Старение является процессом прогрессирующего замедления всех физиологических функций организма и характеризуется нарушением биологических процессов, приводящим к аккумуляции негативных изменений в клеточных и субклеточных структурах. При старении нарушается весь функциональный спектр реакций: когнитивные и моторные функции, эмоции, память, ощущения, адаптивное поведение, скорость реакций и др. Старение провоцирует возрастные нейродегенеративные заболевания [1, 2].

Одной из гипотез старения является свободнорадикальная гипотеза, согласно которой избыток свободных радикалов является лимитирующей детерминантой продолжительности жизни. Согласно В.П. Скулачеву, старение рассматривается как «медленный феноптоз, который запускается с помощью внутримитохондриальных активных форм кислорода», и «если построить кривые зависимости продолжительности жизни организма от количества свободных радикалов в митохондриях, то выясняется определенная закономерность: чем больше в клетке свободных радикалов, тем меньше мы живем» [3].

В клинической и амбулаторной практике для лечения различных заболеваний, в том числе ишемии мозга и возрастных нейродегенеративных болезней, с успехом применяется отечественный оригинальный лекарственный препарат Мексидол (2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат). Его механизм действия определяется влиянием на процессы, которые являются базисными в повреждающем действии на клеточные структуры, в том числе при старении, а именно, он обладает антиоксидантным, антигипоксантным и мембранотропным эффектами [4], способностью улучшать энергетический статус клетки [5], уменьшать глутаматную эксайтотоксичность [6]. Мексидол восстанавливает биохимические процессы в цикле Кребса, подавляет аскорбатзависимое (неферментативное) и НАДФН₂-зависимое перекисное окисление липидов, значительно повышает активность Se-зависимой глутатионпероксидазы, снижает активность индуцибельной NO-синтазы, в высоких концентрациях способен связывать супероксидный анион-радикал [7].

Наличие сукцината в структуре Мексидола послужило основанием для изучения его влияния на митохондриальную дисфункцию, которая является ключевым патогенетическим звеном при старении и различных нейродегенеративных заболеваниях. Известно, что сукцинат реализует сигнальную функцию через сукцинатный рецептор SUCNR1/GPR91 (succinate receptor 1/G protein-coupled receptor 91), сопряженный с G-белком [8]. SUCNR1 экспрессируется во всех органах и тканях, в подавляющем большинстве типов клеток, является сенсором экстраклеточного уровня янтарной кислоты, продукция которой митохондриями увеличивается в условиях гипоксии, ишемии, интоксикации. Активация сукцинатного рецептора сопровождается развитием тканеспецифичных эффектов, таких как стимуляция сердечной деятельности, повышение артериального давления, активация эритропоэза и ангиогенеза. В целом эффекты от активации рецептора могут быть охарактеризованы как антигипоксические, адреномиметические, направленные на преодоление энергетического дисбаланса [9]. Сукцинатная сигнализация выявляется в нейронах, астроцитах, микроглии, в условиях физиологической нормы и при ишемии, на этапе эмбрионального и постнатального развития, имеет критическое значение для васкуляризации и ангиогенеза мозга [9, 10].

Активация сукцинатного рецептора в нейронах инициирует Gα_q-белок-сопряженные сигнальные пути, причастные не только к ангиогенезу, но и биогенезу митохондрий, контролируемому транскрипционным коактиватором PGC-1α (peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1 alpha) [10—12]. PGC-1α интегрирует метаболические и нейрогормональные сигналы, служит детектором энергетического состояния клетки и осуществляет тонкую настройку митохондриального аппарата клеток к текущим энергетическим потребностям. PGC-1α активирует транскрипционные факторы (NRF, nuclear respiratory factor; PPAR, proliferator peroxisome activated receptor; ERR, estrogen-related receptor), контролирующие экспрессию генов ферментов дыхательной цепи митохондрий, β-окисления высших жирных кислот, цикла трикарбоновых кислот, ангиогенных факторов и антиоксидантных ферментов, т. е. обеспечивает усиление тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования без ущерба от окислительного повреждения [11, 12].

Арсенал активаторов митохондриогенеза крайне ограничен и включает: фибраты — агонисты рецептора, активируемого пролифератором пероксисом (индуцируют PGC-1α); метформин, 5-аминоимидазол-4-карбоксамид-рибонуклеозид (AICAR) — активаторы AMP-активируемой протеинкиназы (фосфорилируют и активируют PGC-1α); изофлавоноиды (ресвератрол) — активаторы деацетилазы Sirt1 (деацетилируют и активируют PGC-1α) [11], которые (фибраты и метформин) имеют существенные нейротоксические эффекты [12].

Цель исследования — изучение способности Мексидола, опосредуемой сукцинатным рецептором, индуцировать церебральный митохондриогенез в мозге молодых и стареющих крыс.

Исследование было выполнено на белых беспородных крысах-самцах разных возрастных групп (3, 6, 9, 12, 15 мес; n=384), выращенных в стандартных условиях вивария ФГБНУ «НИИ общей патологии и патофизиологии» при естественном чередовании суточной освещенности, свободном доступе к пище и воде.

Мексидол использовали в инъекционной форме (ООО «НПК «ФАРМАСОФТ», 50 мг/мл), вводили внутрибрюшинно (в/б), ежедневно на протяжении 20 дней. Изучение дозозависимого влияния Мексидола на индукцию церебрального митохондриогенеза проводили на крысах в возрасте 3 мес. Было проведено три серии экспериментов: курс Мексидола в дозе 20 мг/кг (М₂₀), 40 мг/кг (М₄₀), 100 мг/кг (М₁₀₀). Кроме того, применяли 8-дневный курс в/б введения Мексидола в дозе 40 мг/кг крысам в возрасте 3, 6, 9, 12, 15 мес. Для каждого анализируемого периода курса (1, 3, 8, 12, 20-й день) были сформированы группы контроля (курс ежедневных инъекций физиологического раствора; 17 групп, в каждой n=6) и опытные группы (42 группы, в каждой n=6). Для каждого возраста формировали группу интактных крыс (5 возрастных групп, в каждой n=6). Забой животных осуществляли декапитацией под эфирным наркозом через 1, 3, 8, 12, 20-е сутки после начала эксперимента (группы контроля), через 2 ч и 24 ч после 1, 3, 8, 12, 20-й инъекции (опытные группы).

Кору головного мозга отделяли на льду, замораживали и хранили в жидком азоте.

Индукцию митохондриогенеза оценивали методом вестерн-блот-анализа [13]. Определяли уровень экспрессии транскрипционного коактиватора PGC-1α, транскрипционных факторов NRF1 (nuclear respiratory factor 1) и TFAM (mitochondrial transcription factor A), каталитических субъединиц митохондриальных ферментов: НАДН дегидрогеназы флавопротеин 2 (NDUFV2); сукцинатдегидрогеназы субъединица, А (SDHA); цитохром b (cyt b); цитохром с оксидазы II субъединица (COX2); АТФ-синтазы альфа цепь (ATP5A). Также в образцах коры головного мозга оценивали уровень экспрессии сукцинатного рецептора (SUCNR1/GPR91) и фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) — маркера активации SUCNR1.

Белки цитозольного экстракта коры головного мозга [14] разделяли в 10% полиакриламидном геле, переносили на нитроцеллюлозную мембрану электроэлюцией. Мембрану инкубировали с первичными поликлональными антителами (разведение 1:500; 14 ч; 4 °C; Santa Cruz Biotechnology, США; sc-518025; sc-101102; sc-166965; sc-324161; sc-27992; sc-11436; sc-514489; sc-49162; sc-50466; sc-365578) и вторичными антителами (разведение 1:5000; 1 ч; 4 °C; sc-516102; sc-2030; sc-2768), коньюгированными с пероксидазой хрена. В качестве контроля использовали антитела к актину (sc-10731). Детектирование белков осуществляли в реакции с ECL-реагентами («Pierce Biotechnology, Inc.», США) на пленку фирмы «Kodak» с последующей денситометрией в программе Adobe Photoshop. О содержании искомых белков судили по плотности окрашивания полосы связывания антител с белком. Результат выражали в относительных денситометрических единицах.

Эксперименты проводили в соответствии с Национальным стандартом РФ ГОСТ Р-53434−2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики», Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях. Протоколы экспериментов были утверждены этическим комитетом ФГБНУ НИИОПП.

Статистический анализ данных выполняли с помощью программных пакетов Statistica 10.0 («Stat Soft Inc.», США) с использованием непараметрического рангового U-критерия Уилкоксона (Уилкоксона—Манна—Уитни). Различия между сравниваемыми группами считали статистически достоверными при p<0,05.

Мексидол в дозе 20 мг/кг (20 дней) не оказывал влияния на экспрессию каталитических субъединиц дыхательных ферментов. Курсовое применение Мексидола в дозах 40 и 100 мг/кг сопровождалось индукцией каталитических субъединиц всех четырех комплексов дыхательных ферментов митохондрий, при этом с увеличением дозы эффект развивался раньше, был более выраженным и продолжительным (рис. 1).

На фоне введения Мексидола наиболее значительной и длительной была индукция каталитической субъединицы SDHA (см. рис. 1, б). Увеличение уровня экспрессии субъединицы имело линейный характер, происходило дозозависимо на протяжении 8 дней (повышение от доз 40 и 100 мг/кг на 30 и 60% соответственно), но на этапе 12—20-х суток дозозависимые различия нивелировались, что свидетельствует о достижении максимального эффекта индукции SDHA. Полученные данные были ожидаемыми, поскольку отражают реализацию регуляторного гомеостатического механизма — индукцию фермента субстратом. Кроме того, об активации SDHA при введении в организм янтарной кислоты сообщалось ранее [15].

На фоне введения Мексидола также отмечена ранняя, выраженная, но менее продолжительная в сравнении с SDHA индукция cyt b (см. рис. 1, в). После 3-й инъекции Мексидола (40 и 100 мг/кг) наблюдали максимальный уровень экспрессии cyt b (160 и 170% в сравнении с контролем), после чего уровень снижался, составляя на этапе 8 и 20-го дня 130 и 140% соответственно. Известно, что сукцинат является предшественником молекулы гема [16] и в условиях гипоксической аккумуляции или экзогенного введения потенцирует синтез гемсодержащих белков, в частности cyt b. По мере увеличения уровня экспрессии SDHA и скорости окисления сукцината синтез гема и cyt b должен тормозиться, что и выражается в ограничении индукции cyt b.

Паттерн экспрессии каталитической субъединицы IV комплекса COX2 после введения Мексидола был сходен с динамикой уровня cyt b, но индукция была менее выраженной (см. рис. 1, г). Максимальное содержание COX2 выявляли в первые 3 дня курсового применения Мексидола в дозах 40 и 100 мг/кг (130 и 140% в сравнении с контролем), к завершению курсов наблюдали снижение содержания COX2 до уровня контроля.

Таким образом, отличительной особенностью мексидол-индуцированной экспрессии субъединиц дыхательной цепи является первичная выраженная индукция гемсодержащих дыхательных ферментов (cyt b), синтез которых является сукцинатзависимым, которая сменяется умеренно повышенной экспрессией по мере усиления индукции SDHA.

Индукция cyt b имеет важное значение в связи с увеличением экспрессии каталитической субъединицы NDUFV2 I комплекса дыхательных ферментов, которое происходило линейно дозозависимо на протяжении курсов Мексидола (40 и 100 мг/кг), составляя к 20-му дню 30 и 40% соответственно. Известно, что I комплекс формирует суперкомплекс или респирасому с III (b-c1 комплекс) и IV митохондриальными комплексами. Недостаточная экспрессия цитохромов в процессе биогенеза митохондрий приводит к увеличению продукции активных форм кислорода и снижению активности I комплекса [17—19].

Паттерн экспрессии ATP5A при введении Мексидола отличался от динамики содержания субъединиц субстратного и цитохромного участков дыхательной цепи — уровень ATP5A был умеренно и равномерно повышен в ходе курсов применения Мексидола в дозах 40 и 100 мг/кг, составляя 120 и 130% в сравнении с контролем соответственно (см. рис. 1, д).

В настоящее время накоплены данные о сигнальных механизмах, причастных к индукции PGC-1α. Они включают кальций-/кальмодулинзависимую протеинкиназу (CaMK) и AMФ-активируемую протеинкиназу (AMPK), NO-зависимую растворимую гуанилатциклазу, кальциневрин А, β-адренергический/цАМФ-путь [10, 12]. Ca⁺²-, CaMK-, PGE2-, NO-зависимые сигнальные пути известны для церебральной сукцинат/SUCNR1 сигнализации [9, 10] и, таким образом, индукция PGC-1α может осуществляться через активацию сукцинатного рецептора.

Индукция каталитических субъединиц митохондриальных ферментов под влиянием Мексидола (40 и 100 мг/кг) происходила сопряженно с дозозависимым увеличением уровня экспрессии PGC-1α (см. рис. 1, е), NRF1, TFAM (рис. 2, а,

При курсовом применении Мексидола в дозах 40 и 100 мг/кг выявлено дозозависимое увеличение экспрессии SUCNR1 и сопряженная индукция VEGF (см. рис. 2, в, г). Известно, что индукция VEGF служит маркером активации SUCNR1 [8—10]. В настоящем исследовании впервые установлено, что сукцинатная сигнализация сопровождается в коре головного мозга не только увеличением экспрессии SUCNR1 и VEGF, но также индукцией ключевого регулятора митохондриогенеза млекопитающих PGC-1α и маркеров биогенеза митохондрий — NRF1, TFAM, каталитических субъединиц дыхательной цепи и АТФ-синтазы. Впервые показано, что ключевой механизм повышения толерантности мозга к гипоксии/ишемии биогенез митохондрий является сукцинат/SUCNR1-опосредуемым.

Индукция Мексидола PGC-1α, продемонстрированная в работе, расширяет представления о механизмах плейотропной нейропротекторной активности этого препарата.

Угнетение биогенеза митохондрий при старении связано с возрастным снижением уровня важнейших индукторов биогенеза митохондрий — тиреоидных гормонов, глюкокортикоидов, эстрогенов. Старческая митохондриальная дисфункция положительно коррелирует с репрессией PGC-1α и особенно ярко проявляется в ЦНС [20]. Увеличение уровня PGC-1α принципиально в защите нервных клеток от окислительного стресса и клеточной гибели. PGC-1α индуцирует белки, которые поддерживают устойчивость нейронов к метаболическим, окислительным, эксайтотоксическим и протеотоксическим стрессам, причастным к патогенезу инсульта, болезни Альцгеймера, паркинсонизму [11]. Таким образом, PGC1−1α является уникальной потенциальной мишенью для коррекции возрастзависимой митохондриальной репрессии.

Для оценки эффективности Мексидола в индукции митохондриогенеза в коре головного мозга крыс разных возрастных групп препарат вводили в дозе 40 мг/кг (8 дней) животным в возрасте 3, 6, 9, 12, 15 мес.

Определение базового уровня экспрессии каталитических субъединиц дыхательных ферментов и АТФ-синтазы в коре головного мозга крыс разных возрастных групп (от 3 до 15 мес) показало, что увеличение их содержания отмечается только для субъединиц ферментов субстратного участка дыхательной цепи (NDUFV2 и SDHA) у крыс в возрасте 9 мес (рис. 3).

Выявленное у стареющих животных снижение экспрессии большинства исследованных каталитических субъединиц митохондриальных ферментов происходило сопряженно со снижением содержания ключевого активатора митохондриогенеза PGC-1α (см. рис. 3, е).

Мексидолзависимая индукция митохондриальных субъединиц и PGC-1α отмечена у молодых животных (возраст 3 мес) уже через 24 ч после первой инъекции Мексидола, у крыс в возрасте 6 и 9 мес — через 3 дня введения, а у крыс «возрастных» групп (12 и 15 мес) — через 8 дней введения Мексидола.

Наиболее значительным под влиянием Мексидола было увеличение экспрессии SDHA (II комплекс) и cyt b (III комплекс). Наблюдаемая избирательность эффектов Мексидола на экспрессию ферментов дыхательной цепи может быть связана с посттрансляционной модификацией (метилирование, фосфорилирование, сукцинилирование) PGC-1α, что определяет разную специфичность транскрипционного коактиватора по отношению к генам-мишеням [12].

Полученные данные позволяют заключить, что индуцированный Мексидолом церебральный митохондриогенез характеризуется:

1) согласованной индукцией каталитических субъединиц всех комплексов энергопродуцирующей системы митохондрий, кодируемых ядерным и митохондриальным геномом, что может расцениваться как адаптивный (корректный) митохондриогенез;

2) значительной устойчивой индукцией каталитической субъединицы SDHA — важнейшего молекулярного нейропротектора, повышающего толерантность мозга к гипоксии, ишемии, интоксикации, что определяется целым рядом уникальных особенностей фермента: SDH — единственный ферментный комплекс дыхательной цепи, четыре субъединицы которого кодируются ядерной ДНК. Остальные комплексы закодированы также в мтДНК, мутации которой накапливаются с возрастом и затрагивают все комплексы, исключая SDH, которая не теряет активности при старении; SDH проявляет фумаратредуктазную активность в условиях гипоксии/ишемии, в результате чего продуцируется сукцинат, поддерживается пул НАД⁺ и НАД⁺-зависимый гликолиз; SDH отличается наиболее высокой активностью среди всех ферментов цикла трикарбоновых кислот, устойчивостью к воздействию перекисных соединений и дыхательных ядов; SDH поддерживает электрон-транспортную и энергосинтезирующую функцию митохондрий в условиях гипоксии, ишемии, стресса, интоксикации [19].

Таким образом, Мексидол у молодых и стареющих животных вызывает индукцию сукцинатного рецептора SUCNR1, транскрипционного коактиватора PGC-1α, транскрипционных факторов NRF1, TFAM, каталитических субъединиц дыхательных ферментов и АТФ-синтазы, что свидетельствует о сукцинат/SUCNR1-опосредованной индукции церебрального митохондриогенеза. Выявленный факт индукции Мексидолом биогенеза митохондрий в мозге расширяет представления о его механизме действия и терапевтическом потенциале, так как известно, что подавление митохондриального биогенеза и дисфункции митохондрий составляют патогенетическое звено нейродегенеративных заболеваний, ишемических повреждений мозга, старческих когнитивных нарушений и неврологических расстройств [12, 20].

Проведенное исследование впервые выявило вовлеченность Мексидола в механизмы индукции церебрального митохондриогенеза, что определяет возможность его использования для коррекции возрастзависимой и патологической репрессии биогенеза митохондрий в мозге, наблюдаемой при старении и различных нейродегенеративных заболеваниях.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Кирова Ю.И. — https://orcid.org/0000-0002-2436-3661; e-mail: bioenerg@mail.ru

Шакова Ф.М. — https://orcid.org/0000-0002-0494-2500; e-mail: shakova.fatima@yandex.ru

Германова Э.Л. — https://orcid.org/0000-0003-1191-8477; e-mail: elgerm@mail.ru

Романова Г.А. — https://orcid.org/0000-0003-0090-351X; e-mail: romanovaga@mail.ru

Воронина Т.А. — https://orcid.org/0000-0001-7065-469X; voroninata38@gmail.com

Автор, ответственный за переписку: Кирова Юлия Игоревна — e-mail: bioenerg@mail.ru