Экспериментальный аллергический энцефаломиелит (ЭАЭ) является общепризнанной моделью рассеянного склероза (PC) — тяжелого аутоиммунного демиелинизирующего заболевания, поражающего людей трудоспособного возраста [1].

Наиболее адекватной моделью PC является ЭАЭ, вызываемый введением гомогената спинного мозга [2, 3]. В этой модели, как и при PC, осуществляется иммунный ответ на все компоненты миелина, индуцируется воспаление с последующей демиелинизацией и дегенерацией аксонов и самих нервных клеток [2—4]; проявляется патологическая цепь событий с развитием парезов, параличей и других симптомов болезни.

В последние годы в качестве мишени терапевтического действия при некоторых нейродегенеративных заболеваниях (например, при болезнях Паркинсона и Альцгеймера) рассматриваются белки S100. S100 — это целое семейство низкомолекулярных белков, выполняющих большой диапазон функций, включая регуляцию кальциевого гомеостаза, фосфорилирование белков, активность ферментов, поддержание цитоскелета, транскрипционную активность в клетке, а также пролиферацию и активацию клеток, апоптоз и хемотаксис [5]. В нервной ткани наиболее распространен белок S100B, который локализуется преимущественно (85—90%) в астроцитах [6].

По имеющимся в литературе данным, секреция белка S100B может стимулироваться провоспалительными цитокинами [7], а повышенный внеклеточный уровень белка S100B (до mМ концентрации) может стимулировать продукцию индуцибельной NO-синтазы (iNOS) и провоспалительных цитокинов ИЛ-1β, ФНОα, ИЛ-6, а также СОХ-2 в астроцитах, клетках микроглии и макрофагах [8—10], т. е. участвовать в нейровоспалении. Повышение уровня этого белка обнаруживается в спинномозговой жидкости и плазме крови больных PC при обострении [11, 12]. Введением этого белка или адаптивным переносом S100-специфических Т-клеток можно индуцировать воспалительное демиелинизирующее заболевание у животных [13, 14].

Релиз-активная форма антител к белку S100 (AT S100) в разных модификациях применяется в клинике (препараты тенотен, пропротен-100) в качестве нейропротективного или нейромодулирующего средства. Феномен релиз-активности свойствен препаратам с высокими разведениями действующего вещества, одной из отличительных черт таких препаратов является способность модулировать эффекты исходного соединения [15].

Цель данного исследования — изучение эффективности релиз-активных форм антител к белку S100 на модели ЭАЭ, а также оценка выраженности их нейропротективного потенциала по сравнению с глатирамера ацетатом (ГА) — препаратом, широко применяемым в клинической практике для лечения PC [16, 17].

Работа проводилась с соблюдением принципов гуманности (Директивы Европейского Сообщества № 86/609 ЕС), одобренных локальным этическим комитетом при Институте экспериментальной медицины. Исследование выполнено на 60 самках крыс породы Вистар (возраст — 12 нед). ЭАЭ индуцировали однократной инокуляцией энцефалитогенной смеси (ЭГС) из расчета 100 мг гомогената гомологичного спинного мозга, 0,2 мл полного адъюванта Фрейнда (содержание убитых микобактерий 5 мг/мл) и 0,2 мл физиологического раствора на одно животное. Энцефалитогенную смесь водили подкожно (в основание хвоста вдоль хвостовой вены) под легким эфирным наркозом в объеме 0,4 мл (по 0,2 мл справа и слева) [18—20].

Релиз-активные АТ S100 в водном растворе (препарат тенотен, Россия) в дозе 2,5 мл/кг в сутки начинали вводить животным (n=20) внутрижелудочно сразу после инъекции энцефалитогенной смеси и продолжали в течение 30 дней (средняя продолжительность заболевания) дважды в день с семичасовым интервалом. Крысы контрольной группы (n=20) внутрижелудочно получали аналогичные объемы растворителя (дистиллированная вода) в те же сроки, крысы группы сравнения — внутримышечные инъекции ГА (препарат копаксон, «Teva», Израиль); введение начинали на 2-й день после индукции ЭАЭ и продолжали в течение 25 дней 1 раз в день в дозе 4 мг/кг в сутки.

Ежедневно, начиная со дня индукции и до 30-го дня после индукции ЭАЭ, перед введением тестируемых препаратов животных взвешивали и оценивали наличие клинических симптомов ЭАЭ. В случае стремительного развития симптомов клинический осмотр проводили не менее 2 раз в день. Тяжесть неврологических нарушений оценивали в баллах по наличию у животных мышечной слабости, тремора (0,5 балла), стойких парезов (1 балл) и параличей (1,5 балла). При поражении нескольких конечностей для расчета клинического индекса (КИ) баллы суммировались. Отсутствие видимых клинических проявлений оценивалось как КИ=0, летальный исход — КИ=6.

Таким образом, для оценки эффективности протективного действия исследуемых препаратов на модели ЭАЭ для каждой группы рассчитывали следующие показатели: 1) время начала заболевания, т. е. продолжительность латентного периода ЭАЭ у заболевших крыс (дни); 2) общее число заболевших, тяжело болеющих и умерших крыс (в процентах от числа крыс в группе); 3) КИ на пике заболевания (баллы); 4) кумулятивный индекс (сумма КИ за весь период заболевания, баллы); 5) продолжительность заболевания (дни); 6) динамика массы тела (% от исходного значения).

Введение ЭГС самкам крыс вызывало развитие ЭАЭ у 80% животных контрольной группы и у 85% животных, получавших тенотен детский (табл. 1). В группе крыс, получавших препарат сравнения — ГА, доля заболевших животных была на 15% ниже по сравнению с контролем. Однако все межгрупповые различия этого показателя не достигали уровня статистической значимости.

У животных контрольной группы заболевание начиналось в среднем через 10 дней после индукции. На день позже заболевание развивалось у животных, получавших Г.А. Самый продолжительный латентный период отмечался при введении AT SI00 — 12,5 дня, что на 2,5 дня больше, чем в контрольной группе и на 1,5 дня больше, чем в группе положительного контроля (см. табл. 1). Пик заболевания также наступал позже (рис. 1).

Анализ тяжести заболевания у животных показал, что в опытной группе (введение AT S100) существенно сокращалась доля животных с тяжелой (4—6 баллов) формой ЭАЭ (5%), у большинства животных отмечалось заболевание легкой (0,5—2 балла) или средней тяжести (2,5—3,5 балла). Значения К.И. (как на пике заболевания, так и суммарно) (см. табл. 1) и уровень смертности в группах крыс, получавших AT S100 и ГА, были ниже, чем в контрольной группе, однако уровня статистической значимости эффекты обоих препаратов не достигли.

Интересно, что при исключении из анализа незаболевших животных в группе c введением AT S100 на пике болезни (13-й день) наблюдались статистически значимые различия по сравнению с группой контроля (см. рис. 1). При этом животные из группы ГА не отличались от контрольных.

Развитие ЭАЭ сопровождалось потерей массы тела, причем для животных контрольной группы — еще до проявления клинических признаков заболевания. Уже на 2-й и 4-й дни эксперимента наименьшая потеря массы тела отмечалась у крыс, получавших ГА (рис. 2). На 5-й и 6-й дни статистически значимые позитивные отличия наблюдались и для группы с введением AT S100. В течение клинического периода ЭАЭ снижение массы тела животных в группах, получавших релиз-активную форму АТ S100 и ГА, было менее интенсивным. В группе с введением AT S100 статистически значимые отличия от контроля наблюдались на 14, 15 и 18-й дни опыта. Препарат сравнения ГА оказал более выраженное действие, хотя значения показателя у этих крыс статистически не отличались от аналогичных характеристик группы с введением AT S100. К 30-му дню после индукции ЭАЭ животные всех групп сравнялись в массе.

В последние годы в клинической практике апробируется использование антител к различным мишеням на иммунных клетках, и у ряда препаратов выявлено протективное действие при РС (натализумаб, алемтузумаб и др.) [21]. Однако эти препараты у многих пациентов вызывают серьезные побочные реакции, и это ограничивает их широкое применение [21].

В своем исследовании мы основывались на применении низких концентраций антител, что позволяет избежать нежелательных побочных эффектов. Мишенью для антител является астроцитарный белок S100, повышение концентрации которого в спинномозговой жидкости и крови показано при РС [11, 12].

Результаты проведенного исследования действительно позволяют сделать вывод о наличии у релиз-активных АТ S100 нейропротективного действия в модели ЭАЭ, сходного с эффектом препарата сравнения — Г.А. Несмотря на то что при использовании обоих препаратов частота заболеваемости не уменьшалась, у животных, получавших лечение, заболевание протекало в более легкой форме, чем в контрольной группе.

Протективный эффект AT S100 может быть обусловлен удалением из внеклеточного пространства избыточного количества белка S100 и осуществляться на разных уровнях.

На периферии, по-видимому, защитное действие происходит за счет регуляции функций CD8⁺ Т-клеток и NK-клеток, которые при стимуляции экспрессируют и секретируют S100B [22], и/или их миграционной способности в ЦНС. Это предположение частично подтверждается удлинением индуктивного периода у крыс, получавших AT S100, так как клинические симптомы ЭАЭ появляются при проникновении аутореактивных Т-клеток в ЦНС и запуске экспрессии провоспалительных цитокинов в ЦНС [18].

В ЦНС нейропротекция может быть связана с подавлением воспалительного процесса. Выявлено, что повышенные (микромолярные) внеклеточные концентрации белка S100 стимулируют выработку NO и активацию микроглии [8, 23]. Другой возможный механизм выявленного протективного действия AT S100 — снижение образования активных форм кислорода, повреждающих нейроны [24, 25]. Кроме того, AT S100, регулируя уровень S100, могут влиять на синтез и секрецию астроцитами фактора роста фибробластов-2 (FGF-2) и трансформирующего фактора роста β (TGFβ3) [26]. Известно также, что в физиологических концентрациях белок S100B стимулирует пролиферацию глии и рост нейритов через ERK-сигнальные пути [27], т. е. при PC белок S100 может оказывать не только повреждающее, но и протективное действие на клетки ЦНС, уменьшая степень повреждений и способствуя репаративным процессам.

С учетом вышеизложенного становятся очевидными преимущества использования РА-формы препарата АТ у S100, оказывающей мягкое, но эффективное модулирующее и нормализующее действие.

Проведенное исследование показало перспективность применения РА-формы препарата АТ к S100 в клинической практике, однако требуется разработать критерии отбора пациентов, схему и длительность проведения лечения, а также исследовать возможность его использования в комплексной терапии, направленной на различные патогенетические мишени.