Болезнь Паркинсона (БП) — мультисистемное хроническое прогрессирующее нейродегенеративнoe заболевание, ведущим симптомом которого является наличие в клинической стадии типичных моторных нарушений (гипокинезия, мышечная ригидность, тремор покоя), связанных с дегенерацией дофамин (ДА)ергических нейронов в черной субстанции. В то же время составной частью фенотипа БП является широкий спектр немоторных симптомов (нервно-психических, вегетативных, сенсорных), которые могут опережать на несколько лет и более моторные проявления заболевания [1—3]. Это связано с развитием нейродегенеративного процесса не только в черной субстанции, но и других отделах головного мозга и периферической нервной системы. Причем на доклинической стадии БП патологические изменения в экстранигральных структурах происходят гораздо раньше, чем в черной субстанции [4]. Современные методы лечения больных БП могут смягчить симптомы заболевания, но не способны замедлить неизбежного прогрессирования нейродегенерации. Успех в лечении при БП связывается с разработкой технологии ранней доклинической диагностики БП, что позволит вовремя начать нейропротективную терапию, нацеленную на предупреждение или замедление дегенерации нейронов головного мозга [2, 5, 6].

Одним из наиболее значимых нейропсихических симптомов клинической стадии БП является депрессия, которая встречается в среднем у 40% больных БП [7]. Среди характерных симптомов депрессии при БП отмечены ангедония (потеря чувства удовольствия и стремления к получению удовольствия), апатия, повышенная тревожность, снижение работоспособности [8—10]. При этом обобщающим симптомом депрессии у пациентов с БП является ангедония, которая выявляется в среднем в 45,7% случаев клинической стадии БП и может коррелировать с другими признаками депрессии [3]. Патогенез ангедонии при БП до сих пор не ясен. Предполагается, что ее развитие может быть связано с дегенерацией вентральной области покрышки среднего мозга, приводящей к дисфункции ДАергической мезолимбической системы [8, 11, 12].

Возникновение симптомов депрессии у отдельных пациентов с БП может предшествовать моторным проявлениям БП; больные с депрессивным расстройством имеют примерно в 2 раза больший, чем группа контроля, риск развития БП в течение последующих 4—6 лет [10, 13]. Поэтому неврологи предлагают использовать депрессию в качестве предиктора возможного развития Б.П. Клиническая значимость депрессии как диагностического маркера доклинической стадии БП пока не признана, поскольку технология доклинической диагностики БП еще не разработана. Решению этой актуальной проблемы может способствовать проведение исследований на экспериментальных моделях доклинической стадии БП у животных.

Снижение способности нейронов регулировать собственную систему протеома (уровень и качество белков) вследствие ослабления активности убиквитин-протеасомной системы деградации белков является одним из ключевых молекулярных механизмов патогенеза БП [6, 14]. Недавно на основе этого механизма с помощью интраназальной доставки в мозг ингибитора протеасом лактацистина (ЛЦ) создана новая модель доклинической стадии БП у крыс. Модель воспроизводит основные патоморфологические признаки доклинической стадии БП, симптомы нарушения сна и когнитивных функций [15—19]. Однако в этой модели изучение поведенческих симптомов депрессии не проводилось.

Цель данного исследования — оценка наличия поведенческих признаков ангедонии и деструктивных изменений в вентральной области покрышки среднего мозга в модели доклинической стадии БП у крыс, индуцированной интраназальным введением ЛЦ.

Исследование выполнено на 19 взрослых самцах крыс популяции Вистар в возрасте 7—8 мес и массой тела 340—360 г. Манипуляции с животными проводили с соблюдением биоэтических правил, предъявляемых этической комиссией ИЭФБ РАН.

Для моделирования доклинической стадии БП у крыс применен интраназальный способ введения специфического ингибитора ферментативной активности протеасом ЛЦ («Enzo Life Sciences», США), который растворяли в апирогенном фосфатном буфере (рН 7,4). ЛЦ вводили крысам (n=11) с помощью дозирующего устройства в дозе 100 мкг/10 мкл в каждую ноздрю дважды с недельным интервалом: кумулятивная доза на одну крысу составила 400 мкг. Контрольной группе животных (n=8) вводили эквивалентный объем растворителя Л.Ц. Препараты вводили со скоростью 3 мкл/мин.

Для выявления симптома ангедонии применен тест на предпочтение сахарозы, который проводили через 21 день после первого введения ЛЦ по стандартной методике [20] в модификации. Для этого контрольных и экспериментальных крыс рассаживали в индивидуальные клетки и в течение 24 ч предоставляли свободный доступ к двум идентичным шариковым поилкам (250 мл), одна из которых содержала питьевую воду, вторая — 20% раствор сахарозы в питьевой воде. Перед тестированием и после его окончания поилки с жидкостью взвешивали. Предпочтение сахарозы определяли как отношение массы потребленного раствора сахарозы к суммарной массе потребленной жидкости по формуле:

где m_сах — масса выпитого раствора сахарозы; m_воды — масса выпитой воды.

Для каждой крысы определяли базальный уровень предпочтения сахарозы за 2 дня до начала эксперимента. Правое/левое положение поилок с сахарозой и водой регулярно меняли.

После окончания теста животных декапитировали, извлекали головной мозг, разрезали его по среднесагиттальной плоскости. Правую половину головного мозга использовали для иммуногистохимических исследований, левую — для определения содержания моноаминов.

Для подсчета количества тел ДАергических нейронов в вентральной области (ВО) покрышки и их аксонов в вентральном стриатуме и определения содержания тирозингидроксилазы (ТГ) в нейронах применяли биотин-стрептавидиновый метод, описанный ранее [21]. С помощью криостата Leica (Германия) готовили чередующиеся серии фронтальных срезов головного мозга, содержащие вентральную область покрышки (от Bregma –5,20 мм до Bregma –6,04 мм) и вентральный стриатум (от Bregma –0,20 мм до Bregma –1,30 мм), в соответствии с атласом головного мозга крысы [22]. Толщина срезов составляла 10 мкм. В работе использовали первичные кроличьи поликлональные антитела против ТГ (1:800) («Abcam», Великобритания) и вторичные биотинилированные антитела против иммуноглобулинов кролика (1:300) («Vector Lab.», США).

Для идентификации общего количества тел нейронов в вентральной области покрышки среднего мозга в работе использовали традиционный нейрогистологический метод окрашивания нервной ткани по Нисслю [23] с применением красителя толуидиновый синий («Sigma», США). При окраске препаратов толуидиновым синим выявляются нейроны разных фенотипов с ядерными структурами.

Количественный анализ тел ДАергических нейронов в вентральной области покрышки и их аксонов в вентральном стриатуме проводили путем подсчета на фронтальных срезах числа нейронов и аксонов, иммунореактивных к тирозингидроксилазе. Изображения изучаемых структур мозга крыс получали с помощью микроскопа Karl Zeiss (Германия) cо встроенной видеокамерой и программного обеспечения для захвата изображения. С помощью программы PhotoM (Черниговский, http: t-lambda.chart.ru) проводили подсчет количества тел нейронов в вентральной области покрышки. Для каждого животного анализировали по 15 микрофотографий. Для количественного анализа терминалей ДАергических аксонов в вентральном стриатуме использовали программу ImageJ (NIH, США). По каждому животному сделано 15 микрофотографий для каждой из четырех условно-выделенных областей вентрального стриатума. Для анализа содержания ТГ в телах ДАергических нейронов выбирали каждый 7-й срез вентральной области покрышки от каждого животного. Оптическую плотность ТГ оценивали с помощью компьютерной программы как интенсивность серого цвета при прохождении волны света длиной 650 нм. Результат оценки оптической плотности представлял собой разницу между интенсивно окрашенными нейронами, содержащими иммунореактивное вещество, и интенсивностью окраски фона (не содержащего иммунореактивного вещества) на том же срезе.

Содержание дофамина в гомогенате клеток вентрального стриатума головного мозга крыс определяли общепринятым методом жидкостной хроматографии высокого разрешения с электрохимической детекцией на хроматографе LC-20 Shimadzu (Япония) с использованием обращенно-фазовой колонки (длина алкильной цепи C18). Концентрацию дофамина определяли с помощью метода внешнего стандарта при потенциале +0,70 В и выражали в пикограммах на 1 мг белка. Состав подвижной фазы: 75 мМ фосфатный буфер, содержащий 2 мМ лимонной кислоты (pH 4,6), 0,1 мМ октансульфоновой кислоты и 15% ацетонитрила (V/V). Скорость элюции подвижной фазы составляла 0,8 мл/мин.

Для анализа гисто- и нейрохимических показателей применяли критерий t Стьюдента для двух независимых выборок с неравными дисперсиями. При статистической обработке поведенческих показателей использовали критерий Краскела—Уоллиса с последующим применением непараметрического варианта post-hoc критерия Ньюмана—Кейлса. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

В экспериментальных исследованиях симптом ангедонии детектируется у грызунов как снижение предпочтения сладких растворов воде. Проведенный поведенческий тест на ангедонию при моделировании доклинической стадии БП показал, что на 21-й день после интраназального введения ЛЦ у 45% крыс отмечается снижение предпочтения сладкого раствора сахарозы на 14% (p≤0,05) по сравнению с контрольными животными (рис. 1).

Для того чтобы выяснить, связано ли развитие ангедонии с деструктивными изменениями в вентральной области покрышки среднего мозга, выполнен анализ патоморфологических признаков нейродегенерации у всей группы животных, получавших ЛЦ (рис. 2).

При оценке функционального состояния вентральной области покрышки среднего мозга при моделировании доклинической стадии БП важным представлялось исследовать содержание ДА в вентральном стриатуме и процессы, связанные с компенсацией уровня ДА, вследствие гибели ДАергических нейронов в этой области мозга. Согласно полученным данным содержание ДА снизилось на 40% (p≤0,05) на 21-й день после первого введения ЛЦ по сравнению с контролем (рис. 3, а).

При проведении сравнительного анализа патоморфологических и нейрохимических характеристик группы крыс с ангедонией и группы крыс без ангедонии в модели доклинической стадии БП у крыс не выявлено статистически значимых различий между этими группами по уровню нейродегенерации ДАергических нейронов в вентральной области покрышки и их аксонов в стриатуме, по уровню ДА в вентральном стриатуме и уровне ТГ в выживших нейронах.

Исследование выполнено на валидной модели доклинической стадии БП у крыс, недавно созданной в лаборатории с помощью интраназального введения ингибитора протеасом Л.Ц. Ингибирующее влияние ЛЦ (через β-лактон) является высокоспецифичным для протеасомы и приводит к накоплению в клетке мутантных и агрегированных форм белков, в том числе белка α-синуклеина, вызывающего гибель нейронов при БП [6, 14]. Важно отметить, что дисфункция протеасомы 26/20S в компактной части черной субстанции головного мозга является характерным патогенетическим признаком наследственной и спорадической форм БП [14, 25]. Созданная модель ингибирования протеасом головного мозга с большой надежностью воспроизводит ключевые патоморфологические признаки доклинической стадии БП: допороговый уровень нейродегенерации по сравнению с уровнем клинической стадии (60—70%) в нигростриарной системе и экстранигральных структурах (голубое пятно, обонятельные луковицы), снижение концентрации стриарного ДА, не превышающее пороговых значений, образование телец Леви и развитие нейровоспаления [16, 17, 19]. Показано, что подобно БП, деструктивные изменения в нигростриарной и экстранигральной системах в модели доклинической стадии БП у крыс сочетались с немоторными симптомами в виде нарушений сна с повышенным уровнем тревожности [17, 18] и когнитивных функций [15].

Универсальным симптомом депрессии у пациентов с БП является ангедония. В нашем исследовании, чтобы выявить признаки ангедонии в модели доклинической стадии БП у крыс, мы применили тест на предпочтение сахарозы, позволяющий оценить заинтересованность животного в поиске и получении удовольствия и вознаграждения. При анализе данных выяснено, что у 45% животных в модели доклинической стадии БП желание получать удовольствие от подслащенной сахарозой воды оказалось менее выраженным, чем в контрольной группе: последние предпочитали подслащенную воду чаще, чем апатичные. При этом у 55% модельных животных такой реакции не наблюдалось, они оставались гедонистами, предпочитая пить подслащенную воду так же охотно, как и нормальные крысы в контрольной группе. Таким образом, мы впервые показали, что модель доклинической стадии БП воссоздает у 45% животных ключевой депрессивный симптом — ангедонию. Важно отметить, что проявление ангедонии не являлось самостоятельным симптомом и было сопряжено с высоким уровнем тревожности у крыс в этой же модели доклинической стадии БП [18]. Следовательно, ангедония и повышенная тревожность составляют структуру депрессии в модели доклинической стадии БП у крыс и могут являться ранними немоторными маркерами БП. В литературе также накапливаются данные, что у некоторых пациентов депрессия является основным начальным симптомом БП и может появляться на несколько лет раньше проявления клинической картины двигательных нарушений [10, 13].

Поскольку ДАергический мезолимбический путь, связывающий вентральную область покрышки среднего мозга с прилежащим ядром (nucleus accumbens) вентрального стриатума, играет ключевую роль в механизмах формирования удовольствия и вознаграждения у грызунов и человека [26], важным представлялось исследовать его функциональное состояние в модели доклинической стадии БП у крыс. При сопоставлении полученных данных по поведению с данными патоморфологии и нейрохимии выяснено, что появление признаков ангедонии у модельных животных может быть связано с гибелью около 1/3 ДАергических нейронов в вентральной области покрышки и их аксонов в вентральном стриатуме, снижением концентрации ДА в вентральном стриатуме (в пределах 40%) и уровня ТГ в выживших нейронах. Можно полагать, что патофизиологической основой появления ранних симптомов ангедонии при моделировании доклинической стадии БП у крыс является функциональный дефицит ДАергической трансмиссии в вентральном стриатуме, угнетающий потенциацию нейронов в ДАергическом «центре удовольствия и вознаграждения». Данные нейропатологических исследований и функциональных методов нейровизуализации при обследовании пациентов с БП также указывают, что нейродегенеративные процессы в мезолимбической системе могут влиять на механизмы ДАергического удовольствия и вознаграждения [11, 27, 28]. Кроме того, положительное влияние агонистов дофаминовых рецепторов (прамипексол) на депрессию и ангедонию у пациентов с ранней клинической стадией БП подтверждает роль ДАергических механизмов в патогенезе эмоциональных расстройств [2, 8, 9].

Принимая во внимание, что деструктивные изменения в ДАергической мезолимбической системе были сходными в двух группах крыс с ангедонией и без ангедонии в модели доклинической стадии БП, можно полагать, что развитие ангедонии связано с перестройкой в работе не только ДАергической, но и других сигнальных систем мозга, отрицательно модулирующих активность зависимых от ДА путей в «центре удовольствия и вознаграждения». В последние годы накапливаются данные о важной роли гипоталамической меланокортиновой системы в модуляции ДАергической передачи в прилежащем ядре [29, 30]. Меланокортиновые рецепторы МК₃Р и МК₄Р обнаружены в гипоталамической и лимбических структурах головного мозга, включая вентральную область покрышки среднего мозга и вентральный стриатум. Показано, что введение агониста меланокортинового рецептора МК₄Р в вентральный стриатум приводит к снижению предпочтения раствора сахарозы у животных, тогда как инъекции агониста меланокортинового рецептора МК₃Р в вентральной области покрышки, наоборот, стимулирует мотивацию к потреблению сахарозы [31, 32]. Исследовательской группой из Медицинской школы Стэндфордского университета (Пало-Альто, США) экспериментально доказано, что развитие ангедонии при хроническом стрессе у мышей обусловлено уменьшением чувствительности дофаминовых (D1) рецепторов в прилежащем ядре из-за активации рецепторов МК₄Р [30]. Не исключено, что подобный механизм формирования ангедонии как одного из главных симптомов депрессивного расстройства характерен для ранней стадии БП.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что появление признаков депрессии в виде симптома ангедонии может быть ранним немоторным маркером БП, сигнализирующим о начавшейся нейродегенерации в мезолимбической системе головного мозга и нарастающем функциональном дефиците ДАергической трансмиссии в вентральном стриатуме. Полученные факты могут найти применение в разработке технологии доклинической диагностики БП и патогенетической терапии.

Работа поддержана грантом Российского научного фонда (проект № 16−15−00278).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*e-mail: irina-ekimova@mail.ru