Молекулярные биомаркеры в цереброспинальной жидкости при рассеянном склерозе

Рассеянный склероз (РС) — это хроническое аутоиммунное заболевание центральной нервной системы (ЦНС), ассоциированное с хроническим воспалением. РС затрагивает спинной и головной мозг и ведет к демиелинизации и нейродегенерации [1]. Ранние проявления РС, так называемый ремиттирующий рассеянный склероз (РРС), характеризуются обострениями, вызванными миграцией иммунных клеток в ЦНС. После наблюдаются периоды ремиссии и ремиелинизирования. С течением времени происходят формирование рубцов (склероз), аккумуляция аксональных повреждений и атрофия мозга, что приводит к ухудшению состояния пациента и обозначается как вторично прогрессирующий РС (ВПРС). В некоторых случаях, однако, наблюдается так называемый первично прогрессирующий РС (ППРС), который проходит без периода ремиссий [2].

При диагностике РС используются различные методы, такие как нейровизуализационные методы обследования (магнитно-резонансная томография — МРТ [3] и протонная магнитно-резонансная спектроскопия [4]). Широкое применение имеет метод, направленный на определение олигоклональных антител IgG и IgM, находящихся в крови и цереброспинальной жидкости (ЦСЖ). Также ведется поиск других белковых биологических маркеров РС.

Прогностические маркеры являются одним из основных инструментов в определении заболевания у лиц, которые являются близкими родственниками больных РС, а также у людей из групп риска. Несмотря на то что РС не является заболеванием, риск которого обусловлен строго генетически, имеются научные доказательства, что близкие родственники заболевших РС людей могут входить в группу риска [5]. На данный момент в качестве маркеров возможного риска развития РС используются тесты на антитела против ядерных антигенов вируса Эпштейна—Барр [6].

Диагностические биомаркеры позволяют отличить РС от других нейродегенеративных или аутоиммунных заболеваний, а также определить у пациента другую природу заболевания или выявить здоровых индивидуумов. Особенно такие маркеры являются релевантными в исследовании людей с клинически изолированным синдромом [7] и радиологически изолированным синдромом [8].

Биомаркеры, ассоциированные с различными патофизиологическими процессами в организме пациента, например маркеры воспаления и оксидативного стресса, помогают в наблюдении за течением болезни и реакцией организма на выбранную терапию [9].

В данном обзоре представлены исследования, посвященные признанным существующим, а также потенциальным молекулярным биомаркерам РС различной природы, которые могут быть полезными при диагностике заболевания и наблюдении за его течением.

В настоящее время диагностические критерии МакДональда в модификациях 2010 г. [10] и 2017 г. [11] включают в качестве дополнительного параметра единственный биомаркер — олигоклональные IgG в ЦСЖ.

IgG. Интратекальные олигоклональные IgG, не являясь специфическим маркером РС, широко используются в клинической практике при его диагностике [12, 13]. Наличие олигоклональных IgG определяют методом изоэлектрической фокусировки с последующей иммунофиксацией и окрашиванием серебром [14].

Интересно отметить, что более 90% пациентов с РС западных стран являются серопозитивными по олигоклональным IgG со специфичностью 94% [15], однако значительная часть пациентов азиатских стран являются серонегативными, с чувствительностью метода 77% и менее [16].

Также измеряют еще два параметра, связанных с олигоклональными IgG. Первым является индекс IgG, который рассчитывается согласно формуле:

(IgG_цсж)⁄(IgG_сыв) · (Альбумин_сыв)⁄(Альбумин_цсж).

Значение 0,7 и более считается повышенным, хотя данные по пороговому значению разнятся. Вторым является ежедневное измерение de novo синтеза олигоклональных IgG в ЦНС по формуле:

[(IgG_цсж – IgG_сыв/369) – (Альбумин_цсж – Альбумин_сыв/230) · (IgG_сыв/Альбумин_сыв) · 043] · 5,

с референсными значениями от –9,9 до 3,3 мг/день [17].

Стоит отметить, что олигоклональные IgG не являются подходящими кандидатами в качестве маркеров активности заболевания [16].

IgM. Липидоспецифические олигоклональные IgM представлены при РС в ЦСЖ у 40% пациентов [18, 19], однако недавние исследования подтверждают роль интратекального IgM в качестве биомаркера прогрессирующего РС, так как его уровень коррелирует с более высокой тяжестью заболевания, увеличенным количеством повреждений нервной системы, наблюдаемых на МРТ, а также истончением ретинальных нервных волокон [20, 21]. В повреждениях при РС определяются IgM-антитела, специфичные к олигодендроцитам и аксонам, что дает возможность предположить роль липидоспецифических антител в прогрессии разрушения ЦНС [22].

Также в качестве прогностических маркеров возможно использование хитиназ при раннем РС, уровень которых коррелирует с тяжестью состояния пациента [23]. Хитиназы являются семейством секретируемых гликопротеинов, которые связывают и гидролизуют хитин [24]. Хрящевые гликопротеины CHI3L1 и CHI3L2 являются хитинсвязывающими гомологами хитиназ при отсутствии у них функции гидролиза хитина [25].

Хитиназа-3-подобный белок 1 (CHI3L1). Из семейства данных белков наиболее полно изученным маркером РС является CHI3L1. Предполагают, что CH13L1 играет роль в воспалении и ремоделировании тканей [26]. В исследованиях с помощью in situ гибридизации и иммуноферментного анализа (ИФА) показано, что уровень CHI3L1 коррелирует с наличием РС у пациентов [27]. В том числе уровень CHI3L1 в ЦСЖ может использоваться в качестве прогностического маркера с предполагаемым минимальным порогом концентрации 281 нг/мл и более, в зависимости от исследования [23, 25, 27]. Повышенный уровень CHI3L1 в ЦСЖ коррелирует с укорочением периода перехода от клинически изолированного синдрома до РС, более быстрым развитием заболевания, а также повышенной вероятностью долгосрочных когнитивных нарушений [25, 28—30].

Хитиназа-3-подобный белок 2 (CHI3L2). Было показано, что уровень CHI3L2 в ЦСЖ коррелирует с уровнем CHI3L1, при этом в комплексе с МРТ CHI3L2 имеет более точную предсказательную ценность, чем CHI3L1. Были также установлены медианные значения для CHI3L2 в 7944 пг/мл для пациентов с РС и 5319 пг/мл для здоровых доноров (p=0,0010) [31]. Уровень CHI3L2 в ЦСЖ имеет высокую диагностическую точность при различении пациентов с РРС от ППРС. Кроме того, было установлено, что при РРС уровень CHI3L1 и CHI3L2 возрастает относительно такового у здоровых доноров. Соотношения уровня у пациентов с РРС к уровню у здоровых доноров составляют 1,90 и 2,39 для CHI3L1 и CHI3L2 соответственно [25]. Одновременное определение CHI3L1 и CHI3L2 в ЦСЖ имеет намного более высокую предсказательную точность, чем измерение каждого маркера по отдельности [25].

Таким образом, использование данных маркеров в совокупности с другими методами диагностики может помочь в более точном прогнозировании течения и тяжести заболевания.

Нейрофиламенты (Nf) — нейрон-специфичные промежуточные филаменты, являющиеся гетерополимерами. Гетерополимеры нейрофиламентов могут состоять из белковых субъединиц низкого (NfL), среднего (NfM) и высокого (NfH) молекулярного веса. Уровень нейрофиламентов в биологических жидкостях отражает степень аксональных нарушений, так как при этом Nf выходят во внеклеточное пространство.

Нейрофиламенты низкого молекулярного веса (NfL). Было показано, что при РС концентрации NfL в ЦСЖ повышаются во время обострения [32, 33]. Повышенный уровень NfL в ЦСЖ коррелирует с возможностью перехода клинически изолированного синдрома в РРС, а также с тяжестью дальнейших повреждений [33, 34]. Так, в исследовании С. Matute-Blanch и соавт. было показано, что у пациентов с радиологически изолированным синдромом, у которых выявлены олигоклональные IgG и NfL быстрее переходят в клинически изолированный синдром (p=0,079) и РС (p=0,017). Чувствительность и специфичность составляли 67 и 57% соответственно для клинически изолированного синдрома и 74 и 58% соответственно для РС [35]. В другом исследовании А. Bhan и соавт. показали, что уровень NfL в ЦСЖ в течение 5 лет статистически значимо отличался у пациентов с прогрессией по расширенной шкале оценки степени инвалидизации (EDSS) от такового у пациентов без прогрессии (p=0,05), также сходная корреляция была показана для пациентов, которые за 5 лет перешли из РРС в ППРС (p=0,01) [36]. В метаисследовании медианное значение уровня NfL составило 469 нг/л, в то время как медианный уровень у контрольной группы составил 326 нг/л (p=0,00001). Все данные в метаисследовании были получены с использованием ИФА-тестов [37].

Нейрофиламенты высокого молекулярного веса (NfH). Также была продемонстрирована клиническая ценность и NfH как биомаркера РС [38, 39]. Пациенты с РРС с высоким базовым уровнем (31,0 пг/мл) NfH в ЦСЖ имели более высокие значения EDSS, а также более быструю прогрессию заболевания в сравнении с контролем (p=0,043). Важно отметить, что степень атрофии на МРТ также показала высокую корреляцию с уровнем NfH [38, 39].

Глиальный фибриллярный кислотный белок (GFAP). GFAP — это промежуточный филамент, который в основном экспрессируется в астроцитах [40], но также и в эпидермальных клетках [41]. Было показано, что повышенный уровень GFAP в ЦСЖ ассоциировался с более быстрой прогрессией по шкале EDSS [42, 43].

Актины и тубулины. Причина аксональных разрушений при РС остается неизученной, однако полагают, что разрушение определенных компонентов цитоскелета аксонов вносит вклад в усиление инвалидности согласно EDSS и прогрессии Р.С. Актины и тубулины (Tub), так же как и Nf, являются белками цитоскелета. Актины служат основным компонентом микрофиламентов, в то время как тубулины — основным компонентом микротрубочек. Было показано, что повышенный уровень актинов (ранговый коэффициент корреляции Спирмена ρ=0,72; p<0,001) и тубулинов (ρ=0,63; p<0,01) коррелирует с прогрессией РС и шкалой EDSS, а также с уровнем NfL (ρ=0,41; p<0,05) [44]. Класс II тубулинов является основным нейрональным изотипом, который экспрессируется в основном в мозге, в то время как класс III является нейрон-специфическим маркером и обнаруживается в мозге и спинном корневом ганглии. Согласно исследованию R. Madeddu и соавт., уровень β-Tub класса II был значительно выше (p<0,05) у пациентов с РС, что коррелировало с повышенными уровнями Nf и GFAP. Уровни β-Tub класса III и NfL значительно превышали таковые у пациентов с прогрессирующим заболеванием в сравнении с РРС (p=0,029). Также была показана корреляция уровня β-Tub классов II (ρ= –0,84; p=0,008) и III (ρ=0,41; p=0,048) со шкалой EDSS [45].

Можно заключить, что белки цитоскелета клеток нервной системы при РС могут являться многообещающими потенциальными маркерами. Повышенный уровень этих биологических маркеров коррелирует друг с другом, а их комплексный анализ позволит в более полной мере оценить степень повреждения нервных тканей.

При РС происходит обширный воспалительный процесс, и, наблюдая за его медиаторами, можно оценивать активность иммунопатологического процесса.

Цитокины — это пептидные информационные молекулы молекулярной массой до 30 кДа. Цитокины разделяют на три группы: провоспалительные, противовоспалительные и регулирующие клеточный и гуморальный иммунитет. Хемокины являются семейством небольших цитокинов, секретируемых клетками позвоночных. CXCL (хемокинные (C-X-C мотив) лиганды), или α-хемокины, — семейство лимфоидных хемокинов, в которых два терминальных цистеина разделены другой аминокислотой. СС (хемокинные (C-C мотив) лиганды), или β-хемокины, не имеют дополнительной аминокислоты между двумя терминальными цистеинами [46, 47].

Одним из наиболее изученных является хемокин семейства CXCL — CXCL13. В большом когортном исследовании образцы ЦСЖ от 465 пациентов с РС сравнивали с образцами больных другими неврологическими заболеваниями и здоровых, при этом повышенные уровни CXCL13 были ассоциированы с РС в сравнении с клинически изолированным синдромом (p<0,01) и другими контрольными группами (p<0,0001), в том числе при переходе от клинически изолированного синдрома к клинически определяемому РС (p<0,001). Наблюдалась корреляция с повышением количества обострений, высокими значениями EDSS, а также повреждениями ЦНС. Также уровень CXCL13 коррелировал с наличием олигоклональных антител в ЦСЖ [48, 49].

Повышенная концентрация различных семейств цитокинов является характерной для РС (см. таблицу).

Была показана корреляция между серопозитивностью по олигоклональным IgG и уровнями провоспалительных цитокинов для ИЛ-12 (p40), CCL27, CXCL1, MIF и TRAIL. При наличии олигоклональных антител концентрация данных биомаркеров была повышена в ЦСЖ по сравнению с таковой у серонегативных и контрольных пациентов. Также была показана корреляция между EDSS и некоторыми маркерами. Чем выше было значение EDSS у пациентов, тем выше была концентрация ИЛ-9, MIL и IFN-γ [51].

Растворимые белки — антигены кластера дифференцировки (CD). Было показано, что уровни биомаркеров миелоидного происхождения, таких как растворимые CD163 (sCD163), CD14 (sCD14) и CD27 (sCD27), повышены при РС [53]. Повышенный уровень sCD163 показал высокую корреляцию с количеством моноцитов при РС в ЦСЖ, что позволило обозначить его как биомаркер активности макрофагов. Его уровень повышен при РРС и ППРС [54]. Соотношение уровня sCD14 и количества моноцитов в ЦСЖ может являться маркером микроглиальной активации [53].

Растворимые триггерные рецепторы миелоидных клеток 2 (TREM-2). Триггерный рецептор, экспрессирующийся на поверхности миелоидных клеток 2, или TREM-2, нарабатывается в высоких концентрациях в клетках микроглии ЦНС, где, предположительно, играет роль в ослаблении иммунного ответа. А. Ohrfelt и соавт. показали, что уровень растворимого TREM-2 повышен в ЦСЖ пациентов с РРС (+140%, p<0,0001), ППРС (+183%, p<0,0001) и ВПРС (+187%, p=0,02) в сравнении с контрольной группой [55].

Свободные легкие κ-цепи (FLC-κ). Легкие цепи иммуноглобулинов являются белковыми субъединицами иммуноглобулинов, представленными в двух видах, κ и λ. Было показано, что уровень FLC-κ повышен при всех формах РС [56]. В исследовании L. Villar и соавт. определено, что концентрации FLC-κ выше порогового значения в 0,53 мг/л приводят к более быстрому переходу от клинически изолированного синдрома к РС (p=0,003) [57]. P. Menéndez-Valladares и соавт. также подтвердили в валидационном исследовании корреляцию повышения κ-индекса, рассчитываемого по формуле:

(FLC–κ_цсж)⁄(FLC–κ_сыв)·(Альбумин_сыв)⁄(Альбумин_цсж),

с переходом от клинически изолированного синдрома к РС [58]. В другом исследовании было показано, что значения концентраций FLC-κ при пороговом значении 0,42 мг/л имели чувствительность и специфичность 93,8 и 85,6%, что коррелировало с наличием олигоклональных антител IgG (чувствительность и специфичность теста для олигоклональных IgG антител составляла 82,3 и 93,8% соответственно) [59].

Остеопонтин (OPN). OPN — секретируемый сиалопротеин, вовлеченный в широкий спектр патофизиологических процессов. OPN имеет костное происхождение, однако играет ключевую роль в регуляции функционирования иммунных клеток, включая адгезию, миграцию, дифференциацию и фагоцитоз моноцитов [60]. Было показано, что при РС концентрация OPN в ЦСЖ значительно различалась у пациентов с клинически изолированным синдромом (133 нг/мл, диапазон 92—226 нг/мл), РРС (215 нг/мл, диапазон 127—306 нг/мл), ВПРС (223 нг/мл, диапазон 195—247 нг/мл), ППРС (144 нг/мл, диапазон 121—225 нг/мл), а также у пациентов с другими нейродегенеративными заболеваниями (p<0,001) [61]. У больных РС уровень OPN в ЦСЖ коррелирует с EDSS (p=0,008) и снижается во время ремиссии (клинически изолированный синдром и РРС) (p=0,026) [62]. Кроме того, уровень OPN в ЦСЖ у больных РС положительно коррелирует с концентрацией в ЦСЖ ИЛ-17, ИЛ-23 и фактора некроза опухоли альфа — ФНО-α (p<0,0001) [63].

Основный белок миелина (MBP). Исторически MBP являлся одним из первых обнаруженных маркеров РС в ЦСЖ. Повышенный уровень MBP в ЦСЖ является ранним маркером при предположении РС у пациента [64], однако с появлением МРТ его измерение более не является полезным диагностическим инструментом.

В настоящее время в качестве биомаркеров РС разрабатываются сывороточные антитела к миелиновому гликопротеину олигодендроцитов (анти-MOG) и основному белку миелина (анти-MBP). Было показано, что в сыворотке анти-MOG антитела представлены у 72% пациентов с РС, в то время как антитела к MBP были обнаружены у 59% пациентов. Интересно отметить, что у пациентов с РРС и ВПРС преобладали анти-MOG над анти-МВР антителами (РРС 59%; ВПРС 57%) [65]. В другом исследовании было показано, что только превышение общего порогового значения в 500 мг/л ассоциировалось с обострением (p = 0,0351) [66].

Описанные выше белки являются потенциальными маркерами для оценки активности иммунопатологического процесса при РС, но многие из них не являются специфическими для Р.С. Так, например, экспрессия CXCL13 также повышена и при энцефалитных инфекционных заболеваниях [49]. Однако они могут выступать в комплексе в качестве прогностических маркеров ввиду высокой кросс-корреляции.

Натализумаб является препаратом для лечения РС, относящимся к классу моноклональных антител. Его действие основано на подавлении активности интегринов, содержащих субъединицу α4 — β7 и β1. Было показано, что при лечении натализумабом активность хитиназы 1 (CHIT1) значительно снижалась, составляя 10,6±17,3 против 8,5± 15,5 кат/л соответственно (p=0,036) [67]. Применение натализумаба также значительно снижало концентрацию CHI3L1 в ЦСЖ (p=0,02), что также в дальнейшем подтвердилось в исследовании М. Stoop и соавт. [68]. Кроме того, концентрация фетуина-А, который является белком-переносчиком свободных жирных кислот, при лечении натализумабом в ЦСЖ уменьшается [68, 69], как понижается и уровень NfL [70].

Финголимод является иммуносупрессивным препаратом для лечения Р.С. Механизм его действия лежит в модуляции рецепторов сфингозин-1-фосфата. Было показано, что при лечении пациентов с РС финголимодом уровни NfL, CXCL13 и CHI3L1 понижались (p<0,05). Так, концентрация NfL 1183±2135 пг/мл понизилась до 654±448 пг/мл (p=0,036), концентрация CXCL13 снизилась от 19,0± 25,9 пг/мл до 8,1±1,2 пг/мл (p=0,001), а уровень CHI3L1 — со 144±67 нг/мл до 119±40 пг/мл (p<0,001) [71].

Ритуксимаб представляет собой химерное, в то время как окрелизумаб — гуманизированное анти-CD20 моноклональное антитело. Их целевой рецептор CD20 находится на поверхности нормальных и малигнизированных В-лимфоцитов. CXCL13 может являться подходящим биомаркером для оценки эффективности данного лечения, так как его уровень коррелирует с активностью В-клеток. Так, было показано, что при лечении препаратами анти-CD20 моноклональных антител уровень CXCL13 снижается, однако его начальный уровень не является предиктивным для чувствительности к терапии ритуксимабом [72, 73].

Стоит также отметить, что при иммуносупрессивном лечении митоксантроном уровень CXCL13 и NfL в ЦСЖ уменьшался [74].

Существует множество потенциальных маркеров РС, однако в настоящее время широко используются только олигоклональные IgG- и IgM-антитела, а также FLC-κ. В качестве дополнительных биомаркеров используются антитела к вирусу Джона Каннингема и антитела к аквапорину-4, однако они не являются специфическими маркерами РС, но представляют из себя инструменты дифференциальной диагностики похожих или сопутствующих заболеваний.

В данном обзоре показано, что концентрации многих маркеров коррелируют, а значит их диагностическая и прогностическая ценность наиболее ярко выражается при комплексном определении уровня нескольких маркеров. Можно предположить, что наиболее удобной и информативной системой для их клинического использования будет являться белковый микрочип.

Антигенные микрочипы являются прекрасным инструментом для изучения паттернов реактивности, при этом используя небольшое количество клинического материала от пациентов [75]. Так, множество исследований было посвящено изучению иммунного ответа при РС [76—78], в том числе паттернов липидоспецифических антител в ЦСЖ [79].

В исследовании М. Hecker и соавт. проводили анализ антител в ЦСЖ у пациентов с РРС и ППРС, а также с другими неврологическими заболеваниями с использованием пептидного микрочипа высокой плотности, содержащего 3991 пептид. Было показано, что паттерны узнавания антителами обеих исследуемых форм заболевания пересекались, однако пациенты с ППРС показывали более широкий паттерн. Так, для РРС было определено два пептида, а для пациентов с ППРС — 23. Наивысшие сигналы были показаны для участка белка EBNA1 (аминокислоты 392−411) вируса Эпштейна—Барр, который является гомологичным N-концу человеческого кристаллина альфа-B [80].

Таким образом, поиск новых биомаркеров и разработка диагностических белковых микрочипов являются одним из перспективных направлений в диагностике РС.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Шедько Е.Д. — e-mail: shedko@cmd.su; https://orcid.org/0000-0003-4556-7513

Тюменцева М.А. — https://orcid.org/0000-0002-3145-3702

Как цитировать:

Шедько Е.Д., Тюменцева М.А. Молекулярные биомаркеры в цереброспинальной жидкости при рассеянном склерозе. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2019;119(7):95-102. https://doi.org/10.17116/jnevro201911907195

Автор, ответственный за переписку: Шедько Елизавета Дмитриевна — e-mail: shedko@cmd.su