Коржевский Д.Э.

Лаборатория функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы отдела общей и частной морфологии Научно-исследовательского института экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН, Санкт-Петербург

Григорьев И.П.

Лаборатория функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы отдела общей и частной морфологии Научно-исследовательского института экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН, Санкт-Петербург

Сухорукова Е.Г.

Лаборатория функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы отдела общей и частной морфологии Научно-исследовательского института экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН, Санкт-Петербург

Гусельникова В.В.

ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург, Россия

Иммуногистохимическая характеристика нейронов черного вещества головного мозга человека

Журнал: Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2017;117(4): 50-55

Просмотров : 19

Загрузок :

Как цитировать

Коржевский Д. Э., Григорьев И. П., Сухорукова Е. Г., Гусельникова В. В. Иммуногистохимическая характеристика нейронов черного вещества головного мозга человека. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2017;117(4):50-55. https://doi.org/10.17116/jnevro20171174150-55

Авторы:

Коржевский Д.Э.

Лаборатория функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы отдела общей и частной морфологии Научно-исследовательского института экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН, Санкт-Петербург

Все авторы (4)

Черная субстанция (ЧС) — это структура среднего мозга, дофаминергические нейроны которой проецируются на полосатое тело и организуют дофаминергический нигростриарный путь [1], играющий важную роль в регуляции движений. Повреждение нигральных дофаминергических нейронов ведет к развитию синдрома паркинсонизма и является основной причиной болезни Паркинсона (БП) [2]. Установление связи между гибелью нейронов ЧС и развитием БП послужило основанием для детального изучения нейродегенерации катехоламинергических нейронов у человека и животных, в том числе с использованием экспериментальных биологических моделей [3—5]. Несмотря на открытие ряда важных звеньев патогенеза заболевания, до настоящего времени остаются неустановленными причины избирательной дегенерации дофаминергических нейронов ЧС и соответственно этиология большинства случаев БП [6]. Подобная ситуация свидетельствует о необходимости поиска новых подходов для раннего выявления нейродегенерации, определения молекулярных и клеточных механизмов избирательного повреждения компонентов нигростриарной дофаминергической системы, что невозможно без детального анализа нейрохимической организации соответствующих структур мозга человека.

Наиболее вероятно, что повышенная чувствительность дофаминергических нигральных нейронов к повреждающему фактору (факторы) обусловлена их цитохимическими особенностями. Известно, что дофаминергические нейроны синтезируют дофамин из аминокислоты тирозина в результате двух последовательных этапов ферментативного синтеза: L-тирозин → L-3,4-диоксифенилаланин (L-ДОФА) → дофамин. Реакцией, лимитирующей скорость синтеза дофамина, является гидроксилирование тирозина до L-ДОФА тирозингидроксилазой (ТГ), поэтому данный фермент считается маркером дофаминергических (и в целом катехоламинергических) нейронов. Для дофаминергических нейронов ЧС характерно наличие пигмента нейромеланина [7] — сложного комплекса разнообразных макромолекул, происхождение которого связывают с полимеризацией продуктов окисления дофамина [7, 8]. Нейромеланин обнаруживается в цитоплазме большинства, но не всех нигральных дофаминергических нейронов [9]. При помощи постановки иммуногистохимической реакции на кальбиндин в ЧС мозга человека были выделены две функциональные зоны — кальбиндиниммунопозитивный матрикс и кальбиндиниммунонегативные группы нейронов — нигросомы [10]. Основным источником кальбиндиновых волокон нейропиля в матриксе ЧС являются шипиковые проекционные нейроны, расположенные в полосатом теле [11]. В области нигросом такие волокна отсутствуют. В нигросомах расположено около 40% дофаминергических нейронов компактной зоны ЧС, тогда как 60% — локализовано в матриксе. Имеются данные, что именно нейроны в нигросомах погибают при БП в первую очередь [12]. Несмотря на значительный прогресс в накоплении знаний о структуре и функциях ЧС, а также ее роли в патогенезе БП, картина молекулярной структуры нигральных дофаминергических нейронов требует изучения [13]. В первую очередь это касается молекулярной анатомии ЧС головного мозга человека.

В настоящем исследовании был использован комплексный иммуногистохимический подход, позволяющий эффективно определять различные антигены в нервных клетках и обеспечивающий высокую сохранность изучаемых цитологических структур [14].

Цель исследования — определение цитохимических характеристик структурно не измененных нейронов ЧС головного мозга человека с использованием широкого спектра иммуноцитохимических маркеров, часть из которых (глутаматдекарбоксилаза-65, PGP 9.5, нефосфорилированные белки нейрофиламентов, α-тубулин) ранее не использовалась при изучении дофаминергических нейронов человека.

Материал и методы

В работе использованы фрагменты среднего мозга человека (17 мужчин и женщин в возрасте от 28 до 78 лет, причина смерти которых не была связана с заболеваниями и повреждениями головного мозга). Материал получен из архива отдела общей и частной морфологии Института экспериментальной медицины. Программа исследований была одобрена Локальным этическим комитетом ФГБНУ ИЭМ. Исходный материал фиксировали в цинк-этанол-формальдегиде и этаноле, после чего заливали в парафин. Из парафиновых блоков изготавливали срезы толщиной 5 и 7 мкм на санном (Leica SM 2000R) и ротационном (Leica RM 2125RT) микротомах. Готовые срезы наклеивали на предметные стекла с адгезивным покрытием («Histobond» и «Polysine», Германия). Часть полученных препаратов окрашивали классическими нейрогистологическими методами: толуидиновым синим по Нисслю, люксолевым прочным синим по Клюверу—Баррере. Другую часть использовали для проведения иммуноцитохимических реакций. Описание использованных первичных антител приведено в таблице. Для выявления связанных с изучаемыми маркерами кроличьих и мышиных первичных антител использовали наборы MACH2-Universal HRP-Polymer («Biocare Medical», США), EnVision+ System Labelled Polymer-HRP Anti-Mouse («Dako», Дания), Reveal Polyvalent HRP DAB Detection System («Spring Bioscience», США). Для определения связавшихся с тканевыми антигенами козьих первичных антител использовали последовательно антикозьи биотинилированные антитела («Dako», Дания) и стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой (Str/HRP; «Spring Bioscience», США). Пероксидазную метку выявляли с использованием диаминобензидинового хромагена (DAB+; «Dako», Дания).

Описаниеиспользованныхантител

Перед постановкой иммуноцитохимических реакций для улучшения иммунореактивности выявляемых антигенов проводили тепловое демаскирование в модифицированном цитратном буфере pH 6,1 (S1700; «Dako», Дания). После постановки иммуноцитохимических реакций часть срезов подкрашивали 0,5% водным раствором крезилового фиолетового («Sigma Aldrich», США) или квасцовым гематоксилином Джилла («БиоВитрум», Россия). Контрольные иммуноцитохимические реакции были проведены с учетом рекомендаций производителей реагентов.

Изучение полученных препаратов и фотосъемку выполняли при помощи микроскопа Leica DM750 и цифровой фотокамеры ICC50 («Leica», Германия). Для анализа полученных изображений использовали программу LAS EZ («Leica», Германия).

Результаты и обсуждение

При использовании обзорных нейрогистологических окрасок была проведена верификация пригодности исследуемого материала для настоящего исследования. На этом этапе были исключены из дальнейшего анализа 2 случая, в которых была обнаружена распространенная нейродегенерация. Среди включенных в дальнейший анализ случаев встречались такие, где в отдельных нейронах были выявлены слабоокрашенные внутриядерные тельца — тельца Маринеско. Согласно преобладающему мнению [15], их появление не является облигатным признаком нейродегенерации, а служит показателем возрастных изменений дофаминергических нейронов.

При проведении иммуноцитохимической реакции на ТГ в ЧС наблюдаются нейроны с разной иммунореактивностью. В большинстве крупных и мелких нейронов выявляется интенсивная цитоплазматическая реакция на этот фермент. Она наблюдается и в нейропиле в многочисленных отростках нейронов (см. рисунок, а). Помимо большинства ТГ-иммунопозитивных нейронов с интенсивной реакцией, встречаются также нейроны со сниженной иммунореактивностью к ТГ и редкие — с цитоплазматическими скоплениями нейромеланина, не содержащие ТГ.

Цитохимические особенности нейронов черного вещества головного мозга человека. Иммуноцитохимическая реакция на: тирозингидроксилазу (а), глутаматдекарбоксилазу (б), NO-синтазу (в), кальретинин (г), синаптофизин (д), альфа-тубулин (е), белок PGP 9.5 (ж), белки нейрофиламентов с антителами SMI-32 (з), белок Iba-1 (и), убиквитин (к). Подкраска квасцовым гематоксилином Джилла (а—е, з, и), крезиловым фиолетовым (ж, к). Стрелки указывают на внутриядерное убиквитин-иммунопозитивное тельце.

Изучение экспрессии холинацетилтрансферазы (ХАТ) показало, что содержащие нейромеланин нейроны ЧС являются ХАТ-иммунонегативными. Группы холинергических нервных волокон встречаются в ретикулярной части ЧС. В ее компактной части обнаруживаются единичные изолированные тонкие нервные волокна. В пограничной зоне дорсальной части ЧС присутствуют единичные не содержащие нейромеланин холинергические нейроны.

При проведении реакции на глутаматдекарбоксилазу (GAD65), являющуюся маркерным ферментом ГАМКергических нейронов, обнаружено, что все нейроны ЧС были иммунонегативны. При этом по периферии перикарионов нейронов и вдоль профилей крупных отростков нейропиля определялись многочисленные иммунопозитивные мелкие гранулярные структуры (см. рисунок, б), которые по расположению соответствовали крупным ГАМКергическим синаптическим терминалям. Значительное скопление этих структур присутствовало в компактной и еще более — в ретикулярной частях Ч.С. Учитывая анатомические связи ЧС, можно полагать, что выявляемые структуры являются терминалями проекционных ГАМКергических нейронов стриатума.

Иммуноцитохимическая реакция на NO-синтазу позволила выявить слабую положительную реакцию в цитоплазме нейронов ЧС (см. рисунок, в), которая определяется, несмотря на присутствие в клетках гранул меланина. Нейропиль также слабо иммунореактивен к NO-синтазе. В нем наблюдались отдельные профили отростков, дающие более интенсивную реакцию на NO-синтазу.

При изучении экспрессии ядерного белка NeuN было установлено, что позитивная реакция на него определялась лишь в части ядер нейронов Ч.С. При этом реакция в иммунопозитивных ядрах характеризовалась слабой выраженностью. В нейропиле положительная реакция на данный белок отсутствовала.

Нейромеланинсодержащие нейроны ЧС в подавляющем большинстве кальбиндин не содержали. Однако в дорсальной части ЧС встречались единичные нейроны, дающие умеренно интенсивную реакцию на него. В этой же зоне в нейропиле наблюдалась высокая концентрация иммунореактивных отростков нейронов. Нейропиль ретикулярной части ЧС умеренно иммунореактивен к кальбиндину. Вокруг компактных скоплений нейромеланинсодержащих нейронов наблюдалось понижение реакции нейропиля на кальбиндин, что позволяет идентифицировать такие скопления нейронов как описанные ранее особые функциональные группы — нигросомы [10].

Изучение экспрессии кальретинина показало, что нейроны ЧС являются преимущественно кальретининиммунонегативными. Однако в ретикулярной части ЧС встречались единичные иммунопозитивные к кальретинину нейроны, в которых нейромеланин отсутствовал (см. рисунок, г).

Большинство содержащих нейромеланин нейронов ЧС проявляло положительную цитоплазматическую реакцию на нейронспецифическую енолазу (NSE), различающуюся по интенсивности от слабой до умеренной. При этом в не содержащих нейромеланин нейронах этой области реакция на NSE, как правило, более интенсивная. Нейропиль содержал окрашенные профили отростков нейронов.

При проведении иммуноцитохимической реакции на синаптофизин тела клеток ЧС обычно не окрашены. При этом в нейропиле выявлялись интенсивно окрашенные зернистые структуры, расположенные вдоль контуров нейронов и их отростков (см. рисунок, д). Наиболее выраженной данная реакция была в гранулярных структурах ретикулярной части ЧС. В области проводящих путей реакция отсутствовала.

При проведении иммуноцитохимической реакции на α-тубулин обнаружилась средней интенсивности реакция в виде равномерного окрашивания свободной от нейромеланина цитоплазмы нейронов ЧС (см. рисунок). При этом интенсивность иммуноцитохимической реакции в отростках нейронов оказалась выше, чем в области перикариона. Наибольшая интенсивность иммунореактивности наблюдалась в нейропиле ЧС в крупных отростках.

При проведении иммуноцитохимической реакции на белок PGP 9.5 обнаружено, что большинство нейронов ЧС являются иммунонегативными. Однако в некоторых нигральных нейронах наблюдалась средней интенсивности цитоплазматическая реакция, отчетливо отграниченная от локального скопления гранул нейромеланина (см. рисунок, ж). В их ядрах также выявлялась умеренно позитивная реакция, связанная с хроматином. В нейропиле наблюдались окрашенные профили отдельных отростков.

При проведении иммуноцитохимической реакции на белки нейрофиламентов при постановке реакции с моноклональными антителами SMI-32 определялась интенсивная цитоплазматическая реакция в большей части нейронов ЧС. В цитоплазме клеток выявлялись нечетко ограниченные пучки нейрофибрилл (см. рисунок, з). В нейропиле окрашивались многочисленные отростки нейронов, из них более крупные — интенсивнее. При постановке реакции с моноклональными антителами 2F11 подавляющее большинство (до 95%) нейронов ЧС были иммунонегативными. При этом реакция в нейропиле была сходной с получаемой при реакции с антителами SMI-32. Подобное различие в результатах использования разных клонов антител, вероятно, связано с различием в белках нейрофиламентов, которые ими выявляются. Так, антитела SMI-32 реагируют с нефосфорилированными «тяжелыми» (200 кД) белками нейрофиламентов, тогда как антитела 2F11 — с фосфорилированной формой их «легких» (70 кД) белков.

При постановке реакции на микроглиальный белок Iba-1 вокруг иммунонегативных нейронов ЧС и в нейропиле определялись многочисленные разветвленные тонкие отростки микроглиоцитов (см. рисунок, и). Иногда в плоскость среза попадали и их перинуклеарные участки. В этом случае было заметно, что белок Iba-1 распределен в клетке неравномерно. Перинуклеарные участки обычно окрашены слабее отростков, однако в области расположения ядра микроглиоцита реакция несколько интенсифицируется. В нейронах белок Iba-1 не определялся.

Иммуноцитохимическая реакция позволила выявить преимущественное накопление синуклеина в волокнах ретикулярной части Ч.С. Слабая иммунопозитивная реакция в виде равномерного окрашивания обнаруживалась также в цитоплазме единичных нигральных нейронов. В исследованном материале не было обнаружено цитоплазматических агрегатов синуклеина.

Анализ препаратов после проведения иммуноцитохимической реакции на убиквитин показал, что нейроны ЧС головного мозга человека в основном являются убиквитиниммунонегативными. В единичных нейронах были обнаружены убиквитинпозитивные внутриядерные тельца (см. рисунок, к), которые по размерам и расположению соответствовали тельцам Маринеско. Было отмечено, что у лиц старше 50 лет число нейронов ЧС, содержащих убиквитиниммунопозитивные тельца, увеличивалось. Эти данные в целом согласуются с мнением [15] о преимущественном появлении телец Маринеско в нейронах у пожилых. Подкраска препаратов крезиловым фиолетовым позволяет отличить убиквитиниммунопозитивные тельца Маринеско от ядрышек. Количество телец Маринеско в пределах ядер нейронов ЧС варьирует от 1 до 6, однако чаще всего встречаются нейроны с 1—2 внутриядерными убиквитиниммунопозитивными тельцами.

Полученные данные позволили обнаружить ряд нейрохимических особенностей ЧС головного мозга человека, выделяющих это образование среди других структур мозга. Наиболее интересные данные получены при изучении паннейрональных маркеров. В отличие от подавляющего большинства нейронов головного мозга основная часть нейронов ЧС не экспрессирует ядерный белок нейронов NeuN, который является наиболее известным маркером нервных клеток [16]. Другой нейрональный маркер — NSE выявляется в нигральных нейронах, однако, что характерно, в нейромеланинсодержащих клетках — слабее, чем в других нейронах. Не характерна для нейронов ЧС и выраженная реакция на нейрональный белок PGP 9.5. Эти данные свидетельствуют о сниженной экспрессии общенейрональных белков в дофаминергических нейронах, что может быть связано со слабой устойчивостью клеток ЧС к действию повреждающих факторов.

Что касается нейромедиаторной специфичности нейронов ЧС, то в компактной части преобладают дофаминергические, что соответствует общему мнению [17]. Однако, как показывает проведенное исследование, в substantia nigra pars compacta имеются отдельные нейроны, не содержащие ТГ (т.е. недофаминергические, или утратившие способность синтезировать дофамин). Наши данные свидетельствуют, что среди нигральных нейронов изредка встречаются холинергические (ХАТ-содержащие) нервные клетки, преимущественно в дорсальной части pars compacta. Анализ данных литературы показал, что ранее в ЧС человека холинергические нейроны описаны не были. Только в ЧС крысы были выявлены [18] отдельные холинергические нейроны, однако функции их остаются неизвестными. Нами показано, что по крайней мере в части нейронов ЧС обнаружена NO-синтаза. Несмотря на присутствие GAD65-иммунореактивности, ГАМКергические нейроны в ЧС мозга человека обнаружены не были.

Иммуноцитохимическое выявление синаптофизина позволило установить картину распределения синаптических окончаний на меланинсодержащих (дофаминергические) нейронах ЧС, соответствующую представленным ранее ультраструктурным данным [19]. Интересно, что распределение реакции на синаптофизин и глутаматдекарбоксилазу в ЧС мозга человека сходно. Это свидетельствует в пользу того, что основная часть афферентов ЧС происходит от ГАМКергических нейронов стриатума (а, возможно, и других областей мозга).

В проведенном исследовании впервые было описано распределение белка микротрубочек α-тубулина в нейронах ЧС мозга человека. Хорошая воспроизводимость реакции на α-тубулин при изучении посмертного материала указывает на перспективность использования этого маркера для оценки функционального состояния нейронов головного мозга человека. Интенсивность иммуногистохимической реакции на данный белок указывает на сохранность цитоскелета [20] и свидетельствует о структурной стабильности нейронов.

Таким образом, представленные данные позволяют уточнить цитохимический профиль нейронов ЧС мозга человека и демонстрируют возможность использования ряда новых иммуноцитохимических маркеров для анализа нормальных и патологических структур этой области мозга.

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (проект 14−15−00014).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail