Согласно современным представлениям о патогенезе миастении [1—3], ведущим патофизиологическим фактором, лежащим в основе развития ее клинических проявлений, является аутоиммунная агрессия по отношению к определенным молекулярным структурам нервно-мышечного синапса и самой скелетной мышцы.

Как показали многочисленные исследования [4], наиболее часто поражаемой при миастении мишенью являются никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (АХР) постсинаптической мембраны, повышенная концентрация антител к которым встречается у 80—85% больных.

Патофизиологическая роль антител к АХР подтверждена в экспериментах на животных [5, 6], в которых была показана возможность развития миастенического процесса при иммунизации препаратами АХР или введении сыворотки от больных. Обусловленные антителами аутоиммунные механизмы приводят к нарушению нервно-мышечной передачи за счет уменьшения количества функционирующих АХР, что создает значительные трудности для достижения ацетилхолином своей цели, уменьшая вероятность взаимодействия медиатора с рецептором. Также фиксация антител на постсинаптической мембране ведет к разрушению синаптических складок и структурной модификации синапса. Таким образом, происходит не только уменьшение плотности АХР, но и изменение геометрии синаптической щели [7].

Наличие высокой концентрации антител к АХР у подавляющего большинства больных с генерализованной миастенией позволило использовать этот показатель как важный лабораторный критерий диагностического процесса. Вместе с тем проводились исследования связи уровня этих антител и различных клинически важных показателей, в частности тяжести течения заболевания. Ряд исследователей утверждали, что тяжесть клинических проявлений у некоторых больных коррелирует с уровнем антител к АХР сыворотки крови. В частности, C. Krarup [8] обнаружил достоверную корреляцию между титром антител к АХР и тяжестью миастении. A. Evoli и соавт. [9] также выявили подобную зависимость, при этом наиболее выраженную корреляцию тяжести заболевания и уровня антител к АХР отмечали у пациентов с тимомой.

Однако в дальнейшем эта точка зрения была опровергнута. Результаты многих работ указывали на отсутствие какой-либо зависимости между содержанием аутоантител к АХР в сыворотке и выраженностью клинической симптоматики, а также полом, возрастом и длительностью заболевания.

Таким образом, повышение концентрации антител к АХР — относительно надежный диагностический критерий. Однако в связи с отсутствием корреляции с какими-либо клинически важными параметрами ценность данного показателя ограничивается [10].

В настоящее время наряду с традиционными способами лабораторной диагностики активно развиваются ее интегральные методы. Эти подходы предполагают не механическое накопление показателей, а исследование их взаимных влияний, сочетаний, связи с клиническими симптомами и корреляции с другими показателями. Одним из способов исследования нативных биологических жидкостей, успешно зарекомендовавшим себя в клинике, является лазерная корреляционная спектроскопия (ЛКС). Суть метода заключается в определении спектральных характеристик квазиупруго рассеянного (рассматривается рэлеевское рассеяние) изучаемой системой света по спектру флюктуаций интенсивности регистрируемого излучения. Зарегистрированные спектры подвергаются математической обработке методом регуляции при помощи специальной процедуры, входящей в комплект программного обеспечения спектрометра [11]. Этот математический аппарат решения обратной спектральной задачи близок к тому, который с успехом применяется в современной рентгеновской и магнитно-резонансной томографии. Ранее метод ЛКС был успешно применен для оценки тяжести заболевания и эффективности лечения при бронхиальной астме [12], сахарном диабете [13, 14], гематологических [15] и других заболеваниях [16].

Нами было показано, что у больных с легкой формой миастении возрастает вклад в светорассеяние иммуноглобулиновой фракции, тогда как при тяжелом течении преобладают аутоиммунные компоненты [17]. Однако сравнительно небольшая из-за редкости данного инвалидизирующего заболевания выборка послужила предпосылкой для продолжения исследований. Кроме того, представляло интерес сопоставление данных традиционных радиоиммунологических анализов с результатами ЛКС-исследований.

Цель настоящей работы — сопоставление информативности традиционного подхода (радиоиммунологическое определение концентрации антител к АХР) с оценкой выявляемых с помощью ЛКС при миастении сдвигов метаболизма.

Обследовали 77 пациентов с миастенией в возрасте от 12 до 80 лет (средний — 41,7±17,5 года), из них 23 (29,9%) мужчины в возрасте от 17 до 80 лет (средний — 51,6±16,4 года) и 54 (70,1%) женщины в возрасте от 12 до 76 лет (средний — 37,5±16,1 года). У 8 (10,4%) пациентов была выявлена тимома.

Диагноз миастении устанавливали на основании результатов клинического и электромиографического исследований, а также данных фармакологического теста с введением прозерина, диагноз тимомы — компьютерной или магнитно-резонансной томографии переднего средостения.

Тяжесть клинических проявлений миастении оценивали согласно Международной клинической классификации, где 1 — слабость только окулярных мышц, во всех других мышцах сила нормальная, 2А — 4В — нарастающая выраженность слабости туловищной и бульбарной мускулатуры. А — отсутствие бульбарных нарушений, В — их наличие. Распределение пациентов по тяжести клинических проявлений миастении согласно MGFA [18] показало, что слабость только окулярных мышц была выявлена у 4 (5,2%) пациентов; 2А — у 17 (22,1%); 2 В — у 16 (20,7%); 3А — у 12 (15,6%); 3В — у 24 (31,2%) и 4В — у 4 (5,2%).

Концентрацию антител к АХР определяли радиоиммунологическим методом с помощью коммерческой тест-системы («DLD Diagnostika GMBH», Германия). Образцы сыворотки хранили при –20 °С. Перед анализом их размораживали, отбирали аликвоты по 5 мкл и помещали в пробирки. К пробам добавляли по 100 мкл ¹²⁵I-рецептора ацетилхолина (удельная активность — 342 Ci/ммоль), 50 мкл антител к IgG человека, перемешивали и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляли по 1 мл промывочного буфера, центрифугировали при 3000 g в течение 20 мин, надосадочную жидкость удаляли декантацией. Полученный осадок ресуспендировали и повторяли процедуру промывки. Определяли радиоактивность проб в течение 1 мин (счетчик радиоактивности «Clinigamma», LKB, Швеция) и вычисляли концентрацию антител, выражаемую в нмоль/л по формуле с использованием фактора, учитывающего дату изготовления набора и удельную активность метки, радиоактивность пробы и негативного контроля:

С=(cpm_i—cpm_n)·D·F,

где С — концентрация антител, нмоль/л; D — фактор, учитывающий дату изготовления набора; F — фактор, учитывающий удельную активность метки; cpm_i — радиоактивность пробы, имп/мин; cpm_n — радиоактивность негативного контроля, имп/мин.

Повышенным титром антител к АХР являлось значение, превышающее 0,40 нмоль/л.

Субфракционный состав биологических жидкостей регистрировали, используя лазерный корреляционный спектрометр ЛКС-03-«ИНТОКС»^​1​᠎.

В основе метода лежит изменение спектральных характеристик монохроматического когерентного излучения гелий-неонового лазера в результате светорассеяния при прохождении через дисперсную систему (плазма, сыворотка крови, моча). Образец сыворотки в объеме 0,2 мл заливали в кювету ЛК-спектрометра. Измерение проводили в частотном диапазоне 16 кГц в количестве 2000 накоплений. Регуляризацию спектра осуществляли с использованием нелинейной шкалы (программы Spectrometer, Blood, входящие в программное обеспечение спектрометра). Результатом расчета при таком способе обработки является гистограмма, по оси ординат которой отложен процентный вклад частиц в светорассеяние, по оси абсцисс — их размер (радиус) в нанометрах.

В работе использовали различные способы представления данных, полученных методом ЛКС. Сформированные управляющей программой спектрометра подробные лазерные корреляционные гистограммы (ЛК-гистограммы) состоят из 32 столбцов, количество которых отражает число учитываемых субфракций молекул при обработке (минимизация) спектра [11, 19]. Менее подробный, но более удобный способ представления данных связан с использованием зон, в которые входят частицы определенного размера. Так, весь диапазон спектра для сыворотки крови делится на пять дискретных зон: I — 0—10; II — 11—30; III — 31—70; IV — 71—150; V — 150 нм и выше. Согласно полученной на различных моделях патологий априорной информации, в зону частиц размером 0—10 нм попадают преимущественно низкомолекулярные мономерные альбулярные белки и глико-липидные свободные комплексы; 11—30 нм — глобулярные белки и низкомолекулярные липопротеиновые комплексы; 31—70 нм — более высокомолекулярные липопротеиновые комплексы, дезокси- и рибонуклеопротеиновые частицы, самые низкомолекулярные иммунные комплексы; 71—150 нм — преимущественно конститутивные иммунные комплексы среднего размера; если в организме индуцируется иммунопоэз с образованием высокомолекулярных комплексов (чаще всего сопутствуют процессам аллергизации и аутоиммунной сенсибилизации), то появляются частицы размером свыше 150 нм.

Для определения размера и локализации антител к АХР на ЛК-гистограмме были проведены два эксперимента: а) сопоставление гистограмм негативной и позитивной по антителам к АХР сывороток; б) исследование связывания компонентов позитивной по антителам к АХР сыворотки с солюбилизированным АХР из культивированных клеток человека («DLD Diagnostika GMBH», Германия).

Обработку данных проводили с использованием пакета Statistica 7.0 по алгоритмам непараметрической статистики — критерий Манна—Уитни для независимых переменных.

Из приведенных на рис. 1 данных видно, что ЛК-гистограммы двух сывороток существенно различаются. Позитивная по антителам к АХР сыворотка отличается резким повышением вклада в светорассеяние частиц в диапазоне 4,6—6,2 нм (радиус), что близко к зоне иммуноглобулинов.

Связывание компонентов сыворотки с солюбилизированным АХР подтвердило, что этот пик обусловлен именно повышенным содержанием антител к нему (рис. 2). После 2-часовой инкубации смеси сыворотки с рецептором характер распределения частиц существенно изменился: в результате произошедшего связывания образовались две зоны повышенного светорассеяния — с радиусом частиц 8—20 и 166—300 нм. Первая из них, видимо, обусловлена появлением простых комплексов антиген—антитело, а вторая — крупных иммунных комплексов. Видно также, что инкубация сыворотки с физраствором не приводит к существенным изменениям субфракционного состава.

Корреляционной связи между содержанием антител к АХР и вкладом в светорассеяние соответствующей фракции выявить не удалось. Это ожидаемый результат, так как иммуноглобулины несущественно различаются по размерам и в исследуемой зоне возможно наличие других антител, вносящих вклад в светорассеяние.

Гораздо больший интерес представляла попытка выявить связь между тяжестью заболевания и характером распределения субфракционных компонентов сыворотки крови. Это тем более важно, что для миастении не существует корреляции между содержанием антител к АХР и выраженностью процесса. Последний факт подтвердили и наши опыты (рис. 3). Видно, что у больных с 1, 2 и 3-й степенью тяжести заболевания содержание антител к АХР практически не различается. В то же время полученные нами ранее результаты [17] позволяют надеяться на выявление особенностей спектров с помощью метода ЛКС.

В результате анализа гистограмм были выделены три информативные зоны, включающие в себя 75—84% общего светорассеяния: 6—15, 27—67 и 127—223 нм. На рис. 4 представлены усредненные вклады в светорассеяние в этих зонах у больных с различной тяжестью заболевания. У больных без нарушения витальных функций с нарастанием тяжести наблюдалось достоверное увеличение вклада в светорассеяние частиц первой зоны при снижении этого показателя в третьей зоне (см. рис. 4, а). Таким образом, открывается перспектива для динамической оценки эффективности терапии. У пациентов с нарушениями витальных функций картина резко отличалась, что является отражением существенных изменений в функционировании организма и свидетельствует об информативности примененного подхода (см. рис. 4, б). Ввиду малочисленности группы пациентов с 4-й степенью тяжести заболевания, данные о них не приведены на рисунках, однако у этих больных было зафиксировано появление сверхкрупных (300—400 нм) частиц, что согласуется с ранее опубликованными результатами [17].

Существенные различия, достигающие уровня статистической значимости в зонах 6 и 20 нм, обнаруживались в спектрах сыворотки крови больных миастенией одинаковой степени тяжести с тимомой и без опухоли (рис. 5). Преобладание крупных частиц у пациентов с тимомой, по-видимому, обусловлено пролиферативными процессами в организме.

Увеличение титра антител к АХР наряду с клиническими проявлениями болезни положительной реакцией на введение антихолинэстеразных препаратов и электромиографическими феноменами, отражающими нарушения нервно-мышечной передачи, являются классическими критериями диагностики аутоиммунной миастении. Вместе с тем выделена отдельная группа больных (около 10—15%), у которых значения титра антител не превышали величины этого показателя у здоровых — серонегативная миастения [20]. Антитела к АХР, как правило, не выявляются у больных с миастеническим синдромом Ламберта—Итона и конгенитальными миастеническими синдромами [21, 22]. С другой стороны, повышение концентрации антител к АХР отмечали [23] при циррозе печени, синдроме Хашимото и ревматоидном артрите. Учитывая эти факты, можно объяснить как повышенное содержание антител к АХР у подавляющего большинства обследованных нами пациентов, так и отсутствие корреляции между концентрацией антител и тяжестью заболевания. Видимо, стандартный набор клинических, электрофизиологических и фармакологических тестов для миастении и миастенических синдромов должен быть дополнен анализом, который позволил бы выявлять биохимические корреляты тяжести процесса.

Из приведенных выше данных видно, что метод ЛКС позволяет оценивать тяжесть процесса. Выявленное нами повышение содержания компонентов зоны иммуноглобулинов, возможно, имеет регуляторное значение. В клинике иммуноглобулины, подавляющие в высоких дозах иммунные процессы, применяют для лечения миастении как альтернативу плазмаферезу. Можно предположить, что резкое повышение содержания иммуноглобулиновой фракции у больных с легкими стадиями заболевания является регуляторной реакцией, обеспечивающей снижение выработки аутоантител. В то же время наблюдаемое у пациентов с тяжелым течением миастении уменьшение вклада этой фракции с одновременным нарастанием количества иммунных комплексов свидетельствует о недостаточности регуляторных механизмов и, следовательно, дальнейшем развитии патологии. Полученные данные дают основание полагать, что метод ЛКС может дополнить существующий арсенал диагностических средств, применяемых для оценки тяжести заболевания и эффективности лечения.

Конфликт интересов отсутствует.