В декабре 2013 г. в Лондоне на саммите стран G8 была создана глобальная программа по борьбе с деменцией. Основанием для ее создания явилось то, что патологии мозга налагают огромное экономическое бремя на современное общество, и в странах Европейского Союза они обходятся дороже, чем диабет, онкологические и сердечно-сосудистые заболевания вместе взятые. В настоящее время поиск путей создания методов диагностики и лечения нейродегенеративных болезней основывается на результатах исследований фундаментальных механизмов возникновения патологических состояний на молекулярном уровне.

Накопление структурно измененных белков в виде упорядоченных надмолекулярных агрегатов является характерным признаком ряда нейродегенеративных заболеваний — протеинопатий, включающих в себя болезни Альцгеймера (БА), Паркинсона, Хантингтона, Пика, а также прионные болезни и ряд других более редких форм патологии [1]. БА является самой распространенной протеинопатией в мире [2]. Она ассоциирована с появлением в тканях головного мозга специфических белковых образований — амилоидных бляшек и нейрофибриллярных клубков [3]. Клинические и нейроморфологические проявления БА были описаны более 100 лет назад [4], но лишь в 80-х годах было установлено, что в качестве главных компонентов амилоидных бляшек и нейрофибриллярных клубков выступают β-амилоидный пептид (β-амилоид, Aβ, Aβ1−39*43) и гиперфосфорилированный белок тау [3]. Имеется несколько теорий возникновения БА [5], что обусловливает различные приоритетные направления исследований в этой области [6]. Однако ведущей является амилоидная гипотеза [7], которая указывает на процесс патологической агрегации именно Aβ в качестве основной движущей силы патогенеза БА.

β-Амилоид состоит из 39—43 аминокислотных остатков [8]. Он содержится в биологических жидкостях (кровь, цереброспинальная жидкость) в субнаномолярных концентрациях, которые одинаковы как для больных, так и здоровых людей [9, 10]. Физиологическая функция Aβ неизвестна. In vivo Aβ является продуктом протеолитического процессинга большого трансмембранного белка, предшественники амилоидного протеина (АПП), β- и γ-секретазами [11]. В другом пути нормального процессинга АПП наряду с γ- задействована α-секретаза, которая разрезает полипептидную цепь Aβ между аминокислотными остатками 16 и 17, что приводит к появлению усеченного с N-конца варианта Aβ — Aβ(17−39*43). Aβ(17−39*43) не вовлечен в патологические процессы БА, что свидетельствует о критической роли первых 16 аминокислотных остатков Aβ в патогенезе БА [12].

Принципиальным моментом при изучении молекулярных причин БА является получение сведений о пространственной структуре различных форм Aβ в норме и при патологии. Для этого широко используются методы магнитно-резонансной спектроскопии [8]. В частности, была определена структура модельных агрегатов нативного Aβ(1−42) [13—15], которая показала наличие в его полипептидной цепи двух областей, значительно различающихся по относительному положению: находящегося на поверхности гидрофильного N-концевого участка 1−16 и более длинного С-концевого фрагмента 17−42, который в виде β-листа входит в гидрофобное ядро агрегатов.

Нейротоксичными предшественниками патологических агрегатов Aβ в составе амилоидных бляшек являются растворимые димеры и олигомеры Aβ [16], которые находятся в динамическом равновесии с агрегированными молекулами Aβ [17] и рассматриваются как потенциальные биомаркеры развития БА [18]. Воздействие на молекулярный механизм полимеризации Aβ считается наиболее перспективным подходом для создания эффективных средств лечения БА [7, 19]. В настоящее время к проведению клинических испытаний подготовлено несколько лекарственных средств, направленных на подавление образования патологических агрегатов Aβ [20]. В то же время закончились неудачей широкомасштабные клинические испытания бапинезумаба (bapineuzumab) и трамипросата (tramiprosate), на которые врачи возлагали большие надежды [21, 22].

Агрегаты Aβ, выделенные из мозга пациентов с диагнозом БА, способны вызывать цепную реакцию полимеризации мономерных молекул Aβ в организме экспериментальных животных [23—32]. На основании этих результатов было высказано предположение, что зарождение нейротоксичных олигомеров Aβ инициируется непосредственным взаимодействием эндогенных молекул Aβ с «прионоподобными матрицами», в качестве которых выступают структурно- и/или химически модифицированные формы Aβ [25, 29, 33—35], присутствующие в патологических амилоидных бляшках [25]. Анализ состава таких бляшек выявил, что значительное число ассоциированных с БА форм Aβ человека имеют химические модификации и точечные мутации в участке 1−16 полипептидной цепи Aβ [36—40], которые также определяют структурный полиморфизм Aβ в свободном и агрегированном состояниях [41].

Амилоидные бляшки характеризуются повышенным содержанием двухвалентных металлов, в частности цинка (до 1 мМ) [42], что привлекло внимание исследователей к изучению роли взаимодействий между Aβ и ионами биометаллов [43]. Фрагмент 1−16 является металлсвязывающим доменом β-амилоида [44—47]. Было показано, что нековалентные комплексы модифицированных по металлсвязывающему домену форм Aβ с белками-партнерами [7], нуклеиновыми кислотами [48] и/или ионами переходных металлов [49] могут обладать нейротоксическими свойствами и вызывать патологическую агрегацию эндогенного Aβ [50]. Таким образом, в качестве молекулярных факторов, способствующих образованию нейротоксичных олигомеров Aβ, выступают имеющиеся в составе амилоидных бляшек модифицированные формы Aβ [25] и ионы переходных металлов [43]. Особый интерес вызывают ионы цинка, которые существенно ускоряют агрегацию Aβ in vitro и играют критическую роль в появлении патологических агрегатов Aβ in vivo [43, 51].

Нами был установлен молекулярный механизм образования устойчивого водорастворимого комплекса иона цинка с металлсвязывающим доменом интактного Aβ — Aβ(1−16), согласно которому вначале ион цинка хелатируется боковыми группами аминокислотных остатков E11, H13 и H14, а затем происходит сворачивание N-концевого участка 1−8 с последующим образованием дополнительной координационной связи между ионом цинка и боковой группой остатка H6 [52]. Комплексы иона цинка с металлсвязывающим доменом Aβ могут представлять собой либо компактно свернутые мономеры, в которых ион цинка координируется четырьмя хелаторами одной молекулы Aβ, либо структурно развернутые димеры, в которых аминокислотные остатки E11 и H14 взаимодействующих субъединиц координируют общий ион цинка [53].

В присутствии ионов цинка Aβ(1−16) в составе полноразмерных форм Aβ(1−39*43) находится преимущественно в развернутом состоянии и принимает участие в межмолекулярных связях, стабилизирующих полиморфные олигомеры и агрегаты Aβ [50]. Тем не менее подобные агрегаты не являются патогенными in vivo [25]. Известно, что у пациентов с диагнозом БА Aβ подвергается многочисленным посттрансляционным модификациям, одна из которых приводит к появлению изомеризованного остатка аспарагиновой кислоты в положении 7 (изоD7) [54].

Эта модификация серьезно влияет на хелатирование ионов цинка и меди металлсвязывающим доменом Aβ [55, 56], цинкзависимую димеризацию этого домена [57] и его гидролиз ангиотензинпревращающим ферментом [58]. Поскольку каждый из указанных выше процессов тесно связан со способностью Aβ к патологической агрегации, можно предположить, что Aβ с такой модификацией (изоD7-Aβ) будет обладать патогенными свойствами in vivo. Действительно, изоD7-Aβ оказывает сильный токсический эффект на нейрональные клетки [59] и ускоряет образование амилоидных бляшек у трансгенных мышей, используемых в качестве животной модели БА [38]. Недавно нами было показано, что синтетический пептид, аминокислотная последовательность которого соответствует металлсвязывающему домену изоD7-Aβ, тоже вызывает развитие церебрального амилоидоза при введении трансгенным мышам, что свидетельствует о способности именно этой части изоD7-Aβ играть самостоятельную патогенную роль. Современные методы биологической масс-спектрометрии сверхвысокого разрешения позволяют определить количественное содержание фрагмента 1−16 изоD7-Aβ в образцах плазмы крови [60], что в перспективе позволит валидировать в клинических испытаниях возможность использования изоD7-Aβ в качестве биомаркера для создания методов молекулярной диагностики БА.

На основании данных о том, что наличие изоD7 в металлсвязывающем домене Aβ вызывает образование цинкзависимых димеров изоD7-Aβ(1−16) [57], была выдвинута гипотеза, в соответствии с которой химические модификации и/или мутации отдельных аминокислотных остатков в этом домене могут либо усиливать, либо нейтрализовать способность Aβ образовывать нейротоксичные димеры и олигомеры [61]. В пользу этой гипотезы свидетельствует тот факт, что в отличие от остальных млекопитающих лишь мыши и крысы не подвержены болезни альцгеймеровского типа, при этом в Aβ мыши и крысы имеются три аминокислотные замены именно в металлсвязывающем домене [62]. В результате этих замен металлсвязывающий домен Aβ крысы образует цинксвязанные димеры, пространственное строение которых предопределяет расположение гидрофобных C-концов полипептидных цепей каждой субъединицы в противоположных друг относительно друга направлениях, что исключает их «слипание» в гидрофобный агрегат [63, 64] и, как следствие, не позволяет Aβ крысы образовывать патологические амилоидные бляшки. Напротив, металлсвязывающие домены Aβ человека при образовании цинкиндуцированных димеров ориентируют свои С-концевые фрагменты в одном направлении, что приводит к возникновению гидрофобного ядра патологических амилоидных бляшек [41, 57].

Исследования молекулярного механизма образования цинкиндуцированных димеров металлсвязывающего домена как нативного Aβ, так и ассоциированных с патогенезом БА форм Aβ, в которых имеются посттрансляционные модификации (изомеризация аспарагиновой кислоты 7 и фосфорилирование серина 8), показали, что участок первичного распознавания и связывания иона цинка (аминокислотные остатки 11−14 Aβ) является необходимой и достаточной молекулярной детерминантой цинкзависимой димеризации Aβ [52, 53, 61]. Соответственно участок 11−14 Aβ может быть использован в качестве перспективной мишени для поиска низкомолекулярных соединений, которые будут способны в силу своего специфического связывания с этой мишенью подавлять процессы цинкзависимой олигомеризации Aβ и таким образом служить прототипами эффективных лекарственных средств терапии БА.

Несмотря на выдающиеся достижения последних 30 лет в понимании молекулярных основ патогенеза БА, которые систематизированы в постоянно модернизируемой теории амилоидного каскада [7], в настоящее время нет ни одного успешного примера использования этих знаний в медицинской практике. Все попытки ингибировать образование патологических агрегатов Aβ путем стабилизации его мономерного состояния в биологических жидкостях за счет введения в организм антител или специально сконструированных низкомолекулярных веществ (например, tramiprosate), специфически связывающихся с интактным Aβ, завершились провалом [65]. Тем не менее можно считать установленным фундаментальный факт, подтвержденный в экспериментах на обезьянах и трансгенных грызунах, что эндогенный β-амилоид сам по себе не подвержен агрегации in vivo, но образует нейротоксичные димеры и патологические надмолекулярные ансамбли только при контакте со своими структурно- и/или химически модифицированными изоформами в присутствии ионов цинка. Так как связывание ионов цинка с Aβ является нормальным физиологическим процессом, то, возможно, ингибирование таких взаимодействий будет опасным для пациента. Поэтому направленное подавление образования цинксвязанных олигомеров и агрегатов Aβ представляется более приемлемым для воздействия на развитие Б.А. Аминокислотные участки, играющие критическую роль в образовании олигомерных комплексов металлсвязывающего домена Aβ с ионами цинка, а также стабилизации агрегатов полноразмерных молекул изоформ Aβ человека, являются молекулярными детерминантами этих процессов. Блокирование этих участков с помощью низкомолекулярных соединений предоставит возможность введения в клиническую практику принципиально новой терапевтической стратегии на основе средств разрушения цинкзависимых олигомеров Аβ и, как следствие, остановки процессов патологического амилоидного каскада БА.

Таким образом, в настоящее время достигнут существенный прогресс в установлении причинно-следственных связей между спонтанными химическими модификациями металлсвязывающего домена 1−16 β-амилоида и образованием патологических амилоидных бляшек, что позволяет использовать соответствующие формы Aβ в качестве потенциальных биомаркеров при ранней диагностике БА, а процесс цинкзависимой димеризации и олигомеризации Aβ — в качестве лекарственной мишени при терапии этой патологии.

Исследование выполнено по гранту Российского научного фонда (проект № 14−24−00100).