Синдром паркинсонизма (СП) является проявлением ряда заболеваний различной этиологии — болезни Паркинсона (БП); вторичного (сосудистый, травматический, токсический, вызываемый рядом лекарственных препаратов, например нейролептиками) паркинсонизма, а также ряда нейродегенеративных заболеваний (болезни Альцгеймера, Гентингтона, Пика и т. д.). Несмотря на различия в этиологии, патогенетическая основа всех форм СП одинакова. Основные нарушения при этом связаны с нейродегенеративными процессами в базальных ядрах головного мозга. Дегенерация дофаминовых нейронов в области черной субстанции, преимущественно в компактной части, и в вентральной области покрышки среднего мозга является причиной основных симптомов СП — акинезии и ригидности. Недостаточность тормозного действия дофамина в стриатуме приводит к гиперактивации холинергических нейронов [1], с действием которых связывают проявления основных двигательных расстройств [2].

Существует несколько подходов, позволяющих моделировать патологию в эксперименте. Основными методами моделирования БП у экспериментальных животных являются угнетение дофаминергической передачи, прежде всего в нигростриарном пути, или же, наоборот, активация холинергических нейронов. Эти два типа моделей различаются по динамике развития процесса и его проявлениям и рассматриваются как воспроизводящие, соответственно, акинетико-ригидную или дрожательную форму Б.П. При угнетении дофаминергической передачи симптомы паркинсонизма возникают медленно, продолжаются несколько суток, развитие патологии начинается с олигокинезии; преобладает акинетико-ригидная форма. Выраженность симптомов зависит от возраста животных. СП при активации холинергической системы развивается быстро, продолжается несколько часов, начинается с тремора, преобладает ригидно-дрожательная форма, редукция симптомов также начинается с тремора, возраст экспериментальных животных существенного значения не имеет.

В настоящем исследовании для изучения эффективности препаратов, стимулирующих дофаминергическую передачу, была выбрана экспериментальная модель, в которой патология индуцируется путем угнетения дофаминергической передачи. В эксперименте такого эффекта можно достичь путем введения нейротоксинов — метил-фенил-тетра-гидропиридина (МФТП), 6-гидроксидофамина и ротенона, патологическое действие которых избирательно повреждает дофаминергические нейроны. Однако было показано, что крысы менее чувствительны к токсическому действию МФТП по сравнению с другими видами грызунов [3]. Моделирование нейродегенеративных процессов путем введения 6-гидроксидофамина осуществляется только интравентрикулярно или непосредственно в ткань головного мозга, так как 6-гидроксидофамин не проходит через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). Введение 6-гидроксидофамина приводит к поражению всех катехоламинсодержащих нейронов, тем самым снижая уровни дофамина, норадреналина, адреналина и их метаболитов [4].

Системное введение ротенона крысам вызывает билатеральное поражение стриатума и бледного шара, дофаминергическую нейродегенерацию в черной субстанции. Ротенон является высоколипофильным веществом и свободно проникает через ГЭБ и биологические мембраны, вызывает дофаминергическую нейродегенерацию с образованием телец Леви в черной субстанции [5, 6]. Механизм действия ротенона связан с его способностью вызывать митохондриальную дисфункцию [7], которая вовлечена в патогенез различных нейродегенеративных заболеваний, включая и БП [8]. Олигокинезия, вызванная ротеноном, хорошо купируется препаратами L-DOPA (Л-дофа; диоксифенилаланин; леводопа). На уровне поведения действие ротенона проявляется снижением количества вертикальных стоек, гипокинезией и другими экстрапирамидными нарушениями [9]. Таким образом, введение ротенона позволяет получить патологию, схожую по своим симптомам и молекулярно-биологическим механизмам с наблюдаемыми при Б.П. По данным литературы [6], лучше всего ротеноновая модель (при системном введении ротенона) воспроизводится у старых животных (возраст 12—14 мес).

Учитывая механизм возникновения патологии, наибольшее значение в терапии имеют средства, повышающие дофаминергическую передачу. В качестве заместительной терапии широко используется метаболический предшественник дофамина (леводопа), который, в отличие от дофамина, проходит через ГЭБ и при участии дофа-декарбоксилазы превращается в дофамин. С целью уменьшения периферических побочных эффектов применяют комбинированные средства: леводопу и ингибитор периферического декарбоксилирования карбидопу (синемет, наком) [10].

Показано, что применяемый в неврологической практике цитиколин (нейпилет), являясь предшественником ключевых ультраструктурных компонентов клеточной мембраны (преимущественно фосфолипидов), способствует восстановлению поврежденных мембран клеток, препятствует избыточному образованию свободных радикалов, а также предотвращает гибель клеток, воздействуя на механизмы апоптоза, усиливает эффекты леводопы [11]. Цитиколин эффективен в лечении чувствительных и двигательных неврологических нарушений дегенеративной и сосудистой этиологии [12].

Цель исследования — оценка терапевтической эффективности сочетанного применения цитиколина и комбинированного препарата на основе леводопы и карбидопы (наком) на ротеноновой модели СП у крыс.

В эксперимент были включены 48 самцов крыс линии Вистар массой 450—550 г в возрасте 12 мес (питомник НПО «Дом Фармации», Россия). Животных содержали в стандартных условиях при свободном доступе к очищенной воде и стандартному корму (гранулированный комбикорм).

Животных разделили на пять групп. Крысы 1-й группы (контроль) получали растворитель (кунжутное масло, «Sigma-AldrichCo.», США) подкожно в течение 14 дней.

Крысам 2—5-й групп подкожно вводили ротенон («Sigma-Aldrich Co.», США) [13], предварительно растворенный в кунжутном масле. Ввиду низкой химической стабильности ротенона в тканях и жидкостях организма [14] индуктор патологии вводили в течение 2 нед [15] в дозе 2 мг/кг в день [13].

На этапе формирования патологии погибли 15% животных. Смертность регистрировалась в период с 6-го по 12-й день введения ротенона, что характерно для данной модели.

На следующий день после последней инъекции ротенона начинали введение исследуемых препаратов. Крысы 1-й (контроль, без патологии) и 2-й (патология без лечения) групп получали 1% раствор крахмала. Животным 3-й группы вводили препарат наком. Терапевтическая доза вводимого внутрижелудочно в течение 7 дней препарата была выбрана на основании данных исследований [16]. Показано, что наком был эффективен для крыс в дозе 50 мг/кг по сумме действующих веществ в отношении СП [17]. Животным 4-й группы вводили цитиколин в дозе 1000 мг/кг, так как, по данным исследований [18], цитиколин (нейпилепт) при как минимум 3-дневном внутрижелудочном введении в этой дозе был эффективен у крыс с такой патологией. Животные 5-й группы получали в комбинации — наком + нейпилепт. Длительность введения препаратов составила 7 дней. Внутрижелудочный способ был выбран как экспериментальный аналог энтерального введения препарата в клинической практике. Для оценки выраженности патологии (сравнение показателей 1-й и 2-й групп), характеризующейся триадой симптомов (ригидность, олигокинезия и экстрапирамидные нарушения), [14] и эффективности терапии (сравнение показателей 3—5-й и 2-й групп) использовали батарею тестов. Все тесты проводили непосредственно после окончания курса терапии.

Мышечный тонус задних лап крыс определяли по сопротивлению пассивной флексии в голеностопном суставе. Ригидность мышц туловища оценивали количественно, используя симптом «горбатости» [14], выраженность которого зависит от мышечной ригидности и определяется по укорочению расстояния от шеи до основания хвоста за счет сгорбленности животного.

Ригидность у крыс была оценена по балльной системе: 0 — отсутствие ригидности; 1 — укорочение расстояния от шеи до основания хвоста менее чем на 3 см; 2 — более чем на 3 см.

Локомоторная активность была оценена в течение 10 мин через 3 ч после последнего введения исследуемых препаратов на актометре, состоящем из 8 индивидуальных боксов (25×35,5×34 см), с системой расположенных по периферии датчиков, позволяющих оценивать горизонтальную и вертикальную активность. Регистрировали горизонтальную (количество последовательных пересечений датчиков горизонтальной активности) и вертикальную активность, вставание на задние лапы (количество пересечений датчика вертикальной активности).

По количеству пересеченных датчиков горизонтальной активности рассчитывали общее расстояние, пройденное животным (в см), — абсолютное число последовательно пересеченных датчиков, умноженное на расстояние между ними, равное 12,5 см.

Для оценки экстрапирамидных нарушений у грызунов применяли тест «вертикальный стержень» (Poletest) [19]. Крысу помещали носом вверх на вершину деревянного стержня (высота 100 см, диаметр 2,5 см), обернутого бинтом, с пробковым набалдашником диаметром 3,5 см. Регистрировали время, необходимое животному для ориентирования — поворота головой вниз, и время, необходимое для спуска вниз по стержню.

При статистической обработке данных использовали дисперсионный анализ (ANOVA) (в случае нормально распределенных данных) и анализ Краскала—Уоллиса (в случае несоответствия критериям нормального распределения). Если значимость различий подтверждалась процедурой дисперсионного анализа, проводили межгрупповое сравнение с использованием критерия Тьюки (при нормальном распределении) и критерия Данна (при несоответствии нормальному распределению). Различия были определены при уровне значимости p=0,05. Парное сравнение проводили с использованием t-теста (нормальное распределение) и теста Манна—Уитни (несоответствие нормальному распределению). Статистический анализ выполняли с помощью пакета программного обеспечения SASv.9.4 («SAS Institute Inc.», США).

Введение на протяжении 14 дней индуктора патологии ротенона привело к увеличению мышечного тонуса у крыс 2-й группы по сравнению с 1-й группой (р=0,0006, тест Манна—Уитни), что указывает на развитие мышечной ригидности, характерной для изучаемой патологии.

На фоне 7-дневного введения исследуемых препаратов мышечная ригидность снижалась и была статистически ниже во всех экспериментальных группах по сравнению с показателями во 2-й группе (Н=11,7; p<0,009, тест Краскала—Уоллиса). Последующие межгрупповые сравнения подтвердили снижение выраженности мышечной ригидности в группе, получавшей комбинацию препаратов наком+нейпилепт, по сравнению со 2-й группой (р=0,02, критерий Данна).

Введение индуктора патологии ротенона к 14-му дню эксперимента снизило горизонтальную (пройденная дистанция) (р=0,02, t-тест) и вертикальную активность (вставание на задние лапы) крыс (р<0,001, t-тест), что указывает на развитие олигокинезии (табл. 1).

Анализ результатов показал, что терапия привела к нормализации двигательной активности: увеличились пройденная дистанция (горизонтальная активность) (F_3,22=3,75; р=0,02, ANOVA) и число вставаний на задние лапы (вертикальная активность) (F_3,22=4,90; р=0,009, ANOVA). Последующее межгрупповое сравнение подтвердило достоверное увеличение горизонтальной активности в 5-й группе, получавшей комбинацию препаратов наком+нейпилепт, по сравнению со 2-й группой (без лечения) (р=0,01, тест Тьюки). Кроме того, достоверно увеличилась вертикальная активность в группах, получавших тестируемый препарат наком и комбинацию препаратов наком+нейпилепт (р=0,02 и р=0,004 соответственно, тест Тьюки) (см. табл. 1).

Оценка в тесте «вертикальный стержень» через 4 ч после окончания введения ротенона у экспериментальных животных 2-й группы показала статистически значимое увеличение времени поворота вниз головой (р=0,002, t-тест) и времени спуска с вершины деревянного шеста (р=0,004, t-тест) по сравнению с показателями у крыс 1-й группы (табл. 2). Увеличение временных интервалов указывает на развитие экстрапирамидных нарушений.

При оценке показателей наблюдалось статистически значимое влияние введения препаратов как на время поворота головы (ANOVA, F_3,22=10,57; р=0,0002), так и на время спуска (F_3,22=7,90; р=0,0009, ANOVA) в группах, получавших препараты, по сравнению со 2-й группой (патология без лечения). Последующее межгрупповое сравнение подтвердило укорочение времени поворота головы в 3-й и 5-й группах, получавших тестируемый препарат наком и комбинацию препаратов наком+нейпилепт (р=0,02 и р=0,004 соответственно, тест Тьюки), а также в 4-й группе, получавшей препарат нейпилепт (р=0,04, тест Тьюки), по сравнению со 2-й группой. Кроме того, уменьшилось время спуска с шеста в группах, получавших тестируемый препарат наком и комбинацию препаратов наком+нейпилепт (р=0,02 и р=0,0006 соответственно, тест Тьюки), по сравнению со 2-й группой (см. табл. 2).

Стоит отметить, что достоверное уменьшение времени спуска наблюдалось в группе, получившей комбинацию препаратов наком+нейпилепт по сравнению с группой, получившей цитиколин (р=0,04, тест Тьюки).

Введение ротенона в дозе 2 мг/кг/день в течение 14 дней оказалось достаточным для формирования признаков СП у крыс, что согласуется с данными литературы [6, 13]. У животных со сформированной патологией наблюдалось усиление мышечной ригидности при сопротивлении пассивной флексии в голеностопном суставе, снижение горизонтальной и вертикальной локомоторной активности. Тест «вертикальный стержень» показал у таких животных увеличение времени поворота головой вниз и времени спуска с вершины деревянного шеста, что указывает на признаки экстрапирамидных нарушений.

Введение комбинации препаратов наком и нейпилепт в течение 7 дней статистически значимо уменьшило проявления мышечной ригидности, что выражалось в снижении признака «горбатости» при сопротивлении пассивной флексии в голеностопном суставе у крыс.

Также результаты исследования показали, что препарат наком и его комбинация с нейпилептом снижали выраженность олигокинезии, что проявлялось в увеличении количества вставаний на задние лапы (вертикальная локомоторная активность). Стоит отметить, что увеличение пройденного расстояния экспериментальными животными в установке Актометр отмечалось только в группе, получившей комбинацию препаратов наком и нейпилепт. Наблюдаемый эффект можно интерпретировать как увеличение эффективности сочетания леводопы и карбидопы в комбинации с цитиколином.

При оценке эффективности терапии исследуемыми препаратами в тесте «вертикальный стержень» было показано, что 7-дневное введение всех препаратов уменьшало время поворота головы и время спуска с шеста. При этом эффективность терапии комбинацией препаратов была выше, чем терапия с использованием только цитиколина. Нормализация показателей до уровня контрольной группы (1-я группа, без патологии) наблюдалась у крыс, получавших терапию комбинацией препаратов наком и нейпилепт.

Известно, что леводопа является предшественником дофамина, который широко используется при лечении Б.П. Однако длительное применение этого препарата приводит к нейротоксичности, которая выражается в дискинезии [20], так как леводопа и ее метаболит дофамин могут усиливать окислительный стресс и ускорять нейродегенеративные процессы [21, 22]. Все это ведет к потере клинической эффективности препарата. При проведении экспериментальных исследований выявили, что пероральное введение цитиколина усиливает действие леводопы [11] за счет увеличения высвобождения вновь синтезированного из него дофамина [18]. Перенос этого опыта в клинические исследования позволил снизить эффективную дозу леводопы, но проблема возникновения нежелательных последствий у пациентов осталась [23, 24]. Так как леводопа на периферии быстро метаболизируется в дофамин при помощи декарбоксилазы ароматических аминокислот [25], добавление карбидопы, которая является ингибитором экстрацеребральной декарбоксилазы и не проходит через ГЭБ, позволило четырехкратно снизить дозу леводопы [26] и создать комбинированный препарат наком [27]. Сочетание этой комбинации с цитиколином (нейпилепт), который способствует увеличению концентрации дофамина в стриатуме [28] и обладает холиноблокирующим действием [29], является теоретически обоснованным подходом, что было подтверждено полученными в эксперименте данными.

Таким образом, установлено, что комбинация препаратов наком и нейпилепт обладает более выраженным терапевтическим эффектом в отношении купирования признаков экспериментального СП у крыс, по сравнению с монотерапией.

Работа была выполнена при организаторской и спонсорской помощи ЗАО «ФармФирма «Сотекс», Москва.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.