка антиоксидантных свойств ряда антипсихотиков.
Материал и методы
Изучаемую выборку составили 33 пациента с диагнозом параноидной шизофрении (медиана возраста 34 года, от 18 до 65 лет) и 18 пациентов с БА (медиана возраста 82 года, от 64 до 88 лет). В период обследования все они находились на лечении в связи с обострением заболевания в Психиатрическом стационаре им. В.А. Гиляровского.
Критериями невключения больных в исследование были острый и хронический инфекционный процесс, туберкулез, онкологические заболевания, декомпенсированный сахарный диабет.
В группу с шизофренией были включены пациенты с диагнозом «Параноидная шизофрения» (по МКБ-10 рубрика F20.0), которые были госпитализированы в связи с наличием психотической симптоматики — галлюцинаторно-бредовыми или аффективно-бредовыми расстройствами. Длительность заболевания в изученных случаях клебалась от 1 года до 20 лет. Все пациенты получали терапию антипсихотическими препаратами в полном объеме согласно стандартам оказания помощи.
Через 30 дней лечения среди пациентов были выделены больные, положительно реагирующие на терапию (ШЗ+) и резистентные к лечению (ШЗ–). Ответившими на терапию считали пациентов, у которых диагностически значимые симптомы шизофрении по PANSS составили не более 3 баллов (легкая степень выраженности) и общая оценка PANSS — <70 баллов [25]. Не ответившими на терапию считали пациентов, у которых при адекватной терапии антипсихотиками хотя бы один из диагностических симптомов оценен как умеренный (>4 баллов) и общий балл оценки по PANSS превышал 69. Большая часть пациентов в этой группе имели непрерывную форму течения шизофрении или страдали приступообразной формой параноидной шизофрении с резистентными к терапии затяжными приступами.
Исследуемым биологическим материалом явилась плазма крови, которая бралась в вакутейнеры с литий-гепарином. На преаналитическом этапе пробы хранили при –20 °С.
Были измерены антиоксидантные профили антипсихотических препаратов: хлорпромазина (аминазин, раствор 2 мл, 25 мг/мл), галоперидола (раствор 1 мл, 5 мг/мл), перициазина (неулептил, масляный раствор 4%, 4 г на100 мл), зуклопентиксола (клопиксол-акуфаз, масляный раствор, 50 мг/мл), клозапина (азалептин, таблетки по 25 мг), зипрасидона (зелдокс, раствор, 20 мг/мл), рисперидона (рисполепт, раствор, 1 мг/мл). Таблетки азалептина растирали в ступке, растворяли в дистиллированной воде и отфильтровывали. Хлопромазин, галоперидол, перициазин, зуклопентиксол, зипрасидон и рисперидон разбавляли дистиллированной водой или буферным раствором KH2PO4 (100 мM, pH 7,4).
В настоящем исследовании для оценки состояния антиоксидантной системы плазмы крови были применены методы, основанные на хемилюминометрии и спектрофлуориметрии, заключающиеся в регистрации антиоксидантного профиля и определении уровня окислительной модификации сывороточного альбумина.
Регистрация антиоксидантного профиля методом кинетической хемилюминометрии
Регистрацию хемилюминесценции проводили на хемилюминометре SmartLum 5773 (ООО «ДИСофт») по ранее описанной методике [26]. Использовали реагенты люминол, 2,2’-азо-бис(2-амидинопропан) дигидрохлорид (АБАП), KH2PO4 («Sigma»). Смешивали в кювете АБАП и люминол в конечных концентрациях 2,5 мМ и 10 мкМ соответственно, добавляли необходимое количество буферного раствора KH2PO4 (100 мM, pH 7,4) и регистрировали свечение при 37 °С до достижения плато, далее добавляли 10 мкл плазмы крови, предварительно разбавленной буферным раствором в 10 раз. Проводили регистрацию в течение примерно 30 мин до достижения нового стационарного уровня. Из хемилюминограммы определяли величину двух параметров: площади подавления хемилюминесценции (S), которая характеризует емкость сильного антиоксиданта плазмы крови — мочевой кислоты, и разницы в исходном и конечном стационарных уровнях хемилюминесценции (ΔI), которая характеризует количество неокисленных тиоловых групп альбумина.
Референтный интервал для практически здоровых в возрасте от 18 до 65 лет (n=110) был определен ранее: S [195—405] и ΔI [1,2—2,2]. Состоянию антиоксидантной недостаточности соответствует снижение S и ΔI.
Определение доли окисленного альбумина методом спектрофлуориметрии
После осаждения глобулинов полунасыщенным раствором сульфата аммония, измеряли триптофановую флюоресценцию плазмы крови при 353 нм (λex=260 нм) на спектрофлуориметре RF-5301 («Shimadzu», Япония). Рассчитывали снижение флюоресценции относительно такого же содержания стандартного сывороточного альбумина человека — параметр ДОА (доля окисленного альбумина), отражающий долю окисленно-модифицированного альбумина:
ДОА=(I0-I)/I0,
где I0 — расчетная (теоретическая) флюоресценция, определенная по градуировочному графику для известной общей концентрации альбумина, I — флюоресценция плазмы.
Общая концентрация альбумина оценивалась по результатам биохимического анализа.
Верхняя граница референтного интервала ДОА для группы практически здоровых лиц была равна 0,50. Превышение этого значения свидетельствует об окислительной модификации альбумина.
Результаты и обсуждение
Антиоксидантные профили пациентов с шизофренией и БА
Показатели антиоксидантного профиля у пациентов с шизофренией (группы ШЗ+ и ШЗ–) и БА представлены в таблице.
Описательная статистика параметров антиоксидантного профиля в группах обследуемых пациентов, медиана и межквартильный размах
| Группа | S (референтный интервал 195—405) | Число пациентов с S ниже нормы | ΔI (референтный интервал 1,2—2,2) | Число пациентов с ΔI ниже нормы | ДОА (референтный интервал 0,05—0,50) |
| БА, n=18 | 256 (162) N | 4 (22%) | 0,67 (0,38)¯ | 16 (89%) | 0,34 (0,15) |
| ШЗ+, n=16 | 185 (105)– | 9 (56%) | 0,78 (0,52)¯ | 10 (63%) | |
| ШЗ–, n=17 | 252 (107) N | 4 (24%) | 0,76 (0,35)¯ | 15 (88%) | |
| ШЗ (объединенная группа), n=33 | 218 (134) | 13 (39%) | 0,68 (0,41)¯ | 15 (76%) | 0,37 (0,16) |
Антиоксидантная емкость плазмы (S), обеспечиваемая мочевой кислотой, у пациентов с БА в целом не снижена — медиана находится в пределах референтного интервала, число пациентов со сниженной емкостью невелико, и это снижение может быть отнесено к возрастным изменениям. Аналогичную картину наблюдали у пациентов, резистентных к проводимой терапии (ШЗ–). Как будет сказано ниже, отсутствие окислительного стресса у таких пациентов вряд ли можно объяснить вкладом антипсихотиков. У пациентов с положительным ответом на антипсихотическую терапию (ШЗ+) медиана показателя ниже нижней границы референтного интервала, и число пациентов с системным окислительным стрессом — более 1/2 выборки (56%), причем в этой группе 3 пациента принимали мексидол — препарат, увеличивающий антиоксидантную емкость плазмы. За вычетом этих пациентов, процент случаев окислительного стресса в группе ШЗ+ составил 70%.
Показатель ΔI характеризует сохранность тиоловых групп альбумина и косвенно состояние системы глутатиона. Как в группе БА, так и в группе ШЗ выявлено снижение этого параметра — уменьшение уровня меркаптоальбумина вследствие истощения резервов системы глутатиона. В группе пациентов с более тяжелым течением (ШЗ–) эти нарушения были выражены сильнее.
В группах ШЗ и БА показатель ДОА не превышал верхней границы референтного интервала, что свидетельствует об отсутствии окислительного повреждения альбумина.
Антиоксидантные свойства антипсихотиков
В применяемой аналитической модели не обладали антиоксидантными свойствами галоперидол, зуклопентиксол, зипрасидон, рисперидон. Перициазин, клозапин (азалептин) и особенно хлорпромазин (аминазин) характеризовались выраженными антиоксидантными свойствами. В группах пациентов с параноидной шизофренией из изученных нейролептиков с сильным антиоксидантным эффектом использовали азалептин и аминазин. У всех пациентов, принимавших эти препараты, был снижен показатель ΔI, следовательно, эти препараты не оказывали значимого защитного антиоксидантного действия на тиоловый статус. Что касается общей антиоксидантной емкости (S), с большой вероятностью можно говорить, что прием азалептина или аминазина не оказывает на нее влияния — число принимающих эти препараты пациентов с окислительным стрессом и нормальными показателем S было примерно одинаковым.
Таким образом, в настоящем исследовании были получены данные, характеризующие антиоксидантные свойства плазмы крови: а) антиоксидантная емкость S, обусловленная мочевой кислотой и формирующая основной резерв антиоксидантной защиты в плазме крови; б) уровень тиоловых групп альбумина ΔI, основного белкового антиоксиданта плазмы, косвенно отражающий резерв системы глутатиона; в) доля окисленно-модифицированного альбумина ДОА, отражающая степень структурного повреждения альбумина и нарушения его транспортной функции.
Референтный интервал для используемой методики был ранее определен для здоровых от 18 до 65 лет, так как для более пожилых пациентов крайне сложно составить когорту практически здоровых лиц — все имеющиеся у них острые и хронические заболевания в той или иной мере влияют на антиоксидантный профиль плазмы, равно как и прием некоторых лекарственных препаратов. Даже для этого референтного интервала антиоксидантная емкость и доля окисленного альбумина у пациентов с БА была в целом в пределах нормы, что говорит об отсутствии системного окислительного стресса и сохранности структуры альбумина, влияющей на его транспортную функцию. Незначительное уменьшение S у некоторых пациентов связано, возможно, с возрастным фактором. Можно полагать, что для пациентов с БА назначение водорастворимых антиоксидантов-скэвенджеров вряд ли будет оказывать положительный патогенетический эффект.
Альбумин имеет единственную тиоловую группу (SH), обусловливающую его антиоксидантные свойства. Поддержание соотношения неокисленного меркаптоальбумина к окисленному осуществляется при помощи системы глутатиона. Определенное нами снижение параметра ΔI у большинства пациентов с БА свидетельствует о выраженном «тиоловом» окислительном стрессе.
В целом полученные данные согласуются с результатами других исследователей. Было высказано предположение, что при БА прежде всего страдает система глутатиона — показано снижение восстановленного глутатиона в эритроцитах [27], связанное с дефектом, в частности глутатион-трансферазы [28, 29]. В качестве потенциального терапевтического подхода рассматривается восстановление баланса глутатиона при помощи таких антиоксидантов, как N-ацетилцистеин и этиловый эфир гамма-глутанилцистеина [23].
Аналогичную картину наблюдали у пациентов с шизофренией, резистентных к терапии (группа ШЗ–), — нормальные значения параметра S свидетельствуют об отсутствии системного окислительного стресса, при этом маловероятно, что антипсихотики компенсируют его за счет собственных антиоксидантных свойств. Возможно, этим объясняется отсутствие положительного эффекта от лечения такими препаратами, как витамин С, растительные флавоноиды (гинкго билоба). В группе ШЗ– выражен тиоловый окислительный стресс, что делает перспективным терапию антиоксидантами, восстанавливающими глутатионовый баланс.
У больных с шизофренией из группы ШЗ+ тенденция к системному окислительному стрессу выражена больше, а к тиоловому окислительному стрессу — наоборот, слабее. Исходя из полученных данных видно, что чем тяжелее протекает шизофрения, тем ближе к норме показатели антиоксидантного профиля пациента. Эти результаты согласуются с концепцией, согласно которой активность рибосомных генов, т.е. адаптивный ресурс к окислительному стрессу при шизофрении, выше, чем у здоровых лиц [30]. Эти результаты требуют подтверждения.
Показатель ДОА в группе шизофрении был в пределах нормы, что свидетельствует о сохранной пространственной структуре альбумина и, следовательно, его транспортной функции. Можно было полагать, что нарушение транспортной функции альбумина вносит вклад в формирование фармакорезистентности при шизофрении, но эта гипотеза не подтвердилась.
Аминазин и азалептин обладают выраженными антиоксидантными свойствами, однако сопоставление по форме хемилюминограммы антиоксидантного профиля применяемых препаратов и плазмы крови пациентов с параноидной шизофренией позволяет предполагать, что их прием не оказывает влияния на оксидантно-антиоксидантное равновесие в плазме крови.
Таким образом, при изучении антиоксидантного профиля, включающего несколько показателей, характеризующих состояние антиоксидантной защиты плазмы крови при БА, не был выявлен системный окислительный стресс, обусловленный недостаточностью низкомолекулярных антиоксидантов плазмы крови, но выявлен «тиоловый» белковый окислительный стресс, свидетельствующий о недостаточности системы глутатиона. Аналогичные результаты были получены у пациентов с параноидной шизофренией, резистентной к терапии. У пациентов с параноидной шизофренией, положительно ответивших на терапию, был достаточно выражен системный окислительный стресс и менее выражен «тиоловый» окислительный стресс. Полученные данные могут быть полезными при подборе индивидуальной наиболее эффективной лекарственной терапии при параноидной шизофрении и БА.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ №18-00-01511 и гранта РФФИ 17-29-06017 офи_м.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.
<