Правильная морфологическая диагностика и определение чувствительности опухолей к различным видам лекарственного лечения являются основой эффективности персонифицированного лечения злокачественных опухолей. Современные подходы к диагностике требуют привлечения сложных высокотехнологичных методов как для постановки диагноза, так и для определения биологических характеристик опухолей, влияющих на ответ опухоли на лекарственную терапию. Использование таких сложных методов, как иммуногистохимия, гибридизация in situ, различные молекулярно-генетические методы, требует тщательного и постоянного контроля качества проведения исследований. В условиях растущих требований к точности и стандартизации медицинских исследований внешний контроль качества становится неотъемлемой частью работы любой современной лаборатории. Одним из широко распространенных и сложных методов морфологического исследования является иммуногистохимический (ИГХ) метод. Этот метод давно вошел в постоянную практическую работу патолого-анатомических отделений, однако вследствие его многоэтапности и сложности на всех этапах возможны отклонения, которые могут приводить к получению ошибочных результатов, на основании которых может быть поставлен неправильный диагноз и назначена неадекватная схема лечения.

В связи с необходимостью обеспечения высокого уровня иммуногистохимических исследований в практической работе медицинских организаций в 2018 г. в ФГБОУ ДПО «РМАНПО» Минздрава России при поддержке Минздрава России был создан и успешно работает Центр контроля иммуногистохимических исследований (ЦКК ИГХИ ФГБОУ ДПО «РМАНПО»). Центр готовит эталонные срезы, которые рассылаются участникам раундов, в медицинских организациях на срезах проводится ИГХ-исследование, материалы возвращаются в центр, совет экспертов проводит их оценку и дает индивидуальные рекомендации участникам по исправлению недостатков. Также ЦКК ИГХИ готовит эталонные изображения для проведения оценки правильности интерпретации результатов ИГХ-исследования для маркеров сопроводительной диагностики. Эти изображения оцениваются участниками раундов, затем совет экспертов проверяет правильность этой оценки. Таким образом, ЦКК ИГХИ проводит два типа раундов по дифференциально-диагностическим маркерам и маркерам сопроводительной диагностики. Первый тип раундов — оценка правильности проведения аналитического этапа, в котором участники проводят ИГХ-исследование в своих лабораториях и предоставляют совету экспертов окрашенные срезы с эталонных мультиблоков и протоколы исследования.

В 2024 г. впервые был проведен раунд по контролю одного маркера (HER2/neu). В этом раунде осуществлялись оценка правильности окрашивания и интерпретации ИГХ-реакции с маркером HER2/neu на эталонном образце, предоставленном центром, и сравнение полученных результатов с двумя собственными образцами, исследованными в медицинской организации. Раунды по контролю качества определения маркеров рака молочной железы являются одними из наиболее востребованных, поэтому ЦКК ИГХИ также провел раунд, в котором проверялась правильность определения всех 4 обязательных маркеров рака молочной железы: рецепторы эстрогенов (ER), рецепторы прогестеронов (PR), HER2/neu и Ki-67. Раунды по аналитическому этапу исследования позволяют выявить недостатки и ошибки именно на этапе постановки ИГХ-реакции. Это особенно актуально в связи с широким появлением в лабораториях большого спектра новых антител, систем детекции, предметных стекол для ИГХ-исследования, иммуностейнеров открытого и закрытого типа, работа с которыми требует отработки и валидации протоколов исследования. Для этого типа раундов была разработана и постоянно применяется определенная система оценок: результаты, пригодные для использования в клинической практике (оптимально и хорошо) и непригодные (погранично и плохо) [1].

Второй тип раундов был посвящен проблемам ИГХ-исследования, которые присутствуют на постаналитическом этапе, т.е. при оценке и интерпретации результатов исследования маркеров для диагностических целей и определения чувствительности к маркерам таргетной и иммунотерапии. Неправильная интерпретация результатов может приводить к ошибкам в определении статуса опухоли по какому-либо показателю, например HER2-статус или dMMR/MSI-статус и, как следствие, к неправильному выбору лекарственного лечения. Для этих раундов совет экспертов коллегиально и консенсусно отбирает изображения сканированных иммуногистохимических препаратов, которые в дальнейшем предоставляются участникам раунда для интерпретации. Участники раунда должны оценить ИГХ-реакцию и определить статус опухоли в соответствии с актуальными требованиями Клинических рекомендаций Минздрава России и международных профессиональных сообществ, таких как ASCO/CAP [2—4]. По результатам, которые участники предоставляют в ЦКК ИГХИ, совет экспертов оценивает не только правильность интерпретации иммуногистохимического окрашивания, но и определение статуса опухоли. Каждый критерий имеет балльную оценку, разработанную советом экспертов, и принципы оценки результатов (оптимально, хорошо, плохо). По результатам раунда участники получают индивидуальные результаты с указанием допущенных ошибок и способов их исправления.

Однако недостатки и ошибки при проведении ИГХ-исследования и интерпретации его результатов для клинического использования могут быть связаны с самым первым этапом исследования — этапом получения и лабораторной обработки гистологического материала. Преаналитический этап включает доставку материала в лабораторию, фиксацию, гистологическую проводку, заливку в парафин и изготовление парафиновых срезов для проведения ИГХ-исследования или исследования методом гибридизации in situ. Важность контроля за преаналитическим этапом исследования возросла в последние годы в связи с широким распространением в практической клинической работе молекулярно-генетических методов, для которых важна сохранность ДНК и РНК. Для ряда нозологий, например немелкоклеточного рака легкого, значительная часть исследований по определению маркеров таргетной терапии теперь проводится не ИГХ-методом, а методом секвенирования нового поколения (NGS), что требует тщательного контроля преаналитического этапа исследования. Повышение требований к качеству ИГХ-исследований в настоящее время обусловлено также широким внедрением цифровизации в патолого-анатомические исследования и использованием возможностей искусственного интеллекта как помощника врача при оценке ИГХ-реакций. В связи с такой возросшей потребностью в контроле преаналитического этапа в 2024 г. ЦКК ИГХИ провел первый раунд по контролю качества лабораторной обработки биопсийного (операционного) материала. Для участия в этом раунде лаборатории предоставляли по два парафиновых блока образцов рака молочной железы (операционный и биопсийный материал), в ЦКК ИГХИ с этих блоков изготавливали парафиновые срезы и окрашивали гематоксилином и эозином. Также были изготовлены срезы, на которых было проведено ИГХ-исследование с антителами для рутинного исследования с ядерной и цитоплазматической локализацией (рецепторам эстрогенов и цитокератину 7), и с антителами к MLH1. Кроме того, была проведена оценка фрагментации ДНК молекулярно-генетическим методом. Для оценки результатов этого раунда также использовали критерии: оптимально, хорошо, погранично, плохо.

В 2024 г. ЦКК ИГХИ провел 13 раундов по контролю качества ИГХ-исследований, в которых приняли участие 122 лаборатории медицинских организаций, осуществляющих прижизненную диагностику по онкологическому профилю.

По контролю аналитического этапа исследования было проведено 9 раундов, в которых приняли участие 69 медицинских организаций:

1) рак молочной железы. HER2/neu на эталонном и собственном образце — 13 участников;

2) рак молочной железы /3 маркера — 25 участников;

3) рак молочной железы /4 маркера — 8 участников;

4) рак гинекологической локализации — 5 участников;

5) нейроэндокринный рак — 3 участника;

6) маркеры меланомы — 1 участник;

7) рак легкого; маркеры сопроводительной диагностики — 4 участника;

8) рак легкого; маркеры дифференциальной диагностики — 4 участника;

9) лимфопролиферативные заболевания — 6 участников.

Традиционно наибольшее количество лабораторий в 2024 г. приняли участие в раунде «Рак молочной железы (ER, HER2, Ki-67)», поскольку рак молочной железы является одним из наиболее распространенных и социально значимых онкологических заболеваний в Российской Федерации. Для лечения рака молочной железы постоянно появляются новые подходы к персонифицированной лекарственной терапии, что требует точного и достоверного определения маркеров таргетной и иммунотерапии этого заболевания [2].

Из 24 участников этого раунда 17 (70%) лабораторий показали результаты, пригодные для применения в клинической практике (оптимально и хорошо), а результаты, непригодные для клинического использования (погранично и плохо), хотя бы по одному маркеру продемонстрировали 7 (30%) лабораторий. При этом только 1 лаборатория получила оценку «плохо» по всем маркерам, что указывает на наличие системной ошибки при проведении ИГХ-исследования, о чем и было указано в индивидуальных рекомендациях совета экспертов для этой лаборатории.

Значительное улучшение результатов по сравнению с показателями 2023 г. отмечено по определению экспрессии рецепторов эстрогенов: в 2024 г. 22 (92%) лаборатории продемонстрировали результаты, пригодные для клинического применения (оптимально и хорошо), при этом в 50% лабораторий получены оптимальные результаты. Результаты, непригодные для клинического использования, выявлены только у 2 (8%) участников раунда. В 2023 г. у 28% лабораторий были результаты, непригодные для клинического использования [1]. Необходимо еще раз обратить внимание лабораторий, что совет экспертов отмечает наибольшие проблемы при определении ER-статуса при использовании антитела клона 6F11. Особенно актуально правильное определение уровня экспрессии рецепторов эстрогенов в группе рака молочной железы, которую называют ER Low, поскольку для лечения пациенток с такими опухолями применяются особые схемы лекарственной терапии [2]. Рекомендованный производителем протокол исследования не позволяет получать оптимальные результаты и требует валидации и отработки протокола. В тех лабораториях, где такая работа по рекомендациям совета экспертов была проведена, принявших повторное участие в этом раунде, получены данные, пригодные для клинического использования. Еще одной типичной погрешностью, отмеченной экспертами, было избыточное окрашивание препаратов гематоксилином, что может приводить к плохой идентификации ядер клеток со слабым уровнем экспрессии и, соответственно, вести к неправильному определению гормонального статуса опухоли при назначении лекарственной терапии (рис. 1). Использование различных вариантов гематоксилина требует от лабораторий отработки протокола окрашивания.

Рис. 1. Образцы с оптимальным и избыточным окрашиванием гематоксилином.

Иммуногистохимическая реакция с антителами к ER, ×200.

Оценка определения экспрессии Ki-67, проведенная советом экспертов, показала, что 84 % лабораторий продемонстрировали оптимальные и хорошие результаты, при этом оптимальные результаты были более чем у половины участников раунда (54%). Однако все же 16% участников получили оценки «погранично» и «плохо». Результаты 2024 г. точно повторили результаты 2023 г. [1]. Совет экспертов отметил те же проблемы в определении экспрессии Ki-67: неотработанный протокол ИГХ-исследования при использовании клона MM1, а также протоколы с применением антител одного производителя с системой детекции другого производителя. При определении экспрессии Ki-67 существенным фактором является окрашивание гематоксилином, поскольку избыточное окрашивание приводит к потере при подсчетах ядер с низкой экспрессией Ki-67, поэтому обязательно должно быть отработано время окрашивания при использовании различных вариантов гематоксилина. Анализ результатов раунда по определению 4 обязательных маркеров рака молочной железы выявил сходные проблемы, в том числе и при определении рецепторов прогестеронов. Результаты по определению экспрессии PR, непригодные для клинического использования, были связаны с ослаблением ИГХ-реакции и избыточным окрашиванием гематоксилином.

Анализ результатов аналитического этапа определения экспрессии HER2/neu был проведен одновременно по двум раундам: «Маркеры рака молочной железы» и «РМЖ. HER2/neu на эталонном и собственном образце». В настоящее время повышаются требования к определению HER2-статуса в связи с регистрацией в Российской Федерации новых анти-HER2 лекарственных препаратов, например трастузумаба дерукстекана, и применением анти-HER2-терапии не только в лечении рака молочной железы, желудка и желудочно-пищеводного перехода, но и для колоректального рака, рака эндометрия, мочевого пузыря и ряда других локализаций [4—8]. Сложность правильного определения HER2-статуса обусловлена еще и тем, что для рака молочной железы необходимо объективно выявлять группу опухолей с наличием слабоположительной экспрессии HER2/neu (1+) и точно отделять ее от опухолей HER2/neu (0) [3, 4], что требует высокого качества препаратов с ИГХ-реакцией.

В этих раундах совету экспертов было предоставлено для оценки 57 образцов из лабораторий, включая не только окрашенный эталонный образец, подготовленный ЦКК ИГХИ, но и собственные препараты с ИГХ-исследованием. Результаты, применимые в клинической практике, были показаны в 84% случаев, оценка «оптимально» была выставлена 31 образцу (53% случаев). Однако результаты, неприменимые для клинического использования, показаны в значительном количестве случаев — 9 (16%) образцов.

Эксперты отмечают, что в тех лабораториях, где получены неудовлетворительные результаты на эталонных образцах, также был неприемлемый результат и на собственных образцах лаборатории, что указывает на отсутствие валидации протокола на собственных внутрилабораторных позитивных и негативных контрольных материалах и, возможно, с нарушением регламентного обслуживания оборудования (рис. 2). В большинстве лабораторий, использующих антитела в рабочем разведении и закрытые протоколы, были получены оптимальные и хорошие результаты, однако в ряде лабораторий даже при использовании такого подхода к тестированию получены пограничные и плохие результаты. Также пограничные и плохие результаты показали лаборатории, использующие концентрированные антитела к HER2/neu, поскольку существуют объективные сложности с получением контрольных клеточных линий для отработки разведения антител и протоколов ИГХ-исследования. Кроме того, отмечена неудовлетворительная валидация протоколов для клона CB11 и при использовании антител одного производителя реагентов с системой детекции другого производителя. В этих случаях также всем участникам были даны индивидуальные рекомендации с целью ликвидации недочетов и получения в дальнейших исследованиях оптимальных результатов. С учетом потребности лабораторий в проверке качества ИГХ-исследования всех 4 обязательных маркеров рака молочной железы был проведен раунд, в котором участники получили для ИГХ-исследования эталонные образцы для 4 маркеров: рецепторы эстрогенов (ER), рецепторы прогестеронов (PR), HER2/neu и Ki-67. В этом раунде приняли участие 8 медицинских организаций. Раунд выявил наиболее распространенные недочеты при определении ER, HER2/neu и Ki-67 — такие же, как и в других раундах по маркерам рака молочной железы. ИГХ-исследование PR также показало, что наибольшие проблемы с правильным определением экспрессии PR связаны с избыточным окрашиванием гематоксилином, которое маскирует ядра со слабой реакцией, тем самым занижая оценку по системе Allred Score, что может приводить к неправильному определению молекулярно-генетического подтипа.

Рис. 2. Пример использования невалидированного протокола, непригодного для клинической работы.

а — образец, изготовленный и окрашенный в ЦКК ИГХИ, HER2 1+; б — образец, изготовленный в ЦКК ИГХИ и окрашенный в лаборатории невалидированным протоколом (то же поле зрения), оценка «плохо», ложнопозитивное окрашивание, HER2 3+; в — образец, изготовленный и окрашенный в лаборатории, выраженное фоновое окрашивание стромы и цитоплазмы, оценка «плохо».

В раунде «рак молочной железы» в 2024 г. принимали повторное участие 7 лабораторий — участников такого же раунда 2023 г., четырем из них удалось улучшить свой результат (рис. 3). Этими лабораториями были учтены рекомендации совета экспертов, при этом они исправили свои недочеты, получив в 2024 г. оценки «хорошо» и «оптимально». Это наглядно демонстрирует эффективность прохождения внешнего контроля качества, помогающего лабораториям наладить свою работу и поддерживать ее на стабильно высоком уровне.

Рис. 3. График сравнения результатов лабораторий в раунде «рак молочной железы» в 2023 и 2024 гг., рецепторы эстрогенов.

В других раундах по аналитическому этапу исследования по разным маркерам и локализациям совет экспертов отметил улучшение результатов в тех лабораториях, которые участвовали в этих раундах повторно. Лаборатории, участвовавшие в этих раундах первый раз и получившие оценки, непригодные для клинического использования, продемонстрировали, что наиболее частым недочетом было снижение интенсивности реакции, избыточное окрашивание гематоксилином, которые и приводили к плохому качеству ИГХ-исследования. Всем участникам было рекомендовано отработать протоколы на внутрилабораторных позитивных и негативных контролях.

В 2024 г. состоялось 3 раунда по контролю правильности оценки маркеров не только рака молочной железы, но и микросателлитной нестабильности, в которых приняли участие 35 медицинских организаций:

— контроль правильности оценки маркеров микросателлитной нестабильности (5 участников);

— контроль правильности оценки маркеров рака молочной железы (2 раунда — 30 участников).

В основном раунде по контролю интерпретации иммуногистохимического окрашивания маркеров рака молочной железы и определения молекулярно-генетического подтипа рака молочной железы участвовали 27 медицинских организаций. Участникам были предоставлены для оценки 10 случаев рака молочной железы: сканированные изображения ИГХ-реакций с антителами к рецепторам эстрогенов, прогестеронов, HER2/neu и белку Ki-67. Было предложено их оценить по актуальным для каждого маркера балльным шкалам и на основе полученных данных указать молекулярно-генетический подтип рака молочной железы. Максимальная оценка для каждого случая 10 баллов, оценку «оптимально» за все случаи получала лаборатория, которая набрала 90 баллов и выше, «хорошо» — от 70 до 89 баллов. Оптимальные оценки получили 2 (7%) медицинские организации, «хорошо» — 23 (86%) организации и «плохо» — 2 (7%). Анализ результатов этого раунда показал, что в основном участники раунда правильно оценили ИГХ-реакции, но допустили неправильные формулировки в определении молекулярно-генетического подтипа, не соответствующие требованиям Клинических рекомендаций по раку молочной железы [2]. Стандартное заключение по молекулярно-генетическому подтипу в соответствии с Клиническими рекомендациями является обязательным для предоставления онкологам-химиотерапевтам для назначения адекватной схемы лекарственной терапии. Самым частым недочетом являлось то, что в формулировке молекулярно-генетического подтипа не был указан HER2-статус при люминальных B и нелюминальных HER2-позитивных опухолях, а также при оценке экспрессии HER2 при ИГХ-окрашивания 2+ не было указано, что HER2-статус опухоли «неопределенный» и необходимо исследование методом гибридизации in situ. Кроме того, при оценке гормонального статуса опухоли по Allred Score не указывались баллы.

Раунд по оценке правильности окрашивания маркеров микросателлитной нестабильности (dMMR/MSI) проводился ЦКК ИГХИ впервые и вызвал проблемы у участников. Для оценки и интерпретации ИГХ- реакций медицинским организациям были предоставлены сканированные изображения ИГХ-реакций с антителами к MSH2, MSH6, MLH1 и PMS2 десяти случаев колоректального рака. Необходимо было оценить окрашивание и определить dMMR/MSI-статус опухоли. Оценка окрашивания расценивалась советом экспертов как 0 или 1 балл, а определение статуса — как 0 или 6 баллов. В этом раунде оптимальные оценки получили лишь 40% лабораторий. Были допущены ошибки как в определении наличия/отсутствия окрашивания, так и в определении статуса опухоли. При оценке наличия/отсутствия окрашивания наиболее частой ошибкой было то, что участники неправильно учитывали наличие окрашивания нормальных ядер клеток, что всегда необходимо делать в начале оценки реакции в клетках опухоли. К сожалению, часть лабораторий неправильно оценила dMMR/MSI-статус опухоли при адекватной оценке ИГХ-реакции. Возможно, это связано с недостаточным опытом в использовании Клинических рекомендаций по оценке микросателлитной нестабильности. Потребность определения dMMR/MSI-статуса в опухолях разных локализаций также увеличивается в связи с появлением новых лекарственных препаратов и схем лечения, в связи с этим необходимо повышение компетентности лабораторий в этом исследовании.

Результаты ИГХ-исследования, непригодные для клинического использования, могут быть связаны не только с этапом постановки ИГХ-реакции или неправильной интерпретацией полученных данных. Большое значение имеет адекватное проведение преаналитического этапа исследования, в который входят доставка материала в патолого-анатомическое отделение, фиксация материала, гистологическая проводка, изготовление парафиновых блоков и в последующем срезов для ИГХ-исследования. Несмотря на значительную автоматизацию и стандартизацию этих процессов, этап доставки материала и фиксации является наиболее сложно стандартизируемым, хотя в каждой лаборатории должны быть составлены и выполняться собственные стандартные операционные процедуры (СОП) для каждого этапа исследования.

В 2024 г. ЦКК ИГХИ впервые провел 2 раунда «Контроль качества лабораторной обработки биопсийного (операционного) материала», в которых участвовали 18 медицинских организаций. В других системах контроля качества шаблона проведения такого раунда не существует и совет экспертов разработал его впервые. Участники раунда по своему выбору направили по два блока операционного или биопсийного материала и ЦКК изготовил с этих блоков срезы для окрашивания гематоксилином и эозином и проведения ИГХ-исследования с антителами к ER, цитокератину 7 и MLH1. Также было проведено молекулярно-генетическое исследование сохранности ДНК в предоставленных образцах.

По результатам раундов 10 (56%) участников получили оценки «хорошо» и «оптимально» и 8 (44%) имели хотя бы 1 результат «погранично» или «плохо». При этом лишь 4 (23%) участника продемонстрировали все оптимальные результаты, у 6 (33%) результаты были «оптимально» и «хорошо», у 6 (33%) участников отмечена одна оценка «погранично/плохо» и 2 (11%) участника получили все оценки «погранично/плохо». Результат анализа образцов представлен на рис. 4. У лабораторий, получивших неудовлетворительные результаты, совет экспертов отметил наличие зональной фиксации, щели и «географические» разрывы на срезах, окрашенных гематоксилином и эозином, эффект ретракции материала, плохо прокрашенные и «пустые» ядра клеток. В части образцов с наличием наибольших дефектов фиксации отмечалось и неудовлетворительное качество ИГХ-реакций с антителами к ER и цитокератину 7, хотя использованные антитела недостаточно полноценно отражают сохранность белковых молекул и качество фиксации. Проведение ИГХ-исследования с антителом к MLH1, крайне чувствительным к нарушению преаналитического этапа (рис. 5), показало совпадение дефектов на препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, и низкое качество ИГХ-реакции на этих образцах (снижение интенсивности, зональность окрашивания), что затрудняет интерпретацию ИГХ-исследования.

Рис. 4. Результаты раунда по контролю качества лабораторной обработки биопсийного и операционного материала.

а — статистические результаты анализа образцов; б — образец, окрашенный гематоксилином и эозином; в — образец с иммуногистохимической реакцией с антителами к ER, наблюдаются выраженные дефекты фиксации, «географические» разрывы образца.

Рис. 5. Рак молочной железы.

Иммуногистохимическая реакция с антителами к MLH1. Различие в интенсивности окрашивания разных участков образца.

Анализ качества срезов и протоколов фиксации и гистологической проводки, предоставленных участниками раунда, обнаружил, что нарушения могут быть связаны с неадекватным соотношением объема материала и фиксирующей жидкости, с недостаточным или избыточным временем фиксации, неполной фиксацией формалином и быстрым переносом в спирты (зональная фиксация), с недостаточной пропиткой парафином вследствие неполного обезвоживания материала, избыточным количеством гистологических кассет в процессоре, с несвоевременной сменой жидкостей при фиксации и гистологической проводке. Необходимо отметить, что при использовании в проводке изопропилового спирта отсутствует необходимость применения ксилола, что ведет к уменьшению работы с высокотоксичными реагентами в рутинной практике. Также можно предполагать наличие нарушений условий транспортировки образцов от операционной до патолого-анатомического отделения. Данные нарушения требуют создания и точного соблюдения стандартных операционных процедур от всех членов мультидисциплинарной команды, участвующих в работе, что позволит получать материал оптимального качества, пригодный для всех молекулярно-биологических исследований.

Вместе с визуальной оценкой препаратов, изготовленных из блоков лабораторий, для оценки качества преаналитического этапа был использован в пилотном режиме метод по определению деградации ДНК (фрагментация ДНК) в парафиновом блоке и оценена возможность применения этого объективного метода для оценки качества операционного (биопсийного) материла.

Для выделения ДНК из тканей, фиксированных в формалине и залитых в парафин (FFPE), был использован набор Cobas DNA Sample Preparation (ROCHE, Германия). Уровень фрагментации ДНК определялся на основе соотношения концентраций коротких и длинных фрагментов заданной длины C91 и C156 (C91/C156=индекс деградации) с применением набора QuantumDNA-set (ООО «Евроген», Россия) и амплификации в режиме реального времени на приборе BIORAD CFX96 (BioRAD, Франция). Оценка полученных результатов проводилась в соответствии с критериями, предложенными производителем: ДНК считалась нефрагментированной при индексе деградации менее 1,5, слабо фрагментированной при индексе деградации от1,5 до 3 и существенно фрагментированной при индексе деградации более 3.

Исследование было проведено на 38 образцах парафиновых блоков, полученных от 18 лабораторий-участников раунда. Следует отметить, что не было выявлено образцов без признаков фрагментации ДНК. По итогам оценки уровня фрагментации ДНК в образцах участники были разделены на три группы: первая группа — участники, у которых все образцы были отнесены к категории умеренно фрагментированной ДНК (8/18); вторая группа — участники, у которых один или несколько образцов попали в категорию умеренно фрагментированной ДНК, а также были образцы с сильной фрагментацией (6/18); третья группа — участники, у которых один или все образцы были отнесены к категории сильно фрагментированной ДНК (5/18), (рис. 6).

Рис. 6. График, демонстрирующий степень деградации ДНК в исследованных образцах лабораторий — участников.

Фрагментация ДНК, выделенной из парафиновых блоков, является распространенной проблемой, которая может значительно затруднить молекулярно-генетические исследования. Одной из основных причин фрагментации является некроз тканей, при котором происходит гибель клеток и активация ферментов, таких как нуклеазы, что приводит к деградации ДНК. В тканях с признаками некроза даже после фиксации и обработки ДНК часто оказывается сильно фрагментированной. Кроме того, фрагментация может быть вызвана патоморфозом, который бывает лучевым и лекарственным. Лучевой патоморфоз возникает вследствие воздействия ионизирующего излучения, вызывающего разрывы цепей ДНК, а лекарственный патоморфоз связан с применением химиотерапевтических препаратов, таких как алкилирующие агенты, которые также повреждают ДНК. Важным фактором, влияющим на сохранность ДНК, является процесс фиксации ткани. Ошибки фиксации: длительная фиксация в формалине приводит к образованию сшивок между белками и ДНК, что затрудняет ее экстракцию и способствует фрагментации, в то же время недостаточная фиксация, напротив, может вызвать аутолиз клеток и деградацию ДНК, а использование некачественного или старого фиксатора также ухудшает сохранность генетического материала. Таким образом, использование данного метода оценки качества биологического материала должно проводиться с учетом данных гистологического исследования.

Дополнительной причиной фрагментации может стать также длительное хранение парафиновых блоков, особенно в неподходящих условиях (высокая влажность, перепады температуры).

При анализе результатов по фрагментации ДНК было проведено сравнение данных по фрагментации с морфологической картиной, которая оценивалась на препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином. В образцах с высокими показателями деградации ДНК на гистологических срезах большие области некроза отсутствовали. Поэтому этот объективный метод может служить еще одним дополнительным показателем качества преаналитического этапа ИГХ-исследования.

Результаты, полученные при оценке сохранности ДНК, совпали с оценками «погранично» и «плохо», выставленными советом экспертов по срезам, окрашенным гематоксилином и эозином, и срезами с ИГХ-реакциями.

Совет экспертов выявил совпадение результатов, оцененных как непригодные для клинического использования в лабораториях, принимавших участие во всех вариантах раундов по контролю всех этапов ИГХ-исследования для маркеров рака молочной железы. Таким образом, отмечены нарушение фиксации и проводки материала, недостаточная валидация протоколов ИГХ-исследований, работа без использования внутрилабораторных позитивных и негативных контролей, возможные нарушения в регламентном обслуживании оборудования, отсутствие системы внутрилабораторного контроля в этих медицинских организациях на этапах от получения биологического материала до проведения ИГХ-исследования. Все эти недостатки могут приводить к получению неверного заключения для выбора адекватной персонифицированной схемы терапии.

Сравнительный анализ результатов участия медицинских организаций, осуществляющих прижизненную диагностику, еще раз убедительно показал эффективность участия организаций во внешнем контроле качества ИГХ-исследований. Организации, которые применили в повседневной работе индивидуальные рекомендации совета экспертов, значительно улучшили свои результаты по сравнению с прошлым годом. Наибольшее количество недочетов совет экспертов отметил в лабораториях, которые впервые участвовали в раундах внешнего контроля качества.

Внешний контроль качества — это одновременно и вынужденная повинность, и насущная необходимость для лабораторий. С одной стороны, он подтверждает высокий профессионализм лаборатории и способствует улучшению качества диагностики, с другой — требует дополнительных ресурсов и усилий (оплата участия, некоторое увеличение объема работы врачей и медицинских технологов). Вместе с тем участие во внешнем контроле качества позволяет медицинским организациям подтвердить свой высокий статус и укрепить свою репутацию. Регулярное участие во внешнем контроле качества, создание и постоянное функционирование системы внутреннего контроля качества, включая наличие ответственного за эту работу, проведение регулярных обучающих мероприятий, повышающих компетенции сотрудников в онкологической диагностике, — это инвестиция в качество работы лаборатории, которая окупается доверием врачей и пациентов и спасенными жизнями. Все эти мероприятия позволяют повысить и постоянно поддерживать на высоком уровне качество диагностических молекулярно-биологических исследований в Российской Федерации для успешного выполнения программы по борьбе с онкологическими заболеваниями.

Заключение

Результаты проведенных раундов контроля качества ИГХ-исследований, организованных ИГХИ РМАНПО в 2024 г., не только демонстрируют значительный прогресс в стандартизации лабораторных исследований, но и выявляют ключевые проблемы, требующие дальнейшей оптимизации. В рамках проведенного анализа были рассмотрены типичные недостатки, встречающиеся на всех этапах ИГХ-исследования, что позволяет комплексно оценить качество выполнения диагностики в медицинских организациях.

Одним из важнейших достижений стало внедрение нового подхода к контролю качества лабораторной обработки биопсийного и операционного материала, что особенно актуально в условиях широкого внедрения молекулярно-генетических методов диагностики. Впервые проведенная оценка качества преаналитического этапа, включая анализ деградации ДНК, позволила выявить основные ошибки в фиксации и гистологической обработке материала, которые могут оказывать влияние на точность проводимой диагностики.

Анализ раундов контроля аналитического этапа показал, что основные трудности связаны с недостаточной валидацией протоколов, использованием несовместимых антител и систем детекции, а также с проблемами окрашивания препаратов. В то же время результаты ряда лабораторий, принимавших участие в повторных раундах, свидетельствуют о высокой эффективности внедрения индивидуальных рекомендаций совета экспертов, что подтверждается улучшением качества диагностики в сравнении с предыдущими годами.

Контроль постаналитического этапа выявил наиболее частые ошибки в интерпретации иммуногистохимических реакций особенно при определении HER2-статуса и молекулярно-генетических подтипов рака молочной железы. Неправильная классификация опухолей может приводить к ошибочному назначению терапии, что подчеркивает важность обучения специалистов и стандартизации критериев оценки.

Таким образом, внешний контроль качества ИГХ-исследований является неотъемлемым элементом системы лабораторной диагностики, позволяющим медицинским организациям повышать уровень диагностики и, следовательно, эффективность персонализированного лечения онкологических заболеваний. Регулярное участие в программах контроля, строгое соблюдение внутрилабораторных стандартов и постоянное обучение специалистов являются ключевыми факторами обеспечения высокой точности и воспроизводимости ИГХ-исследований.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.