Лежащие в основе деятельности нервной ткани процессы (проведение нервных импульсов, возбудимость и способность к переработке и хранению поступающей информации), в том числе биохимические и биофизические, связанные с функционированием нейронов и образованием синаптических структур, протекают со значительными затратами энергии, обусловленными превращениями макроергических соединений [1]. Один из играющих ключевую роль в энергетическом метаболизме и регулирующих уровень АТФ ферментов это креатинкиназа, или креатинфосфокиназа (КФК) (КФ 2.7.3.2). КФК катализирует обратимую реакцию переноса фосфатного остатка с АТФ на креатин (Кр) с образованием креатинфосфата (КрФ) и АДФ. КФК — тканьспецифичный компарментализованный фермент, особенно высоки его концентрации в тканях с большим потреблением энергии (мозг, сердце, мышцы).

В организме человека синтезируются четыре изоформы КФК: две цитоплазматические — мозговая (В) и мышечная (М), которые функционируют в составе гомо- (ВВ, ММ) или гетеродимеров (МВ), и две митохондриальные — 1 (Мт1) и 2 (Мт2), функциональными формами которых являются октамеры [2].

В мозге обнаружены две формы КФК: цитоплазматическая КФК ВВ (активный димер), обеспечивающая транспортировку макроергических связей фосфатных групп от мест производства АТФ в митохондриях к местам потребления энергии — например АТФ-зависимому ионному насосу и переносчикам нейромедиаторов в нейронах и глии, и митохондриальная Мт1, использующая макроергическую связь АТФ, синтезируемого при окислительном фосфорилировании, для превращения Кр в КрФ и переноса его в цитоплазму [2, 3]. КФК ВВ обнаружена в большом количестве в астро- и олигодендроцитах и в меньшей степени в нейронах, а Мт1 КФК присутствует в митохондриях всех типов клеток, но самый высокий ее уровень — в нейронах [2, 4].

Нарушения энергетического метаболизма мозга описаны при различных патологиях нервной системы, включая шизофрению (ШЗ) [4—6], причем интерес к роли этих нарушений в патогенезе ШЗ и других психотических расстройств в последние годы заметно возрос [1, 7, 8].

Ранее при исследовании аутопсийного головного мозга больных ШЗ было обнаружено снижение как ферментативной активности КФК, так и количества белка изоформы В КФК в лобной коре и гиппокампе [9]. В настоящей работе также исследован аутопсийный материал, при этом изучены пять структур мозга — префронтальная кора (ПФК), (поле 10 по Бродману), гиппокамп, передняя и задняя лимбическая кора (соответственно поля 24 и 23) и кора мозжечка больных ШЗ и контрольной группы.

Выбор структур для исследования продиктован соображениями об их вкладе в процессы, нарушение которых приводит к характерным для психотических состояний симптомам. По данным литературы [7, 10], при ШЗ в этих структурах мозга, особенно в ПФК и лимбической коре, происходят значительные метаболические нарушения.

Современные исследования предполагают участие ПФК (поле 10 по Бродману) в стратегических процессах и управляющих функциях. Через поясной пучок нервных волокон ПФК связана с передней и задней лимбической корой и многими другими структурами мозга, что обеспечивает интеграцию информации, анализируемой сенсорными системами. ПФК играет важную роль в обеспечении высших когнитивных функций (планирование, принятие решений и установление логических связей между явлениями и теоретическими положениями, вызов воспоминаний из эпизодической памяти, обеспечение одновременного выполнения множества задач).

В лимбическую систему входят несколько структур мозга, включая гиппокамп, лимбическую кору, таламус, гипоталамус и др. Компоненты лимбической системы связаны между собой и другими отделами мозга, а кора лобных долей регулирует деятельность лимбической системы. Лимбическая система обусловливает эмоциональный настрой человека и его мотивацию, процессы научения и памяти, а также обеспечивает гибкость и приспособление к изменяющимся условиям внешней среды. Участие мозжечка в когнитивном функционировании и роль связей ПФК с мозжечком в процессе развития когнитивных функций подробно освещены в обзоре [11].

Цель настоящего исследования — изучение распределения мозговой изоформы КФК в различных структурах мозга больных ШЗ и контрольной группы.

С указанной целью определялись ферментативная активность КФК и количество иммунореативной КФК В в экстрактах ПФК, передней и задней лимбической коры, гиппокампа и коры мозжечка. В отличие от предыдущих исследований при оценке уровня иммунореактивной изоформы КФК В использовались моноклональные антитела, специфичные именно к КФК В и не дающие перекрестной реакции с Мт1 КФК. Использование иммуноблоттинга с хемилюминесцентным усилением сигнала (ECL-иммуноблоттинг) позволило провести полуколичественную сравнительную оценку данных об уровнях иммунореактивной изоформы КФК В.

Исследование проведено на образцах из коллекции аутопсийного мозга, собранной и хранящейся при –80 °С в лаборатории нейрохимии Научного центра психического здоровья (НЦПЗ).

17 образцов аутопсийного мозга были получены из патологоанатомической лаборатории Московской психиатрической больницы № 1 при наличии прижизненного диагноза «шизофрения» по МКБ-10.

В качестве контроля были использованы 23 образца аутопсийного мозга лиц с соматическими заболеваниями из московских больниц (без психических, неврологических и наркологических расстройств).

Образцы структур мозга ПФК передней и задней лимбической коры, гиппокампа из левого полушария мозга и коры мозжечка выделяли по картам полей по Бродману и замораживали в жидком азоте.

Образцы мозга обеих групп хранились в течение сопоставимого времени перед исследованием. Между группами больных ШЗ и контроля не было достоверных различий по возрасту (p>0,05 тест Манна—Уитни, медианы составили 60,0 года для пациентов и 55,7 года для контроля), времени, прошедшему с момента смерти до замораживания образцов ткани мозга (постмортальный интервал) (p>0,05 тест Манна—Уитни, медианы составили 7,2 ч для пациентов и 7,0 ч для контроля). В обеих группах причинами смерти были острая сердечно-сосудистая недостаточность, тромбоэмболия легочной артерии. Оценивался также хлорпромазиновый эквивалент по J. Davis [12].

Приготовление образцов экстрактов ткани мозга для определения активности КФК и количества иммунореактивной КФК В. Образцы ткани (200 мг) гомогенизировали в гомогенизаторе Potter (стекло/тефлон) в 1 мл 50 мM ТРИС-HCl буфера, pH 7,5, содержавшего 1,4 мМ 2-меркаптоэтанола, при +4 °С, с последующим центрифугированием при 1000 g 15 мин и удалением осадка, содержавшего ядерные фрагменты и осколки неразрушенных клеток. Супернатанты центрифугировали при 90 000 g 1 ч при +4 °С. Для дальнейшего анализа использовали полученные супернатант (фракция водорастворимых белков) и осадок. Супернатант применяли для определения активности КФК и количества иммунореактивной изоформы КФК В. Осадок ресуспендировали в 1 мл 50 мM ТРИС-HCl буфера, pH 7,5, содержавшего 1,4 мМ 2-меркаптоэтанола при +4 °С, центрифугировали при 90 000 g 1 ч при +4 °С, полученный осадок (фракция ассоциированных с мембранами белков) ресуспендировали в 100 мкл 6 М мочевины. Далее проводили обессоливание (замена буфера) на колонках с сефадексом G-25 в буфере 50 мM ТРИС-HCl буфера, pH 7,0, содержавшего 1,4 мМ 2-меркаптоэтанола. Полученный раствор разводили в 3 раза деионизованной водой (фракция ассоциированных с мембранами белков) и использовали для определения активности КФК и оценки уровня иммунореактивной КФК В.

Выделение КФК активного димера из фракции водорастворимых белков ткани мозга проведено по описанному ранее методу [13] с модификациями.

100 г ткани мозга гомогенизировали в 50 мМ натрий-фосфатном буфере pH 7,0, (1:4 вес/объем) при +4 °с использованием ножевого гомогенизатора Ultra-Turrax IKA-Werk knife (Германия). Гомогенат центрифугировали при 10 000 g 1 ч +4 °С, отбрасывали осадок, содержащий ядерные фрагменты и осколки неразрушенных клеток. Супернатант центрифугировали при 100 000 g 1 ч при +4 °С, затем фракционировали дробным осаждением (NH₄)₂SO₄, фракцию 0—40% насыщения (NH₄)₂SO₄ отбрасывали. Фракцию белков, осажденных в диапазоне 40—60% насыщения (NH₄)₂SO₄, центрифугировали при 10 000 g 30 мин при +4 °С. Осадок диализовали против 50 мМ натрий-фосфатного буфера, pH 7,0, затем против 50 мМ буфера имидазол-HCl с 0,1 М NaCl, рН 6,6. Далее проводили ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе, элюцию белка осуществляли ступенчатым градиентом концентрации NaCl (М): 0,130, 0,135, 0,140, 0,145 и 0,150 в 50 мМ имидазол-HCl буфере, рН 6,6 с определением ферментативной активности в процессе выделения. Гомогенность и молекулярную массу выделенного фермента проверяли одномерным электрофорезом в ПААГ по Лэммли в денатурирующих восстанавливающих условиях.

Определение ферментативной активности КФК проводили колориметрически при 690 нм, оценивая количество неорганического фосфата по методу [14], используя стандартный набор реагентов (кат. № 661-РВ, «Сигма Колорадо», Сент-Луис, США):

АТФ + Кр КФК АДФ + КрФ,

КрФ гидролиз Кр + неорганический фосфат.

Удельная активность КФК приводится в нмоль Кр/мин на 1 мл и 1 мг белка.

Для определения уровня иммунореактивной КФК В к супернатанту (аликвота 30 мкг общего белка) добавляли 10% n-додецилсульфат натрия (10% объема) и β-меркаптоэтанол (10% объема), образцы нагревали на кипящей водяной бане 5 мин и проводили одномерный электрофорез в ПААГ по Лэммли с последующим ECL-Вестерн-иммуноблоттингом (протокол Амершам — Фармация Биотех). Определяли количество КФК В, используя внутренний стандарт (образец мозга контрольной группы) [15] с помощью конъюгированных с пероксидазой моноклональных мышиных антител в разведении 1:100 000. Антитела получены совместно с сотрудниками лаборатории клинической иммунологии ФГБНУ НЦПЗ.

Количество иммунореактивной КФК В оценивали в относительных единицах (отн. ед.) после сканирования фотопленок после ECL-Вестерн-иммуноблоттинга и количественной обработки полученных изображений. Анализ изображений проводили на приборе KОDAK Image Station IS2000R.

Концентрацию белка определяли спектрофотометрическим методом Лоури с использованием набора реагентов Bio-Rad DC Protein Assay (США) в соответствии с протоколом и использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве белкового стандарта для калибровки.

Для статистической обработки данных использовали программу Statistica 6.0 («Statsoft»), модуль — непараметрический анализ (поиск статистически значимых различий между группами — тест Манна—Уитни, корреляционный анализ — поиск ранговых корреляций и определение коэффициента корреляции Спирмена).

Данные в таблицах выражены в единицах ферментативной активности КФК или отн. ед. — для количества иммунореактивной КФК В. Каждое значение рассчитывали по результатам трех повторных измерений в каждом образце.

Результаты определения ферментативной активности КФК во фракции водорастворимых белков аутопсийного мозга лиц контрольной группы и пациентов с ШЗ представлены на рис. 1. Как видно из этого рисунка, в контрольной группе наиболее высокий уровень КФК обнаружен в коре мозжечка, а самый низкий — в гиппокампе (р<0,01). При этом существенных различий в активности КФК между ПФК, передней и задней лимбической корой не было отмечено (медианы приведены в табл. 1).

При исследовании фракции водорастворимых белков мозга в группе больных ШЗ по сравнению с контролем было выявлено значительное и достоверное снижение активности КФК во всех пяти исследованных структурах мозга (во всех случаях р<0,01) (см. рис. 1). Из рис. 1 также видно, что степень снижения активности КФК при ШЗ различалась в разных областях мозга. Так, наиболее заметное отличие (примерно в 5,5 раза) между медианами, рассчитанными для двух групп, наблюдалось в мозжечке, наименьшее (в 2,8 раза) — в передней лимбической коре (см. табл. 1). Таким образом, распределение активности КФК в структурах мозга больных ШЗ изменялось по сравнению с контролем, а различия между структурами в активности фермента становились менее выраженными.

Обнаруженное снижение активности КФК в водорастворимой белковой фракции могло быть обусловлено снижением в ней уровня КФК В.В. Чтобы проверить это предположение, были проведены: 1) оценка уровней иммунореактивной изоформы КФК В в тех же экстрактах образцов мозга, в которых проводилось измерение ферментативной активности, 2) выделение и очистка активного димера КФК ВВ из нескольких образцов ткани мозга лиц контрольной группы и больных ШЗ.

На рис. 2 приведен пример окрашивания при ECL-иммуноблоттинге иммунореактивной КФК В во фракции водорастворимых белков мозжечка. Видно, что интенсивность окрашивания полосы, соответствующей КФК В, в контроле значительно выше (дорожки 1—9), чем у больных ШЗ (10—17). Как и активность КФК, количество иммунореактивной КФК В во всех анализированных областях мозга было значительно снижено у больных ШЗ по сравнению с контролем (во всех случаях р<0,01) (рис. 3).

Проведенный корреляционный анализ показал, что снижение активности КФК и количества иммунореактивной КФК В не связано с возрастом, длительностью постмортального интервала и хлорпромазиновым эквивалентом.

Степень снижения уровня изоформы иммунореактивной КФК В оказалась разной среди исследованных областей мозга. Так, снижение было более выраженным в коре мозжечка, полях 23, 24 и гиппокампе и менее — в поле 10.

Таким образом, среди исследованных пяти структур мозга максимальное снижение активности КФК и уровня иммунореактивной КФК В у больных ШЗ по сравнению с контролем наблюдается в мозжечке. По данным нейроанатомических и физиологических исследований мозга [16], при ШЗ и шизотипическом расстройстве личности наблюдаются дисфункции мозжечка, что согласуется с современными представлениями о его значении для когнитивного функционирования. Пониженный объем мозжечка обнаружен у пациентов с первым психотическим приступом и у нелеченных нейролептиками больных ШЗ по сравнению с психически здоровыми [17—19], что свидетельствует о независимости этого феномена от терапии нейролептиками.

КФК ВВ была выделена из лобной доли аутопсийного мозга больных ШЗ и лиц контрольной группы (по 3 случая из каждой группы) в соответствии с методикой, описанной в разделе «Материал и методы». Чистоту выделенных препаратов КФК ВВ оценивали электрофоретически: они были практически гомогенны при электрофорезе (>98% составляла зона, соответствующая В-субъединице КФК). Выделенные препараты КФК ВВ обладали ферментативной активностью КФК и одинаковой молекулярной массой (43 кДа) при электрофорезе в полиакриламидном геле. Выход белка КФК ВВ из образцов мозга с патологией был в 5—8 раз ниже, чем из контрольных.

Проведенное нами выделение КФК ВВ из образцов ткани мозга больных ШЗ продемонстрировало значительно более низкий выход белка по сравнению с контролем. Это указывает на снижение у больных количества КФК ВВ во фракции водорастворимых белков мозга.

Таким образом, обнаружено и подтверждено значительное снижение активности КФК и уровня иммунореактивной КФК В во фракции водорастворимых белков мозга больных ШЗ по сравнению с контролем, что может быть обусловлено рядом причин. Одной из них мог быть аутолиз мозговой ткани. Однако проведенные нами эксперименты показали незначительное влияние постмортального интервала на активность КФК в первые 18—20 ч после смерти. Тем не менее, чтобы исключить любые возможные артефакты, возникающие вследствие аутолиза, группы больных и контроля были уравнены по этому показателю.

Эффект лечения нейролептиками является другим важным фактором, который следует учитывать. Однако в настоящей работе не было обнаружено корреляции между величиной хлорпромазинового эквивалента (ХПЭ) и активностью КФК, а также величиной ХПЭ и количеством изоформы КФК В в мозге пациентов с ШЗ.

Кроме того, наше исследование образцов аутопсийного мозга, полученных от группы пациентов с болезнью Альцгеймера (которым не проводилась терапия нейролептиками), также свидетельствует, что активность КФК и количество изоформы КФК В снижены в мозге больных по сравнению с контролем [20, 21]. Следовательно, снижение уровня мозговой изоформы КФК, наблюдаемое в мозге пациентов с этими заболеваниями, является характерной особенностью этих расстройств, а не результатом терапии нейролептиками.

Наши данные согласуются с результатами других исследователей энергетического метаболизма мозга при Ш.З. Как показал кластерный анализ транскрипционных изменений, экспрессия связанных с энергетическим метаболизмом и окислительным стрессом генов почти на 90% различается у больных ШЗ по сравнению с контролем, и эти нарушения не связаны с воздействием терапии нейролептиками [22].

Одной из причин снижения уровня мозговой изоформы КФК во фракции водорастворимых белков мозга больных ШЗ может быть ее перераспределение между субклеточными фракциями. Для проверки этого предположения мы выделили фракции водорастворимых и ассоциированных с мембранами белков лимбической коры (поля 23 и 24) и гиппокампа лиц контрольной группы и больных ШЗ (по 12 случаев). В них определили активность КФК и количество иммунореактивной КФК В.

Как показывают данные, приведенные в табл. 2, только в мембранной фракции белков гиппокампа обнаруживается достоверное повышение активности КФК в группе больных по сравнению с контролем (р<0,01), и, возможно, в этой структуре мозга при ШЗ наблюдается бóльшая ассоциация КФК с мембранной фракцией, тогда как в других структурах мозга этот феномен отсутствует. Чтобы выяснить, обусловлено ли повышение активности КФК во фракции мембранных белков гиппокампа больных бóльшим количеством в ней мозговой изоформы КФК, в этой белковой фракции было определено количество иммунореактивной изоформы КФК В.

При сравнении уровней иммунореактивной КФК В во фракции мембранных белков между контролем и группой больных ШЗ не было выявлено достоверных различий, хотя, как и в экспериментах, результаты которых приведены выше, во фракции водорастворимых белков достоверные различия были обнаружены (табл. 3).

Возможно, превышение активности КФК в мембранной фракции белков гиппокампа больных ШЗ над уровнем в контроле происходит не вследствие перераспределения изоформы КФК В между водорастворимой и мембранной фракциями при ШЗ, а из-за большего количества митохондриальной изоформы КФК Мт1. Следовательно, перспективны дальнейшие сравнительные исследования распределения митохондриальной изоформы КФК Мт1 в мозге психически здоровых и больных ШЗ.

Таким образом, в результате неравномерного снижения активности КФК и количества изоформы КФК В в различных структурах мозга при ШЗ происходит изменение распределения этого фермента по сравнению с контролем: различия между структурами в уровнях фермента становятся менее выраженными. Возможно, это говорит о патологии связей между изученными структурами мозга при ШЗ.

В заключение отметим, что независимо от причины падения уровня мозговой изоформы КФК в мозге больных ШЗ это снижение приводит к резкому нарушению энергетического метаболизма мозга, что может являться одним из важных звеньев патогенеза шизофрении [7].