Генетические причины умственной отсталости и аутистических расстройств включают почти все типы геномных вариаций (в основном хромосомные перестройки: микроскопические и субмикроскопические), вариации числа копий последовательностей ДНК (CNV) и мутации в отдельных генах [1—6]. Кроме того, показано, что эпигенетические изменения, являющиеся последствиями геномных вариаций, влияющих на гены, участвующих в эпигеномной регуляции, и унипарентальная дисомия, являющаяся следствием хромосомной или сегментной потери гетерозиготности, вносят значительный вклад в болезни, связанные с нарушением функционирования нервной системы [7—9]. Однако эпигеномные вариации, связанные с нестабильностью генома, значительно менее исследованы в контексте данных заболеваний по сравнению с генетическими причинами [8, 9]. Более того, работы по изучению генома и эпигенома клеток головного мозга позволяют предположить, что эпигенетические изменения, вероятнее всего, являются недооцененным источником происхождения как нейронального разнообразия, так и нервных, и психических заболеваний [3, 10]. Соответственно, можно предположить, что эпигеномные вариации могут вносить определенный вклад в патогенез нервных и психических заболеваний.

Вероятно, наиболее распространенным типом эпигеномных вариаций у человека являются протяженные участки гомозиготности (LCSH), определяемые как участки хромосом, не содержащие CNV, но характеризующиеся аллельной гомозиготностью (HMZ) [11]. LCSH более 1 млн пн всегда наблюдаются во время анализа генома с помощью молекулярного кариотипирования — SNP array [12, 13]. Наличие LCSH может свидетельствовать о кровнородственном браке родителей, унипарентальной дисомии (гомологичные участки хромосом или полностью две гомологичные хромосомы происходят только от одного из родителей) и играть решающую роль при рецессивных мутациях [14]. Более того, LCSH ассоциируют с различными фенотипическими особенностями и заболеваниями, среди которых ведущее место занимают болезни мозга [11, 15].

Принимая во внимание вклад эпигенетических факторов в развитие и в пластичность мозга, а также влияние взаимодействия генома и окружающей среды при нервных и психических заболеваниях, можно предположить, что эпигеномная вариабельность может играть значимую роль при нарушениях функционирования головного мозга [10, 16]. LCSH в данном контексте были исследованы в нескольких работах, представивших, однако, противоречивые результаты [11, 12, 16—19]. Фактически, единственная относительно подтвержденная ассоциация между возникновением LCSH и болезнями мозга (умственная отсталость и аутизм) связана с увеличением количества LCSH, затрагивающих гены, ассоциированные с рецессивными заболеваниями [11, 17—19].

Необходимо отметить, что в работах, посвященных изучению LCSH при нервных и психических заболеваниях, импринтированные локусы ранее не рассматривались, хотя известно, что для «классических» синдромов импринтинга — синдромы Ангельмана (AS), Беквита—Видеманна (BWS), Прадера—Вилли (PWS) и Сильвера—Рассела (SRS) характерны умственная отсталость, аутистические черты в поведении, задержка развития и эпилептиформные проявления [7, 15, 20, 21]. Мы предполагаем, что LCSH, затрагивающие локусы, ассоциированные с данными заболеваниями, могут приводить к аналогичному неврологическому или поведенческому фенотипу.

Цель данного исследования — изучение группы детей с идиопатической умственной отсталостью, аутизмом, врожденными пороками развития и/или эпилепсией с использованием SNP array, размером более 1 млн пн, позволяющего определять LCSH размером более 1 млн пн, для выявления ассоциации этих расстройств с LCSH в импринтированных участках генома.

Для приоритизации генов и геномных/эпигеномных сетей и оценки патогенности CNV и LCSH была использована оригинальная биоинформатическая технология.

Обследованы 504 пациента с идиопатической умственной отсталостью, аутизмом, врожденными пороками развития и/или эпилепсией с использованием SNP array.

Группа включенных в настоящее исследование индивидуумов является частью российской когорты детей с умственной отсталостью, аутизмом, эпилепсией и врожденными пороками развития, описанной ранее [4, 7, 12, 22]. Средний возраст пациентов составлял 5 лет. Соотношение мальчиков и девочек было 1:1,2.

Письменное информированное согласие было получено как минимум от одного из родителей пациентов.

Лимфоциты периферической крови 504 пациентов были исследованы при помощи молекулярного кариотипирования. CNV и LCSH обнаружены при помощи микроматрицы CytoScanHD (Affymetrix, Санта-Клара, Калифорния), состоящей примерно из 2,7 млн маркеров для оценки CNV и около 750 тыс. SNP для анализа LCSH. Лабораторные методики анализа подробно описаны ранее [4, 12]. CNV и LCSH были визуализированы при помощи программного обеспечения Affymetrix Chromosome Analysis Suite (ChAS для CytoScan HDArray версия NA32.3). Геномную локализацию определяли с использованием NCBI Build GRCh37/hg19. Импринтированные гены исследовали с помощью базы данных Geneimprint (http://www.geneimprint.com).

Биоинформатический анализ проводили с использованием оригинального подхода к приоритизации генов и CNV, как описано в предыдущих работах [23, 24]. Данный этап осуществляли для исключения фенотипического эффекта CNV и подтверждения клинической значимости LCSH. Алгоритм определения патогенного эффекта геномной (или эпигеномной) вариации основан на моделировании последствий изменений структуры и активности последовательностей ДНК с помощью пошагового применения стратегий приоритизации, ранжирования, составления интерактома и выявления геномных сетей. Выявление CNV, имеющих значение для фенотипических проявлений, проводили с помощью анализа следующих параметров: рекуррентность; упоминание в базах данных патогенных и непатогенных геномных вариаций; определение генов, локализованных в участках CNV; функций данных генов и заболеваний, ассоциированных с CNV/генами. Далее анализировали экспрессию генов, локализованных в участках патогенных и, вероятно, патогенных CNV, в нервных клетках. Следующим шагом являлось выявление взаимодействий генов, имеющих повышенную экспрессию в клетках головного мозга. На основании совокупных данных делали заключение об эффекте исследуемого изменения генома.

Данное исследование одобрено этическим комитетом Научного центра психического здоровья.

Наличие LCSH отмечено во всех исследованных случаях. Патогенные хромосомные и геномные аномалии, интрагенные (экзонные) CNV, обнаруженные при помощи метода молекулярного кариотипирования, были исключены из дальнейшего исследования. Исключая индивидуумов, родители которых состояли в кровнородственном браке (1,59%, или 8 пациентов), количество LCSH у 1 пациента варьировало между 63 и 132. Родство родителей определяли в соответствии с методологией, описанной ранее [25], и генеалогическим анализом. В данной группе пациентов не были затронуты локусы импринтированных генов, ассоциированных с известными синдромами. В 1 случае у пациента, рожденного в кровнородственном браке, был обнаружен LCSH в участке 7p12, содержащем импринтированный ген GRB10. Поскольку ассоциация гена GRB10 с SRS не достоверна [26], мы исключили этот случай из дальнейшего анализа.

LCSH в импринтированных локусах, затрагивающих ранее описанные синдромы импринтинга [21, 27], были обнаружены в 40 (7,9%) случаях. У данных индивидуумов были выявлены LCSH в участках 7q21.3 (SRS) (23 случая), 7q32.2 (SRS) (4 случая), 11p15.5 (SRS/BWS) (5 случаев) и 15p11.2 (AS/PWS) (12 случаев). Выявленные LCSH затрагивают импринтированные гены, индексированные в базе данных Geneimprint (http://www.geneimprint.com/site/genes-by-species.Homo+sapiens.imprinted-All). Помимо 1 индивидуума, у которого был выявлен LCSH в участке 7q31.33q32.3 размером 4,3 млн пн, размеры остальных LCSH варьировали от 1 до 1,6 млн пн. Корреляции размера LCSH с фенотипическими проявлениями болезни выявлено не было. В таблице приведены данные о молекулярных, хромосомных особенностях LCSH в импринтированных участках и клинических проявлениях у пациентов.

Известно, что эпигеномные вариации и нестабильность часто связывают с различными заболеваниями [6, 8, 15, 16]. В настоящей работе описан первичный дефект импринтинга (согласно классификации нарушений импринтинга [20]). Как в случаях хромосомных аномалий, так и в CNV (соматические и гоносомные), эти эпигенетические мутации могут рассматриваться в качестве причин нервных и психических заболеваний [22, 28—30]. LCSH, затрагивающие импринтированные локусы, являются наиболее описанными эпигенетическими изменениями, которые могут быть рассмотрены в качестве причины умственной отсталости, аутизма или эпилепсии. Стоит отметить, что выявить LCSH можно только с применением молекулярного кариотипирования с использованием SNP array [12—15, 25]. Несмотря на то что нарушения импринтинга, сходные с LCSH, могут также обнаруживаться молекулярно-генетическими методами (метил-чувствительная полимеразная цепная реакция, бисульфитное секвенирование и т. д.) [31—33], эти методы недостаточно эффективны для детекции LCSH. Исследование LCSH и импринтированных участков при применении SNP array может привести к 5% увеличению диагностической значимости данного метода.

Фенотипические особенности 40 индивидуумов, у которых были выявлены LCSH, затрагивающие импринтированные локусы, в той или иной степени напоминали SRS, BWS, AS или PWS [20, 21, 27, 32, 34], однако у данных пациентов наблюдались и другие клинические признаки (см. таблицу). Это свидетельствует об особом эффекте эпигеномных вариаций, затрагивающих импринтированные участки генома, на фенотип при данных атипичных формах нервных и психических болезней геномного импринтинга.

Поскольку LCSH наблюдали у всех индивидуумов из исследуемой нами группы, мы сравнили полученные результаты с ранее опубликованными данными исследований контрольных групп и пациентов с различными заболеваниями [11, 14, 17—19, 35]. Полностью идентичные LCSH у неродственных индивидуумов затрагивали определенные участки генома (например, 3p21 и 16p11.2p11.1). Они были обнаружены у большинства пациентов, и, вероятно, являются последствиями технических особенностей данного типа анализа. Так, специфическая организация этих геномных локусов может проявляться как LCSH во время молекулярного кариотипирования с использованием SNP array. В доступной литературе участки 7q21.3, 7q32.2, 11p15.5 и 15p11.2 не были описаны в качестве часто затрагиваемых LCSH [11, 17—19, 35]. Хотя в других исследованиях [36] упоминались случаи крупных LCSH, затрагивающих локусы 11p и 15q. Эти случаи, вероятно, представляют собой проявления унипарентальной дисомии, ассоциированной с соответствующими болезнями импринтинга, и не являются LCSH, рассматриваемыми в настоящем исследовании. Механизмы и последствия LCSH на данный момент изучены недостаточно полно [11], а интерпретация эпигенетических мутаций представляет собой сложную задачу. Для решения данной проблемы могут применяться различные биоинформатические методы, включая приоритизацию генов, которые зарекомендовали себя в качестве эффективных при выявлении функционального значения геномных и эпигеномных изменений [4, 23, 24, 37]. Исследования, проводимые при помощи технологии флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) и анализа метилирования, не выявили наличие AS и PWS у исследуемых индивидуумов [7], а альтернативных эмпирических методов, дающих возможность решения данной проблемы, в настоящее время не существует.

В заключение необходимо подчеркнуть, что в настоящем исследовании, выполнявшемся с применением молекулярно-цитогенетических и биоинформатических технологий, впервые было показано, что LCSH размером 1— 1,6 млн пн, затрагивающие хромосомы 7q21.3, 7q32.2, 11p15.5, 15p11.2 с импринтированными участками, встречаются относительно часто (~7,9%) у детей с умственной отсталостью, аутизмом, врожденными пороками развития и/или эпилепсией. Таким образом, данные эпигенетические мутации, по-видимому, распространены в группе пациентов с нервными и психическими заболеваниями. Следовательно, чтобы увеличить диагностическую значимость SNP array, необходимо также обращать внимание на наличие LCSH в данных участках при анализе генома пациентов с умственной отсталостью, аутизмом, врожденными пороками развития и/или эпилепсией.

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и СИТМА в рамках научного проекта № 18−515−34005.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Юров Иван Юрьевич — e-mail: ivan.iourov@gmail.com; https://orcid.org/0000-0002-4134-8367

Ворсанова Светлана Григорьевна — https://orcid.org/0000-0002-4869-5361

Зеленова Мария Александровна — https://orcid.org/0000-0001-7458-5396

Васин Кирилл — https://orcid.org/0000-0002-2799-3706

Куринная Оксана Сергеевна — https://orcid.org/0000-0002-7087-3929

Коростелев Сергей Анатольевич — https://orcid.org/0000-0002-3816-8031

Юров Юрий Борисович — https://orcid.org/0000-0002-9251-2286

Автор, ответственный за переписку: Юров Иван Юрьевич —
e-mail: ivan.iourov@gmail.com