Влияние цитофлавина на окислительный стресс и активность Na/K-АТФазы эритроцитов после черепно-мозговой травмы

Авторы:
  • А. В. Дерюгина
    ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского», Нижний Новгород, Россия
  • А. В. Шумилова
    ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского», Нижний Новгород, Россия
Журнал: Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2017;117(11): 51-55
Просмотрено: 1991 Скачано: 911

Актуальность исследования патофизиологических механизмов черепно-мозговой травмы (ЧМТ) и путей ее коррекции обусловлена значительной смертностью, высоким уровнем временной нетрудоспособности и инвалидизацией пострадавших, несмотря на большое количество препаратов, применяемых в терапии пациентов с тяжелым травматическим повреждением головного мозга [1—4].

Травма нарушает деятельность мозга как за счет первичного (биомеханические факторы), так и вследствие последующего вторичного повреждения (активация патофизиологических каскадов). Вторичное повреждение охватывает множество сложных биохимических и клеточных процессов, усугубляющих тяжесть первичного повреждения [5]. Наиболее ранним процессом, запускающим каскад вторичных реакций, является активация свободнорадикальных процессов и развитие оксидантного стресса [6]. Следствием инициации вторичного повреждения, в конечном итоге, являются необратимое ишемическое поражение клеток, расположенных в непосредственной близости от очага первичного поражения, и вовлечение в патологический процесс интактных клеток головного мозга [7].

Эритроциты, транспортирующие кислород к тканям головного мозга, в зависимости от функциональной активности оказывают существенное влияние на степень проявлений тканевой гипоксии. В обеспечении оптимального функционирования эритроцитов существенную роль играет состояние эритроцитарной мембраны, модификация которой связана с процессами перекисного окисления липидов, которые носят при ЧМТ полиорганный характер. Изменение липидно-белковых взаимодействий в мембране эритроцитов определяет реализацию специфических мембран-ассоциированных процессов, в том числе и транспорт ионов. В поддержании ионного гомеостаза основную роль играет натрий-калиевая аденозинтрифосфатаза (Nа/К-АТФаза) [8]. Соответственно, изменение активности Nа/К-АТФазы, являющейся липидзависимым ферментом и отражающей компенсаторно-приспособительную реакцию клеток [9], может в значительной степени опосредовать повреждение и нарушение функциональной активности эритроцитов при ЧМТ. Следовательно, возникает необходимость поиска путей коррекции окислительного метаболизма в борьбе с гипоксией головного мозга.

Одним из препаратов, стимулирующих энергообразование, активирующих метаболические процессы и ингибирующих оксидантный стресс, является цитофлавин (ООО «НТФФ «ПОЛИСАН»», Россия). Этот комплексный цитопротектор состоит из двух метаболитов (янтарная кислота, рибоксин) и двух коферментов витаминов (рибофлавин — витамин В2, никотинамид — витамин РР). Механизм действия препарата обусловлен его антигипоксическим и антиоксидантным действием. Он оказывает положительный эффект на процессы энергообразования в клетке, уменьшая продукцию свободных радикалов и восстанавливая активность ферментов антиоксидантной защиты, снижая выброс нейротрансмиттеров в условиях ишемии [10].

Цель работы — оценка эффективности цитофлавина в коррекции окислительного стресса и активности Nа/К-АТФазы эритроцитов крыс после ЧМТ.

Материал и методы

Исследование было выполнено на 30 белых нелинейных крысах-самках массой 180—200 г, разделенных на две равновеликие группы. Содержание животных и проводимые с ними манипуляции осуществляли в соответствии с нормативными документами, представленными в руководстве «Guide for care and use of laboratory animals» и требованиями приказа Министерства здравоохранения РФ от 01.04.16 № 199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики».

Травму наносили одним ударом на теменно-затылочную область головного мозга свободно падающим грузом массой 100 г с высоты 80 см [11]. В 1-й группе крысам после ЧМТ в течение 10 сут ежедневно внутрибрюшинно вводили цитофлавин (раствор для внутривенного введения) в дозе 0,2 мл/кг массы животного, во 2-й (контроль) — физиологический раствор в том же объеме. Уровень физиологической нормы определяли у интактных животных. Препарат начинали вводить через 1 ч после нанесения животным ЧМТ. Забор крови в группах производили из подъязычной вены в количестве 2,0 мл (интактные животные) и на 1, 3, 7 и 12-е сутки после ЧМТ.

Проанализировали свободнорадикальное окисление и активность антиоксидантной системы плазмы крови биохемилюминесцентным методом [12] на биохемилюминометре Lum-5773. Изучали следующие показатели хемилюминограммы: суммарную активность свободнорадикальных реакций (I max) и выраженность общей антиоксидантной активности (tg). Интенсивность свободнорадикального окисления липидов оценивали методом спектрофотометрии [2] на спектрофотометре СФ 2000 (Россия) по содержанию молекулярных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) — диеновых (ДК) и триеновых (ТК) конъюгатов, а также оснований Шиффа (ОШ). Оценивалась каждая фаза против соответствующего контроля при длинах волн 220 нм (поглощение изолированных двойных связей), 232 нм (поглощение ДК), 278 нм (поглощение ТК), 400 нм (поглощение ОШ). Содержание Д.К., ТК и ОШ оценивали по относительным величинам Е232/Е220, Е278/Е220, Е400/Е220 и выражали в относительных единицах (отн. ед.). Концентрацию малонового диальдегида (МДА) определяли по образованию окрашенного триметинового комплекса с максимумом поглощения при 530 нм при реакции с тиобарбитуровой кислотой. Для расчета концентрации МДА использовали коэффициент молярной экстинции (E=1,56∙10–5М–1см–1) [13, 14]. Активность каталазы анализировали по снижению пероксида водорода (H2O2) в пробе. Измерения проводили спектрофотометрически сразу после внесения H2O2 в кювету с пробой и через 20 с после внесения при длине волны 240 нм [15]. Активность Na/K-АТФазы эритроцитов оценивали по приросту неорганического фосфата, который также определяли спектрофотометрически [16].

Полученные данные были обработаны с помощью пакетов прикладных программ BioStat и Microsoft Excel с использованием методов одномерной статистики. Результаты представлены в виде М±m, где М — среднее арифметическое, m — стандартная ошибка среднего. Достоверность различий определяли по t-критерию Стьюдента. Различия считали достоверными при уровне значимости p<0,05.

Результаты и обсуждение

Острый период ЧМТ сопровождался активацией как свободнорадикальных процессов, так и ПОЛ в обеих группах животных (табл. 1).

Таблица 1. Динамика показателей свободнорадикальных процессов и ПОЛ плазмы крови крыс в посттравматическом периоде, М±m Примечание. * — статистически значимые различия со значениями до воздействия на уровне р<0,05; ** — статистически значимые различия относительно 2-й группы на уровне р<0,05.

При этом скорость накопления продуктов окисления была выше в контрольной группе. Ранняя энергокорригирующая терапия цитофлавином способствовала снижению уровня максимальной интенсивности хемилюминесценции (I max) в плазме крови с 1-х суток исследования у крыс 1-й группы относительно контрольной на 20% (р<0,05). К 7-м суткам посттравматического периода в 1-й группе (с цитофлавином) было зарегистрировано минимальное значение хемилюминесцентного свечения и восстановление этого показателя до уровня физиологической нормы (1,33±0,21 В относительно 1,64±0,14 В, р<0,05), тогда как у животных 2-й группы (контроль) этот показатель оставался повышенным относительно нормы до конца эксперимента (р<0,05). Использование цитофлавина определило рост общей антиоксидантной активности плазмы (tg) относительно значений 2-й группы животных на протяжении всего исследования (р<0,05) с максимальным увеличением показателя относительно физиологической нормы на 66% к первым суткам исследования (р<0,05).

Таким образом, направленность активности свободнорадикальных процессов и антиоксидантной системы защиты у животных сравниваемых групп убедительно свидетельствует об антиоксидантном действии цитофлавина.

Положительные сдвиги в состоянии свободнорадикальных процессов плазмы крови крыс 1-й группы коррелировали с уменьшением продуктов липопероксидации. Так, к 7-м суткам исследования наблюдалось восстановление содержания ДК в плазме крови крыс 1-й группы до значений интактных животных, в то время как во 2-й группе содержание этого липопероксида превышало значение нормы в 2 раза (р<0,05). Кроме того, у животных, которые получали цитофлавин, отмечалось сдерживание образования ТК и ОШ по сравнению с контрольной группой. В 1-й группе рост ТК был зафиксирован только к 3-м суткам посттравматического периода на 36% (р<0,05) относительно значений интактных животных, тогда как в контрольной группе ТК сохранялся повышенным на всех сроках наблюдения (р<0,05) с максимальным увеличением к 3-м суткам более чем в 2 раза (р<0,05) относительно нормы. ОШ, повышенные в контрольной группе относительно значений физиологической нормы на 3-и и 7-е сутки после ЧМТ на 77 и 17% соответственно (р<0,05), в 1-й группе не превышали уровня интактных животных.

Полученные результаты активности про- и антиоксидантных процессов в плазме крови согласуются с исследуемыми показателями ПОЛ и антиоксидантной системы в эритроцитах у крыс в посттравматический период. Концентрация МДА в эритроцитах животных при действии цитофлавина к 7-м суткам после ЧМТ восстанавливалась до значений интактных животных, тогда как в группе контроля этот показатель сохранялся повышенным на протяжении всего исследования (р<0,05). Кроме того, активность каталазы при действии цитофлавина уже с 3-х суток возрастала на 38% (р<0,05) относительно контрольной группы и продолжала увеличиваться к 12-м суткам посттравматического периода, вероятно, определяя отмеченное снижение оксидантной активности (табл. 2).

Таблица 2. Динамика показателей про- и антиоксидантной систем и активности Na/K-АТФазы эритроцитов крови крыс в посттравматическом периоде, М ±m Примечание. * — статистически значимые различия со значениями до воздействия на уровне р<0,05; ** — статистически значимые различия относительно контроля на уровне р<0,05.
Положительная динамика работы антиоксидантной системы защиты эритроцитов в 1-й группе сопровождалась увеличением активности Na/K-АТФазы. Действие цитофлавина привело к росту активности Na/K-АТФазы на 3-и сутки исследования в 2 раза (р<0,05) по сравнению с активностью фермента в контрольной группе, где она была снижена на 40% (р<0,05) относительно значений интактных животных. Такая динамика показателя сохранялась на всех этапах посттравматического периода.

Полученные результаты свидетельствуют о снижении окислительного стресса при действии цитофлавина к 7-м суткам посттравматического периода. Известно, что янтарная кислота, входящая в состав цитофлавина, ускоряет оборот дикарбоновой части цикла трикарбоновых кислот (сукцинат — фумарат — малат) и снижает концентрацию лактата, увеличивает потребление кислорода тканями и улучшает тканевое дыхание за счет усиления транспорта электронов в митохондриях, воссоздания протонного градиента на их мембранах и тем самым повышает антиоксидантную систему клеток [10, 17]. Снижение окислительного метаболизма организма при действии цитофлавина отражается на состоянии эритрона, вызывая, вероятно, увеличение количества эритроцитов с повышенным антиоксидантным потенциалом. Реорганизация липидной фазы в ходе ПОЛ определяет изменение активности Na/K-АТФазы эритроцитов. Учитывая, что функции Na/K-АТФазы заключаются в поддержании градиентов Na+ и К+, а в результате градиента Na+ происходит сопряженный с ним перенос глюкозы, аминокислот, фосфора и нейротрансмиттеров [18], можно предположить, что при действии цитофлавина на организм животных в эритроците происходит мобилизация энергетических ресурсов. В свою очередь возможное увеличение метаболических процессов способствует росту внутриклеточных органических фосфатов — АТФ и 2,3-ДФГ [8]. При этом 2,3-ДФГ служит важным аллостерическим регулятором связывания кислорода с гемоглобином [19], и увеличение продукции 2,3-ДФГ в эритроцитах облегчает высвобождение кислорода в тканях, поддерживая рО2 в крови и тканях на достаточном уровне. АТФ, активируя протеинкиназы и фосфорилирование белков цитоскелета, увеличивает деформируемость мембран [20]. По-видимому, при воздействии цитофлавина на животных, перенесших ЧМТ, в эритроцитах развиваются процессы, оптимизирующие их реологические свойства, что необходимо для адекватной микро- и макроциркуляции крови.

Таким образом, использование цитофлавина определило снижение окислительного стресса у животных, перенесших ЧМТ, что сочеталось с нормализацией про- и антиоксидантного состояния эритроцитов. Уменьшение дисбаланса окислительных процессов в эритроцитах при действии цитофлавина увеличивало активность Na/K-АТФазы, что, вероятно, обеспечивало повышение функциональной активности эритроцитов, направленное на поддержание их кислородтранспортной функции после ЧМТ.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Список литературы:

  1. Волкова А.В., Давыденко Т.Е., Гуревич К.Я. Внутрисосудистое лазерное облучение крови в комплексном лечении энцефалопатии у больных, перенесших боевую черепно-мозговую травму. Регионарное кровообращение и микроциркуляция. 2007;2:30-34.
  2. Волчегорский И.А., Налимов А.Г., Яровинский Б.Г., Лифшиц Р.И. Сопоставление различных подходов к определению продуктов перекисного окисления липидов в гептан-изопропанольных экстрактах крови. Вопросы медицинской химии. 1989;35(1):127-131.
  3. Смычек В.Б., Пономарева Е.Н. Черепно-мозговая травма: медицинская и социальная проблема. Медицинские новости. 2011;12:6-8.
  4. Шах Б.Н., Теплов В.М., Смирнов Д.М., Комедев С.С. Региональная вазоактивная терапия пострадавших с тяжелыми черепно-мозговыми травмами. Вестник интенсивной терапии. 2012;4:19-22.
  5. Беляевский А.Д., Лебедева Е.А., Белоусова М.Е. Цитокины, оксидантный стресс и антиоксидантная защита при изолированной и сочетанной черепно-мозговой травме. Общая реаниматология. 2009;5(6):36-39. https://doi.org/10.15360/1813-9779-2009-6-36
  6. Кармен Н.Б., Мороз В.В., Маевский Е.И. Механизмы вторичного повреждения нейронов при тяжелой черепно-мозговой травме (часть 1). Общая реаниматология. 2011;7(4):56-59. https://doi.org/10.15360/1813-9779-2011-4-56
  7. Пурас Ю.В., Талыпов А.Э., Петриков С.С., Крылов В.В. Факторы вторичного ишемического повреждения головного мозга при черепно-мозговой травме. Часть 1. Внутричерепные и внечерепные факторы вторичного повреждения мозга. Неотложная медицинская помощь. 2012;2:59-65.
  8. Маслова М.Н., Кислякова Л.П., Казенков А.М., Кисляков Ю.Я., Катюхин Л.Н., Новожилов А.В., Скверчинская Е.А., Тавровская Т.В. Изменение параметров гозообмена и функционально-биохимические свойства эритроцитов в динамике экспериментальной анемии у крыс. Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 2009;45(5):498-503.
  9. Крылов В.Н., Дерюгина А.В., Константинова А.И. Электрофоретическая подвижность и активность Nа,К-АТФазы эритроцитов у крыс при стрессе. Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2014;100(11):1297-1302.
  10. Антипенко Е.А., Дерюгина А.В., Густов А.В. Влияние неспецифической цитопротекторной терапии на стрессустойчивость и компенсаторные возможности пациентов с хронической ишемией головного мозга. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2015;115(12-1):74-78.https://doi.org/10.17116/jnevro201511511121-74
  11. Цымбалюк В.И., Кочин О.В. Экспериментальное моделирование черепно-мозговой травмы. Украинский нейрохирургический журнал. 2008;2:10-12.
  12. Кузьмина Е.И., Нелюбин А.С., Щенникова М.К. Применение индуцированной хемилюминесценции для оценки свободнорадикальных реакций в биологических субстратах. Межвузовский сборник биохимии и биофизики микроорганизмов. 1983;179-183.
  13. Лившиц В.М., Седельникова В.И. Медицинский лабораторно-аналитический справочник. М.: Триада Х; 2007.
  14. Харамоненко С.С., Ракитянская А.А. Электрофорез клеток крови в норме и при патологии. Минск: Беларусь; 1974.
  15. Beers RF, Sizer JW. A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase. Journal of Biological Chemistry. 1952;195:133-140.
  16. Казеннов А.М., Маслова М.Н., Шалабодов А.Д. Исследование активности Na,К-АТФазы в эритроцитах млекопитающих. Биохимия. 1984;49(7):1089-1094.
  17. Черний В.И., Андронова И.А., Городник Г.А., Назаренко К.В., Черний Т.В. Роль и место препарата Цитофлавин в комплексном лечении тяжелой черепно-мозговой травмы в остром периоде. Журнал неврологии им. Б.М. Маньковського. 2015;3(3):21-33.
  18. Blanco G, Mercer RW. Isozymes of the Na,K-ATPase: heterogeneity in structure, diversity in function. The American journal of physiology. 1998;275(5):633-650.
  19. Jensen FB. Red blood cell pH, the Bohr effect and other oxygenation-linked phenomena in blood O2 and CO2 transport. Acta Physiologica Scandinavica. 2004;182:215-227. https://doi.org/10.1111/j.1365-201x.2004.01361.x
  20. Крылов В.Н., Дерюгина А.В., Симутис И.С., Бояринов Г.А., Сенюрина А.И. Содержание АТФ и 2,3 ДФГ в эритроцитах при консервации и воздействии озона. Биомедицина. 2014;2:37-42.