Активность эритроцитарных и тромбоцитарных глутатионредуктазы и глутатион-S-трансферазы при параноидной шизофрении

В процессе эволюции в организме человека сформировались защитные механизмы к деструктивным свойствам кислорода, включающие антиоксиданты и ферменты антиоксидантной защиты. Окислительный стресс развивается в случае, если образование активных форм кислорода превышает способность антиоксидантной системы их нейтрализовать и элиминировать. Таким образом, он может быть следствием не только повышенного образования активных форм кислорода, но и недостаточной активности системы антиоксидантной защиты.

Ранее было установлено [1—3], что при шизофрении усилено образование свободных радикалов кислорода, а также интенсифицируется перекисное окисление липидов и имеются признаки окислительного стресса. Есть основания предполагать, что окислительный стресс является важным звеном патогенеза шизофрении [3, 4]. В связи с этим в последние годы большое внимание уделяется исследованию состояния различных элементов антиоксидантной системы при шизофрении [2].

Основным эндогенным антиоксидантом в организме человека является глутатион. Выявлено снижение его уровня при шизофрении в префронтальной коре мозга in vivo, в ЦСЖ [5, 6] и в аутопсийном мозге [7]. Было также установлено, что по сравнению с контролем уровень глутатиона снижен в плазме у больных шизофренией с первым психотическим эпизодом и у больных с хроническим течением заболевания (как до лечения, так и после антипсихотической терапии) [8—10].

Известно, что уровень глутатиона и соотношение концентраций его окисленной и восстановленной форм во многом зависят от активности и количества глутатион-зависимых ферментов, например глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы (GR) и глутатион-S-трансферазы (GST) [11, 12]. Значительное число работ [13—15] посвящено исследованию при шизофрении глутатионпероксидазы, которая переводит восстановленный глутатион в окисленную форму. Ее активность определяют в аутопсийной ткани мозга, плазме крови, эритроцитах и тромбоцитах. Меньшее внимание уделяется GR, основной функцией которой является восстановление окисленного глутатиона. Остается малоизученной и GST, которая инактивирует пероксиды, образующиеся при окислительном стрессе, и принимает участие в детоксикации ксенобиотиков и их метаболитов.

Цель настоящей работы — сравнительная оценка активности GR и GST в эритроцитах и тромбоцитах периферической венозной крови у больных шизофренией и лиц контрольной группы.

В исследование были включены 50 больных с параноидной шизофренией (F20.0 по МКБ-10) в состоянии обострения (галлюцинаторно-параноидный или параноидный синдром), которые находились на стационарном лечении. В группе больных было 47 мужчин и 3 женщины в возрасте 25—56 лет (медиана 34 года). В соответствии с особенностями психического состояния каждого больного проводилась индивидуально подобранная адекватная психофармакотерапия с использованием как типичных, так и атипичных антипсихотических средств.

Критериями исключения из исследования являлись органические заболевания ЦНС, острые и хронические соматические заболевания.

Контрольную группу составили 48 здоровых лиц — 45 мужчин и 3 женщины в возрасте 21—59 лет (медиана 38 лет).

В процессе обследования больных использовали общеклинические, психопатологические и психометрические методы. Основным психометрическим инструментом была шкала позитивных и негативных симптомов (PANSS). Психометрическую оценку проводили дважды — до начала лечения и после его окончания. За конечную точку обследования был принят период выписки из стационара (при улучшении состояния больного) или через 2 мес после начала терапии.

Образцы крови из локтевой вены у пациентов брали в вакутейнеры с антикоагулянтом — 3,2% цитратом натрия, емкостью 4,5 мл. Этого объема крови достаточно для определения активности GR и GST в тромбоцитах и эритроцитах в 3 повторах.

Каждый образец крови обрабатывали индивидуально в течение 2 ч после забора крови. Вначале цельную кровь центрифугировали 15 мин при 200 g и температуре 20 °C в целях последующего выделения тромбоцитов и эритроцитов. Для дальнейшего использования разделяли супернатант (плазму) и осадок, содержащий эритроциты и лимфоциты.

Плазму центрифугировали 20 мин при 2000 g и температуре 4 °C, осадок ресуспендировали в 0,105 М цитратном буфере с глюкозой (рН 5,7) и центрифугировали 20 мин при 2000 g и температуре 4 °C. Осадок тромбоцитов ресуспендировали в 0,05 М Tris-HCl буфере, pH 7,0, с 50% глицерина и хранили при температуре –20 °С. Непосредственно перед определением активности GR и GST к пробе тромбоцитов добавляли 50 мМ калий-фосфатного буфера, pH 7,4, содержащего додецил-β-D-мальтозид, до его конечной концентрации 1%, проводили лизис 10 мин при температуре 25 °C, затем образцы центрифугировали 10 мин при 4000 g и температуре 4 °C. Полученный супернатант разбавляли в 5 раз в 50 мМ калий-фосфатного буфера, рН 7,4 [16].

К эритроцитарной фракции добавляли 3 объема изотонического раствора натрия хлорида, перемешивали переворачиванием и центрифугировали 20 мин при 400 g и температуре 4 °C. Супернатант отбирали захватывая лимфоциты. Процедуру повторяли 2—3 раза. Отмытые эритроциты разливали на аликвоты и хранили при температуре –80 °С. Непосредственно перед определением активности GR эритроциты размораживали и лизировали в 10 объемах дистиллированной воды [17].

Активность всех указанных ферментов определяли спектрофотометрическими кинетическими методами с использованием 6-кюветного спектрофотометра. Удельную активность GR изучали по окислению НАДФ-Н в реакции восстановления окисленного глутатиона, активность GST — по скорости образования хромогенных конъюгатов глутатиона с 1-хлоро-2,4-динитробензолом. Концентрацию белка измеряли методом Лоури.

Для статистического анализа базы данных применяли модуль «непараметрический анализ» программы Statistica 7.0 («StatSoft»). Для оценки достоверности различий, изменений параметров и связей между ними использовали U-тест Манна—Уитни, метод парных сравнений Вилкоксона, вычисление коэффициентов ранговых корреляций Спирмена. Различия и корреляции считали достоверными при p<0,05.

В таблице

U-тест Манна—Уитни показал, что у больных шизофренией по сравнению с контрольной группой активность GR и GST в эритроцитах не изменена, в то время как в тромбоцитах активность GR и GST была достоверно снижена до и после лечения.

При использовании метода парных сравнений Вилкоксона достоверных изменений в активности исследуемых ферментов в ходе лечения выявлено не было.

Была предпринята попытка обнаружить связи между клинической симптоматикой и активностью GR и GST; был проведен анализ корреляций активности исследуемых ферментов в форменных элементах крови больных и показателей подшкал и суммарной балльной оценки по шкале PANSS.

Прогностически значимой оказалась активность эритроцитарной GST: в начале исследования она была выше в случае, если у больных отмечалась меньшая выраженность негативных симптомов в конце исследования (R= –0,41; р<0,05). Поиск ранговых корреляций Спирмена выявил наличие достоверной связи активности тромбоцитарной GST у больных с тяжестью психотической симптоматики в начале исследования до приема терапии (суммарная балльная оценка по PANSSpos — подшкале позитивной симптоматики) — чем более была выражена психотическая симптоматика, тем ниже была активность тромбоцитарной GST (PANSSpos в начале терапии и активность GST; R= –0,31; р<0,05). По завершении этапа острого периода терапии эта связь исчезала.

Анализ данных литературы показал, что основное внимание при исследовании глутатион-зависимых ферментов (GR и GST) уделяется изучению их активности в эритроцитах, так как, во-первых, их активность в эритроцитах достаточно высока и, во-вторых, эритроциты легко выделить в достаточных количествах.

Полученные нами результаты — отсутствие изменений активности GR в эритроцитах до и после терапии по сравнению с контрольными показателями — не согласуются с полученными другими исследователями данными о пониженной активности GR в эритроцитах больных шизофренией по сравнению с контролем [18, 19]. Возможно, это связано с разнонаправленным влиянием терапии на активность исследуемых ферментов: по данным литературы, типичные и атипичные нейролептики по-разному влияют на активность глутатион-зависимых ферментов [20, 21]. Критерии включения в настоящее исследование не ограничивали терапевтическую тактику: в соответствии с клинической ситуацией больные могли получать как типичные, так и атипичные антипсихотические средства, а также те и другие препараты в комбинации. Можно предположить, что расхождение наблюдаемых данных об активности GR связано с тем, что в настоящем исследовании применялась комбинированная антипсихотическая терапия, и, возможно, разнонаправленного действия разных антипсихотиков на активность GR [20]. Вместе с тем проведенные нами исследования представляют больший интерес по сравнению с контролируемыми исследованиями по оценке действия антипсихотической монотерапии, поскольку наши исследования отражают реальность обычной клинической практики.

Что касается GST, то обнаружена только одна работа, в которой было показано снижение активности этого фермента в эритроцитах при шизофрении по сравнению с контрольной группой, при этом терапия не влияла на активность GST [20]. В нашей работе показано, что активность эритроцитарной GST у больных не отличалась от таковой в контрольной группе. Однако этот показатель может быть важен для прогноза течения заболевания, так как выявлена достоверная связь активности GST до лечения с выраженностью негативных симптомов в конце исследования.

Если судить только по данным, полученным в нашей работе, свидетельствующим о достоверных межгрупповых различиях активности изучаемых ферментов, больший интерес для изучения по сравнению с эритроцитами представляют тромбоциты, в которых также выявлены GR и GST. По мнению ряда авторов [16, 17, 22], тромбоциты могут служить периферической моделью, отображающей процессы, происходящие в нервной ткани. В тромбоцитах обнаружены биохимические признаки/свидетельства окислительного стресса, который испытывает организм больных шизофренией [23].

Кроме ранее опубликованных нами работ [17, 24], в литературе нет данных об определении активности GR в тромбоцитах.

В настоящей работе были подтверждены наши ранее полученные данные о пониженной активности тромбоцитарной GR при шизофрении [24]. Надо отметить, что диагноз больных в этих двух работах был идентичен, но число обследованных больных различалось (50 в настоящем исследовании и 18 в предыдущем).

Результаты определения GST в тромбоцитах при шизофрении с приступообразно-прогредиентным течением публикуются впервые.

Как указывалось выше, биохимические процессы в тромбоцитах могут быть отражением этих процессов в мозге, однако известны только единичные работы, в которых изучались GR и GST в аутопсийном мозге при шизофрении. Так, отмечено снижение активности GR в хвостатом ядре [4], иммуноблоттингом показано снижение количества GST Mu (изофермента GST) в префронтальной коре [25].

Это согласуется с нашими результатами о снижении активности GR и GST в тромбоцитах при параноидной шизофрении.

Таким образом, в проведенных исследованиях были выявлены достоверные изменения активности ферментов глутатионового обмена (GR и GST) в тромбоцитах (в отличие от эритроцитов) больных шизофренией при сравнении с психически здоровыми лицами. Пониженная активность GR и GST подтверждает нарушение глутатионовой антиоксидантной защиты при шизофрении.

В нашей работе была также обнаружена достоверная связь между активностью GST и показателями шкалы PANSS до лечения, что может быть важно с точки зрения прогнозирования эффективности терапии.

Эти данные позволяют заключить, что активность ферментов глутатионовой антиоксидантной системы в форменных элементах крови больных шизофренией, определенная до начала антипсихотической фармакотерапии, может иметь значение для объективной оценки состояния этой метаболической системы и степени ее нарушения у больных.

Работа выполнена в ФГБНУ НЦПЗ без дополнительной финансовой поддержки других организаций или фондов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*e-mail: osavushkina1@yandex.ru
https://orcid.org/0000-0002-5996-6606