Нейровизуализационные исследования показали, что когнитивные расстройства, позитивные и негативные симптомы шизофрении связаны с дисфункцией префронтальной коры (ПФК) [1-3]. По данным исследований аутопсийного материала, в сером веществе ПФК при шизофрении нет выраженного дефицита нейронов [4-6], но снижены размеры пирамидных нейронов [7, 8]. Большие изменения в ПФК при шизофрении связаны с патологией олигодендроглии: выявлены дефицит и выраженные ультраструктурные нарушения олигодендроцитов и миелиновых волокон [9-11]; дефицит касался и перинейрональных олигодендроцитов [12].

В настоящее время большое внимание привлекает к себе и другой вид глии при шизофрении - астроциты. Этот интерес связан с тем, что данные клетки структурно и функционально тесно связаны с нейронами и участвуют в механизмах синаптической передачи и процессах пластических перестроек, энергетическом и глутаматном метаболизме, ионном гомеостазе и антиоксидантной защите. Астроциты синтезируют провоспалительные цитокины, активно участвуют в формировании и функционировании гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) [13-16]. Дисфункция астроцитов и нарушения их энергетического, глутаматного и кинуренинового метаболизма в мозге при шизофрении показаны в био-, иммуноцитохимических и молекулярно-генетических исследованиях [17-20].

Известно, что астроциты отвечают на повреждения ЦНС гипертрофией с увеличением размеров клеток и пролиферацией. Это явление обозначается понятием глиоза. Глиоз сопровождается экспрессией провоспалительных цитокинов, которые способны минимизировать повреждения нейронов. При шизофрении в ПФК установлены разные изменения: показаны как снижение содержания и экспрессии основного маркера астроцитов - глиального фибриллярного кислого белка вблизи сосудов [21], так и увеличение плотности ГФКБ-позитивных астроцитов только в слое 5 ПФК [22] и отсутствие различий в уровне экспрессии и содержании ГФКБ в ПФК в группе шизофрении по сравнению с контролем [23, 24].

Реактивность астроцитов может быть оценена по их размеру и численной плотности. Гипер-, гипо- или атрофия астроцитов связаны с изменениями размеров этих клеток. Н.С. Коломеец [25] в электронно-микроскопическом морфометрическом исследовании показала достоверное повышение объемной фракции и численной плотности астроцитов в единице площади ткани и размера астроцитов в гиппокампе при шизофрении. Также найдены ультраструктурные дистрофические нарушения астроцитов в хвостатом ядре [26] и гиппокампе [27], обусловленные снижением численной плотности и объемной фракции митохондрий и накоплением липофусцина. Дистрофические изменения астроцитов при шизофрении описаны нами ранее в верхних слоях ПФК [28]. К сказанному можно также добавить, что астроциты контролируют глутаматный метаболизм нейронов, в частности в ПФК [29], а с нарушением этого метаболизма и функций глутаматных рецепторов связаны когнитивные расстройства у больных шизофренией.

В этой области есть и экспериментальные работы. Так, недавно было установлено [30], что введение экспериментальным животным специфического астроцитарного токсина L-α-aminoadipate в ПФК приводило к нарушению рабочей памяти и обучения, сходному с нарушениями у больных шизофренией и сопровождающемуся снижением численной плотности астроцитов, атрофией дендритов нейронов и прогрессирующей гибелью нейронов. Эти данные указывают на связь астроцитов с когнитивной функцией ПФК.

Поскольку ранее в ПФК были показаны дистрофические нарушения астроцитов и снижение размеров пирамидных нейронов при шизофрении, мы предположили, что последнее может быть связано и с изменениями перинейрональных астроцитов и нарушением их взаимоотношений с нейронами. В наших предыдущих исследованиях в слое 5 поля 10 ПФК при шизофрении с помощью метода Гольджи были обнаружены снижение размеров проксимальных и дистальных дендритов пирамидных нейронов [31], нарушения ультраструктуры миелиновых волокон и олигодендроцитов [32, 33], дистрофические и деструктивные изменения перикапиллярных олигодендроцитов и снижение их численной плотности [34], а также достоверное набухание ножек перикапиллярных астроцитов [35].

Цель настоящего исследования - оценка реактивности перинейрональных астроцитов (ПА) по их численной плотности, размеру ядра и цитоплазмы и содержанию липофусцина в слое 5 поля 10 ПФК в норме и при шизофрении.

Исследование было проведено на коллекции ауто­псийного мозга, имеющейся в Лаборатории клинической нейроморфологии Научного центра психического здоровья РАН.

Были изучены 39 случаев: 18 - с непрерывным типом течения заболевания (по МКБ-10 рубрика F20.00), 12 - c приступообразно-прогредиентным течением (F20.01), 3 - кататонической шизофрении (F20.21), 4 - недифференцированной шизофрении (F20.30, F20.31), 1 - гебе­френической шизофрении (F20.10) и 1 - неуточненная форма (F20.98).

Контрольная группа включала 37 случаев смерти лиц без психической патологии.

Общая характеристика исследованных наблюдений приведена в таблице.

Была изучена ткань ПФК (полюс поля 10, слой 5). Для каждого случая кусочки ткани брали из левого полушария, фиксировали погружением в смесь растворов 2,5% глутаральдегида и 4% параформальдегида на 0,1М фосфатном буфере в течение 1 нед. Из фиксированной ткани вырезали кусочки толщиной 0,5 мм через все слои коры перпендикулярно поверхности, промывали в фосфатном буфере, дофиксировали осмием 1 ч, дегидратировали и заливали в эпоксидную смолу аралдит. Полутонкие срезы (1 мкм), окрашенные метиленовым синим, использовали для ориентации в слоях коры. Использовали три случайно выбранных блока ткани из каждого случая. Ультратонкие срезы собирали на медные бленды, покрытые подложкой из формвара и стабилизированные углеродным напылением. Ультратонкие срезы окрашивали водным раствором уранилацетата и раствором цитрата свинца и просматривали с помощью электронного микроскопа JEM-100B (Япония).

Морфометрическое исследование проводили слепым методом. Оценивали численную плотность ПА в единице площади ткани, размеры ПА, их ядра и цитоплазмы и объемную фракцию (Vv) и численную плотность липофусцина. Фотографии ПА получали при увеличении ×3300. ПА легко идентифицировали по их электронно-прозрачной цитоплазме и мелкодисперсному хроматину в ядре, неправильному контуру тела, связанному с отхождением от него отростков, наличием митохондрий, рибосом и гранул липофусцина, а также относительной бедности органелл и тесным соприкосновением с сомой нейрона [37]. Численную плотность ПА оценивали как их число в единице площади ткани. Размер обследованной площади составлял 0,158±0,04 мм² в контроле и 0,157±0,04 мм² при шизофрении. Подсчитано 156 ПА в контроле и 129 - при шизофрении. Площади ПА, их ядра и цитоплазмы и объемную фракцию липофусциновых гранул в цитоплазме ПА оценивали на негативах при увеличении на приборе Minolta × 26 000 и с помощью наложенных на них тестовых сеток [38].

Статистический анализ проводили с помощью пакета программ Statistica 6. Нормальность распределения оцениваемых параметров в группах тестировали по критерию Колмогорова-Смирнова. Для групповых сравнений использовали однофакторный дисперсионный анализ. Для выявления возможного влияния возраста, постмортального интервала и хлорпромазинового эквивалента, длительности болезни, возраста ее начала применяли корреляционный анализ Пирсона. Влияние пола оценивали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа.

Электронно-микроскопическое исследование показало хорошую сохранность ткани ПФК в норме и при шизофрении. ПА в случаях шизофрении имели больше признаков дистрофических нарушений по сравнению с контролем, с выраженным набуханием цитоплазмы и цистерн эндоплазматического ретикулума (рис. 1).

Статистический анализ показал, что исследованные группы не различались по возрасту и постмортальному интервалу. При этом исследованные параметры не коррелировали с возрастом и постмортальным интервалом в группе шизофрении и в контроле (p>0,3), кроме Vv липофусциновых гранул в ПА, коррелирующего с возрастом в контрольной группе (r=0,52, p=0,01). Однофакторный дисперсионный анализ показал достоверное повышение среднего значения этого параметра (в 2,9 раза) у лиц старше 45 лет по сравнению с лицами моложе 45 лет в контрольной группе: F (1,35)=6,9 (p=0,01).

Групповых различий в исследованных параметрах ПА выявлено не было. Однако двухфакторный дисперсионный анализ показал достоверное влияние пола на исследованные параметры. Гендерные различия в группе шизофрении по сравнению с контролем были выявлены в площади ПА, ядра и цитоплазмы: F (1,72)=6,5; 4,9; 5,3 соответственно (p<0,05), а также в численной плотности ПА: F (1,72)=8,05 (p<0,01). Последующее апостериорное сравнение показало, что площадь ПА и его ядра была достоверно больше в подгруппе больных шизофренией женщин по сравнению с контрольной группой (+32%, p<0,01; +40%, p<0,05 соответственно) и подгруппой больных мужчин (+23%, +31% соответственно, p<0,05) (рис. 2).

Корреляционный анализ выявил достоверную положительную корреляцию площади и ядра ПА с возрастом начала болезни (r=0,49, p=0,002 и r=0,47, p=0,003 соответственно) и достоверную отрицательную корреляцию площади ядра ПА с длительностью болезни (r=0,37, p=0,02). Однофакторный дисперсионный анализ позволил обнаружить достоверно меньшую площадь ПА и цитоплазмы ПА в подгруппе с возрастом начала болезни <21 года по сравнению с подгруппой с возрастом начала болезни >21 года (–24%, p<0,05) (рис. 3).

Электронно-микроскопическое исследование случаев шизофрении по сравнению с контролем показало наличие дистрофических изменений в ПА, сходных с описанными нами ранее в гиппокампе [27] и верхних слоях ПФК [28]. Исследование численной плотности, размеров и содержания липофусцина в ПА не выявило различий между группой шизофрении и контролем. При этом исследованные параметры не коррелировали с возрастом и постмортальным интервалом в группах шизофрении и контроля, кроме Vv липофусциновых гранул в ПА, достоверно коррелирующей с возрастом в контрольной группе. Эти результаты согласуются с отсутствием корреляции числа астроцитов с возрастом [39]. Однако при анализе влияния пола на ПА были впервые показаны гендерные различия в реактивности астроцитов в ПФК при шизо­френии. В подгруппе больных шизофренией женщин численная плотность ПА была достоверно меньше, а их площадь достоверно больше по сравнению с женщинами контрольной группы и с подгруппой больных шизофренией мужчин. При этом наибольшие изменения были найдены в размере ядра ПА. Известно, что половые стероидные гормоны вовлечены в патофизиологию шизофрении. Астроциты являются важной мишенью для эстрогенов в ЦНС, поскольку экспрессируют рецепторы ERrα и Erβ на их плазматической мембране и локализованные внутриклеточно [40, 41]. Эстрогены влияют на содержание внутриклеточного кальция через его действие на глутаматные рецепторы, митохондриальный метаболизм [42-44], регулируют секрецию провоспалительных цитокинов астроцитами, которые также участвуют в регуляции эстрогенами синаптической пластичности и восстановлении после мозговых повреждений [45]. Эстроген через астроциты оказывает нейропротективное действие, влияя на функцию памяти и другие когнитивные функции, включая связанные с ПФК [46].

В связи с отмеченными гендерными особенностями астроглии необходимо напомнить, что дифференцировка этих клеток в процессе развития мозга происходит под влиянием гормонов, в частности эстрадиола. Половые различия в гормональном профиле у человека возникают пренатально и продолжаются постнатально при наиболее выраженных отличиях в перинатальном периоде [47]. Эстрадиол является главным половым стероидом, влияющим на половую дифференцировку астроцитов в аркуатном ядре гипоталамуса. У самцов млекопитающих астроциты в этом ядре имеют более звездчатую форму с густо ветвящимися отростками по сравнению с самками [48]. Астроциты могут продуцировать провоспалительные цитокины. Стимуляция липополисахаридом астроцитов коры больших полушарий от самок и самцов в культуре выявило большую продукцию астроцитами от самцов таких цитокинов, как IL-1β, IL-6, TNFα по сравнению с самками [49]. Недавние исследования показали, что уровень астроцитарного белка S-100B в сыворотке крови повышен у больных шизофренией женщин, но не мужчин [50]. Разная реактивность ПА у мужчин и женщин, больных шизофренией, выявленная в нашем исследовании, согласуется с этими данными о гендерных морфологических и функциональных особенностях астроцитов и показывает важность половых различий в их реактивности при шизофрении. В одном из последних обзоров [51] показан позитивный эффект эстрадиола в лечении шизофрении у женщин, но не мужчин. Недавние исследования показали, что эстрадиол эффективен при резистентной к терапии шизофрении [52].

Выше уже говорилось о том, что с патологией астроцитов связывают нарушение когнитивных функций. Экспериментальные исследования показали, что введение астроцитарного токсина L-α-aminoadipate в ПФК крыс приводит к нарушению рабочей памяти и обучения, сходному с нарушениями у больных шизофренией и сопровож­дающемуся снижением численной плотности астроцитов, атрофией дендритов нейронов и прогрессирующей гибелью нейронов [30]. J. Markham и соавт. [53] установили, что созревание ПФК в пубертатный период связано с полом и нарушается пренатальным стрессом, к которому самцы более чувствительны, чем самки. При этом у самцов развивается постпубертатный когнитивный дефицит, связанный с дисфункцией ПФК. У этих животных авторы с помощью метода Гольджи показали снижение ветвления дендритного дерева нейронов слоя 3 ПФК только у самцов. В связи с этими данными важно отметить выявленное нами методом Гольджи снижение ветвления дендритов пирамидных нейронов в слое 5 ПФК (поле 10) при шизофрении [31]. A. Goudriaan и соавт. [54] в генетическом ассоциативном исследовании показали, что повышенный риск возникновения шизофрении связан с генами астроцитов и олигодендроцитов. ПФК развивается сравнительно поздно, и в пубертатный период глиальные клетки играют большую роль в развитии и созревании мозга, особенно в синаптогенезе и пластичности. Вероятно, гормональная дисрегуляция в этот период может вызывать и дисрегуляцию развития астроцитов и изменять их реактивность. Эти данные позволяют предположить важную роль нарушения развития ПФК и дифференцировки астроцитов в патологии этой структуры при шизофрении, возможно, приводящей к нарушению взаимоотношений с нейронами и их гипо- или атрофии.

В связи с высказанным предположением понятными становятся полученные нами данные, касающиеся положительной корреляции площади ядра ПА с возрастом больных к периоду начала болезни и отрицательной - с длительностью болезни. Площадь ПА и цитоплазмы ПА была достоверно меньше при раннем ВНБ (<21 года) по сравнению с поздним ВНБ (>21 года). Эти данные могут свидетельствовать о незрелости астроцитов, по крайней мере в случаях с ранним возрастом пациентов к началу болезни. Наше предположение находит поддержку в молекулярно-генетических исследованиях, показавших нарушения экспрессии астроцитарных генов в ПФК при шизофрении, влияющих на реактивность этих клеток, особенно генов ростовых и нейротрофических факторов и их рецепторов [55], и в результатах H. Hagihara и соавт. [56], показавших, что паттерн изменения эксперессии генов в ПФК при шизофрении напоминает паттерн ювенильной ПФК. В связи с этим интересно отметить, что высокая экспрессия ГФКБ характерна для зрелых астроцитов, а в ПФК при шизофрении показано снижение экспрессии ГФКБ, что, возможно, связано с их незрелостью.

Наши данные о влиянии возраста пациентов к началу болезни на размеры астроцитов и их ядер согласуются также с результатами клинических и нейровизуализационных исследований. Шизофрения, начавшаяся в раннем возрасте, является наиболее тяжелой клинической формой болезни [57]. У больных с ранним началом шизофрении (в подростковом возрасте) методом диффузионно-тензорной томографии показаны задержка развития и созревания мозга и более выраженные изменения в сером и белом веществе по сравнению с началом болезни в зрелом возрасте [58], в частности нарушения сложности в формировании борозд и извилин коры больших полушарий.

У подростков при первом эпизоде психоза снижено содержание N-acetyl aspartate в ПФК, отражающее снижение функционального состояния нейронов, в том числе по данным магнитно-резонансной спектроскопии [59]. Эти данные дают основание предполагать незрелость и ареактивность астроцитов, по крайней мере при начале болезни в раннем возрасте. В пользу предположения об ареактивности ПА при раннем начале болезни у молодых больных свидетельствует также то, что по содержанию липофусцина молодые больные с ранним возрастом начала болезни не отличались от молодых лиц из контрольной группы.

В нашем исследовании не было найдено корреляции астроцитарных показателей с влиянием нейролептической терапии при ее оценке по хлорпромазиновому эквиваленту. Этот вопрос требует дальнейшего изучения, особенно в свете результатов работы G. Konopaske и соавт. [60] о снижении числа S100B-иммунореактивных астроцитов в париетальной коре приматов под воздействием нейролептиков.

Результаты нашего исследования в целом свидетельствуют о гетерогенной реакции астроцитов в ПФК при шизофрении. В связи с этим интересно отметить, что в исследовании и других авторов [23] при отсутствии различий в уровне экспрессии и содержании ГФКБ в ПФК в группе шизофрении по сравнению с контролем в подгруппе больных шизофренией с выраженными признаками воспаления была отмечена повышенная экспрессия ГФКБ мРНК и достоверная гипертрофия астроцитов. Повышенная экспрессия ГФКБ была найдена в ПФК у больных, находившихся в остром психотическом состоянии [61]. В нашем предыдущем исследовании [27] была показана связь дистрофических изменений в гиппокампе при шизофрении с длительностью болезни. Все эти данные, как и настоящее исследование, подтверждают необходимость клинико-морфологических сопоставлений в изучении патогенеза шизофрении и показывают важность исследования биологических, в частности клеточных, механизмов с учетом пола больных, а также возраста пациентов к периоду начала болезни. Эти данные могли бы быть очень важными для развития персонифицированной терапии шизофрении.

Исследование было выполнено при частичной поддержке Stanley Medical Research Institute (USA).