В последние десятилетия постоянно сохраняется интерес к изучению тромбоцитов при эндогенных психозах. Это связано с наличием многочисленных доказательств их участия не только в гемостазе, иммунных реакциях [1-4], но и в метаболизме нейромедиаторов. Не случайно они используются в качестве периферической модельной системы для исследования метаболизма серотонина в мозге, в том числе при шизофрении [5-10]. При активации тромбоциты освобождают содержимое своих гранул, которое через открытую каналикулярную систему (ОКС) выделяется в плазму. Гранулы тромбоцитов содержат серотонин, при активации этих клеток их число снижается [3]. При депрессии у нелеченых больных были выявлены [11] расширение ОКС и вакуолизация тромбоцитов. Описанные морфофункциональные изменения тромбоцитов позволяют определить их состояние при эндогенных психозах до и в процессе лечения.

Ранее одним из авторов настоящей статьи [12, 13] изучалась ультраструктура тромбоцитов. В литературе отсутствуют работы, касающиеся сопряженности морфологических изменений тромбоцитов с соответствующими биохимическими показателями. Можно лишь привести исследование А.И. Киктенко и соавт. [14], которые методом сканирующей электронной микроскопии установили, что морфологические признаки активации тромбоцитов коррелируют с биохимическими показателями состояния серотониновой системы.

Одним из современных атипичных антипсихотических средств, способных блокировать серотониновые рецепторы (5-НТ2) больше, чем дофаминовые (D2), является оланзапин [15], а в проведенном ранее исследовании О.С. Брусова и соавт. [6] было отмечено нарушение обмена тромбоцитарного серотонина у больных шизофренией в процессе лечения оланзапином.

Цель настоящего исследования - изучение влияния лечения больных шизофренией оланзапином на ультраструктуру тромбоцитов, в рамках которого была предпринята попытка выяснить, существует ли связь между ультраструктурой тромбоцитов и содержанием тромбоцитарного серотонина.

Были обследованы 59 больных хронической (приступообразно-прогредиентная) шизофренией (по МКБ-10: F20.02, F20.22). Полная клиническая характеристика была дана в предыдущей публикации [13].

В контрольную группу вошел 31 соматически и психически здоровый человек.

Больных лечили оланзапином (зипрекса «Elli Lilly», США). Кровь для исследования брали до лечения, через 8 и 28 нед терапии. Между 8-й и 28-й неделями был период поддерживающего лечения после активной антипсихотической терапии.

Препарат клеток периферической крови для трансмиссионной электронной микроскопии готовили следующим образом: венозную кровь брали из локтевой вены в стерильную коническую пробирку с гепарином, которую выдерживали под наклоном в течение 60 мин. Затем отбирали верхний слой лейкоцитов и центрифугировали 10 мин при 1000 об/мин, удаляли плазму и осадок клеток заливали фиксатором - 2,5% раствором глутаральдегида в 0,1 М фосфатном буфере (ФБ) (рН 7,2-7,4), промывали в этом буфере, после чего дофиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия в 0,1 М буферном растворе в течение 60 мин. Далее осадок клеток отмывали в буфере и заливали 4% агаром в 0,1 М ФБ, выдерживали при 50 °С 30 мин, охлаждали, извлекали застывший агар с осадком клеток, нарезали на кусочки с последующим осуществлением стандартной процедуры обезвоживания и заливки в эпоксидную смолу. Ультратонкие срезы получали на ультратоме ЛКБ (Швеция), контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца, просматривали и фотографировали в электронном микроскопе Philips EM-210 (Нидерланды).

Полученный препарат содержал в достаточном количестве все клетки крови - лимфоциты, эритроциты, гранулоциты, моноциты, тромбоциты, а также макромолекулярные компоненты плазмы крови. Для исследования в соответствии с поставленными задачами брали только тромбоциты.

Исследовали популяцию тромбоцитов у больных до лечения, через 8 и 28 нед после лечения оланзапином и в контрольной группе в те же сроки. У каждого пациента изучали 150 тромбоцитов и более, среди которых выделяли гранулярные (ГТ) и вакуолизированные (ВТ). Именно последние были показателем активации тромбоцитов. Подсчитывали их процентное содержание по отношению к общему числу клеток, которое принимали за 100%. Дополнительно подсчитывали число и средний объем тромбоцитов на автоматическом анализаторе, предназначенном для клинических исследований.

Для определения тромбоцитарного серотонина (ТС) кровь брали из локтевой вены утром натощак в пластмассовые флаконы, содержащие стандартный цитратный антикоагулянт (1:10 - соотношение объема антикоагулянта к объему крови) до начала лечения, через 8 и 28 нед после лечения оланзапином. Содержание ТС определяли микрофлю­орометрическим методом на спектро­флюориметре Хитачи-850 при волне возбуждения, равной 335 нм, и волне испускания, равной 350 нм. Детали определения и расчета содержания ТС были описаны в предыдущей работе [5]. Подсчет тромбоцитов в плазме, обогащенной тромбоцитами, осуществляли с помощью фазоконтрастирования поля зрения на микроскопе AXIO Imager M1 (Германия).

Статистический анализ проводили, используя программу Statistica версия 7 («Statsoft Inc.», США). Групповые различия у нелеченых больных с контрольной группой определяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа. Различия между группами нелеченых и леченых через 8 и 28 нед больных оценивали с помощью метода дисперсионного анализа с повторными измерениями (repeated measures ANOVA) c последующим апостериорным сравнением групп. Для исследования статистической значимости связей между содержанием ТС и процентом вакуолизированных тромбоцитов в разных точках использовали &khgr;²-тест при кросстабуляции больных.

Две основные субпопуляции тромбоцитов периферической крови человека - ГТ и ВТ хорошо различаются по ультраструктуре с учетом числа в цитоплазме специфических гранул и вакуолей (рис. 1).

При изучении общей ультраструктуры тромбоцитов было отмечено, что по сравнению с контролем у больных шизофренией среди этих клеток чаще наблюдались деструктивные формы и фагоцитированные моноцитами и нейтрофилами пластинки, а также их агрегаты. При этом количество и объем тромбоцитов между больными и здоровыми достоверно не различались.

Статистический анализ показал, что доля ВТ в крови больных хронической шизофренией до лечения была на 157% выше нормы: F (1.87)=34,7 (р<0,001) (рис. 2).

Сравнение группы нелечившихся и лечившихся больных по проценту ВТ показало их достоверное различие: F (2,94)=47,7 (р<0,001). Процент ВТ у больных после 8 и 28 нед лечения достоверно снижался по сравнению с исходным значением до лечения (соответственно на 52 и 57%, р<0,001), но различий в показателях на разных этапах лечения отмечено не было (р>0,05) (рис. 3).

Как и следовало ожидать, в отличие от повышенного содержания ВТ в крови больных хронической шизофренией до лечения содержание ТС у них было достоверно (p=0,024) снижено относительно контроля: 4,66±3,11 (n=59) и 6,1±1,5 (n=29) нмоль/10⁹ тромбоцитов у больных до лечения и в группе контроля соответственно.

У больных после 8 нед лечения процент ВТ достоверно снижался, а уровень ТС повышался. Так, содержание ТC после 8 нед лечения у 53 больных достоверно возросло с 4,66±3,11 до 5,79±2,2 нмоль/10⁹ тромбоцитов (p=0,034) до и после 8 нед лечения соответственно. При этом содержание ТС после 8 нед лечения уже достоверно не отличалось от нормальных значений (p=0,7).

Апостериорное групповое сравнение (repeated measures ANOVA) показало, что содержание ТС у больных в период поддерживающего лечения между 8-й и 28-й неделями лечения достоверно не изменялось (6,77±3,96 против 5,79±2,2 нмоль/10⁹ тромбоцитов после 8-й и 28-й недель лечения; p=0,22) и не отличалось от нормальных значений (р=0,378).

На первом этапе была исследована корреляционная связь между процентом ВТ и ТС до лечения, через 8 и 28 нед лечения. Была установлена достоверная отрицательная корреляция по Спирману (Spearman R) между процентом ВТ и ТС до лечения (r= –0,30; p=0,02) и через 8 нед лечения (r= –0,29; p=0,04). Было также выявлено отсутствие корреляционной связи между показателями через 28 нед лечения (r= –0,16; p=0,26). Показана достоверная корреляция между величиной снижения процента ВТ и повышения уровней ТС после 8 нед лечения больных (r=0,34; p=0,008).

На втором этапе для оценки достоверности связи между выявленными корреляциями нами был использован критерий оценки силы связи &khgr;²-тест. Для этого пациенты в контрольных точках до и после 8 нед лечения дихотомически были разбиты на группы с высокими и низкими значениями изучаемых показателей (относительно медианного значения в группе) процента ВТ или ТС. Затем для каждой контрольной точки была сформирована кросстабуляционная таблица, по которой с помощью &khgr;²-теста определялась достоверность связи между сравниваемыми группами больных.

Табл. 1 показывает, что величина &khgr;²-теста равна Chi-square=8,65; p=0,00326.

Данные, приведенные в табл. 2, свидетельствуют, что величина &khgr;²-теста равна Chi-square=0,85; p=0,35.

Данные табл. 3 показывают, что величина &khgr;²-теста равна Chi-square= –8,65; p=0,003.

Проведенное исследование является первым электронно-микроскопическим исследованием тромбоцитов у больных шизофренией до и после лечения атипичным нейролептиком - оланзапином. Его основной результат - более выраженное по сравнению с контролем состояние активации тромбоцитов периферической крови больных хронической шизофренией до лечения. Как уже говорилось выше, уровень активации тромбоцитов может быть определен по проценту ВТ, поскольку эти тромбоциты находятся в активном морфофункциональном состоянии высвобождения своих специфических гранул. В процессе высвобождения гранулы сливаются с вакуолями и через открытую каналикулярную систему их содержимое секретируется наружу вплоть до полного опустошения тромбоцита [16, 17]. Важно отметить, что повышенная вакуолизация тромбоцитов была выявлена также у нелеченых больных депрессией [11] и при паркинсонизме [16]. Гипер­активация тромбоцитов у больных шизо­френией была установлена и Г.П. Злобиной и соавт. [18] по косвенному показателю - слабой резистентности активированных тромбоцитов, что согласуется с данными настоящей работы, в которой была выявлена субпопуляция активированных вакуолизированных тромбоцитов, находящихся в состоянии деструкции.

Данные литературы [2, 3, 19-21] показывают, что тромбоциты активируются, участвуя в процессах гемостаза, иммуногенеза и неспецифической резистентности организма. При этом главная функция тромбоцитов заключается в поддержании целостности сосудистого русла и ее восстановлении в случае повреждения. При шизофрении повреждающими сосуды факторами могут быть аутоиммунные и эндотоксические процессы [22, 23]. С учетом этих особенностей установленные изменения морфофункционального состояния тромбоцитов больных хронической шизофренией могут быть интегральным показателем наличия этих повреждающих факторов.

Еще одним заслуживающим внимания результатом является достоверное снижение процента ВТ при лечении в течение 8 и 28 нед до контрольного уровня, свидетельствующее о снижении активации тромбоцитов.

Проведенное исследование позволило также установить, что существует связь между содержанием серотонина в тромбоцитах и процента ВТ. Это соответствует установленным данным о том, что серотонин в тромбоцитах находится в электронно-плотных гранулах [24], и результатам работы R. Reddy и соавт. [25], показавших сниженную серотонинергическую реактивность тромбоцитов, определявшуюся по их способности секретировать электронно-плотные гранулы, у больных при первом психотическом эпизоде шизофрении.

В настоящей работе впервые показана статистически достоверная связь между вакуолизацией тромбоцитов при шизофрении и снижением в них содержания ТС и исчезновение этой связи в процессе лечения по мере нормализации уровней процента ВТ и ТС.

Помимо полученных в настоящей работе основных результатов, следует обратить внимание и на некоторые другие особенности изучавшихся тромбоцитов, в частности феномен фагоцитирования их собственными моноцитами и нейтрофилами, а также повышенную способность тромбоцитов больных хронической шизофренией к агрегации [26, 27]. В литературе подобные процессы были описаны [13, 28] и тем не менее требуют дальнейшего изучения.