Механизмы формирования нестабильности генома у детей с перивентрикулярной лейкомаляцией с исходом в детский церебральный паралич

Перивентрикулярная лейкомаляция (ПВЛ) лежит в основе большинства двигательных нарушений у больных с перинатальной патологией нервной системы, в том числе и детского церебрального паралича (ДЦП) [1, 15, 17, 18]. Как показывают исследования последних лет [12, 13, 21], не у каждого ребенка, развивающегося в неблагоприятных внутриутробных условиях, формируется ПВЛ. Очевидно, решающую роль в реализации потенциально патогенного воздействия играет генетически детерминированная индивидуальная реактивность организма ребенка, определяющая повышенную «восприимчивость» структур перивентрикулярной области и других отделов головного мозга плода и новорожденного к гипоксии. В литературе [5, 6] имеются доказательства того, что одним из провоцирующих моментов стойкости двигательного дефицита при ДЦП является нестабильность генома, проявляющаяся повышением уровня эритроцитов с микроядрами (ЭМ) и лимфоцитов с перестройками хромосом. Предполагается, что в основе этого явления лежит интенсификация в организме больных ДЦП процессов мутагенеза за счет усиленной генерации эндомутагенов и ослабления антимутагенных систем защиты генома. В то же время как сами механизмы дестабилизации генома, так и процессы, их поддерживающие, остаются неясными.

Наиболее вероятными эндомутагенами в условиях хронического ишемического процесса в головном мозге могут являться продукты свободнорадикального окисления. При избыточном образовании свободные радикалы воздействуют на клетку, приводя к различным цитогенетическим повреждениям и впоследствии - к ее гибели [6, 10, 14, 16, 20]. Роль активных форм кислорода и других свободных радикалов проявляется прежде всего в окислительном повреждении ДНК - носителе наследственной информации и исходной матрицы для синтеза белков организма в целом, что может явиться причиной ряда хромосомных аберраций и мутацией некоторых генов в клетках человека [10]. Контроль над избыточной выработкой активных форм кислорода осуществляет антиоксидантная система, к которой относятся: супероксиддисмутаза (СОД), каталаза (КАТ), пероксидаза, церулоплазмин, глутатионпероксидаза, глутатионтрансфераза и др. [2, 8].

В последние годы в литературе [5] появились сообщения о наличии у больных ДЦП высокого уровня цитогенетических нарушений в клетках периферической крови. Механизмы формирования нестабильности генома при ДЦП остаются малоизученными. Известно, что нестабильность генома может поддерживать стойкость двигательного дефицита у детей со спаcтическими формами заболевания, препятствуя успешной реабилитационной терапии. Дальнейшие исследования патогенетических звеньев формирования ДЦП у детей с ПВЛ должны уточнить механизмы, поддерживающие тяжесть заболевания и препятствующие эффективности лечебных мероприятий. Это позволит целенаправленно воздействовать на выявленные процессы, участвующие в формировании грубых двигательных нарушений, обоснованно назначать медикаментозную терапию и улучшать качество жизни пациентов.

Цель настоящего исследования - изучение взаимосвязи уровня ЭМ и интенсивности процессов свободнорадикального окисления, активности ферментов антиоксидантной защиты у детей с ранней резидуальной стадией ДЦП.

Обследован 51 ребенок (24 мальчика и 27 девочек в возрасте 1-5 лет) со спастической диплегией. Дети находились на стационарном лечении в неврологическом отделении Детской республиканской клинической больницы Министерства здравоохранения Республики Татарстан.

Критерием включения больных в исследование явилось выявление при нейровизуализации - с использованием нейросонографии, магнитно-резонансной томографии (МРТ) и рентгеновской компьютерной томографии (КТ) только ПВЛ, без другой патологии, и отсутствие медикаментозного лечения и инфекционного процесса в течение 30 дней.

Группу контроля составили 20 здоровых детей. Обе группы были сопоставимы по полу и возрасту.

Цитогенетическое исследование эритроцитов периферической крови проводили с использованием микроядерного теста [19]. Забор крови для исследования производился в 1-й день поступления больного в стационар до начала лечения. Мазки периферической крови окрашивались по Романовскому-Гимзе при pН 6,8 в течение 20 мин, затем хорошо промывались. У каждого пациента просматривалось 20 000 эритроцитов, среди которых подсчитывались ЭМ. Количество ЭМ выражалось в процентах от общего числа просмотренных эритроцитов.

Биохимическим методом в центральной научно-исследовательской лаборатории Казанского государственного медицинского университета по стандартным методикам исследовались активность СОД [7], КАТ [9] и пероксидазы [11] в гемолизате крови; гидроперекиси липидов [3] и малонового диальдегида (МДА) в плазме [4].

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием параметрического t-критерия Стьюдента, непараметрического t-критерия Манна-Уитни и корреляционного анализа с помощью программы Origin 6.1.

При цитогенетическом исследовании было выявлено повышенное количество ЭМ у каждого обследованного ребенка с ДЦП, которое достоверно (p<0,001) превышало показатель спонтанного мутагенеза (табл. 1).

Исследование активности ферментов антирадикальной защиты (СОД, КАТ, пероксидаза) в крови у больных ПВЛ с исходом в ДЦП обнаружило их высокий уровень по сравнению с группой контроля, свидетельствующий об активации свободнорадикальных процессов. У детей с ПВЛ отмечена значительная активность СОД - ключевого фермента антиоксидантной защиты. Обнаружены достоверные различия показателей активности СОД (p<0,05) и КАТ (p<0,05) у детей со спастической диплегией по сравнению со здоровыми (см. табл. 1). Выявлена тенденция преобладания активности пероксидазы в эритроцитах крови у обследованных детей с ДЦП по сравнению с контролем, но достоверных различий не получено (p>0,05).

Изучение содержания продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) выявило у больных ДЦП повышение как первичного - гидроперекиси липидов, так и вторичного - МДА продуктов, взаимодействующих с тиобарбитуровой кислотой в сыворотке крови. В группе детей с ПВЛ выявлено достоверно более высокое (р<0,002) содержание МДА по сравнению с контролем (см. табл. 1). Уровень гидроперекиси липидов оказался повышенным, но достоверных различий с группой здоровых не обнаружено. Возможно, это связано с тем, что гидроперекись липидов является неустойчивым продуктом и быстро переходит в более устойчивый и токсичный продукт - МДА.

На основании выявленного повышения активности ферментов антирадикальной защиты и продуктов ПОЛ (МДА) можно судить о течении выраженного окислительного стресса у детей с ПВЛ, больных ДЦП.

Полученные результаты биохимического и цитогенетического исследования свидетельствуют о наличии у детей с ПВЛ двух одновременно протекающих патологических процессов. С одной стороны, это - повышение интенсивности процессов свободнорадикального окисления, с другой - нестабильность генома с большим количеством цитогенетических перестроек.

Для оценки взаимосвязи цитогенетического статуса и активности процессов свободнорадикального окисления проведен корреляционный анализ этих показателей у больных ПВЛ с исходом в ДЦП. Оказалось, что оба процесса взаимосвязаны друг с другом: активность СОД обратно коррелирует с числом ЭМ (r=–0,601), а по содержанию МДА и активности КАТ выявлена прямая корреляция с числом эритроцитов с перестройками (r=0,67 и r=0,605 соответственно) (рис. 1, 2).

Результаты анализа проведенных исследований свидетельствуют о том, что у больных ПВЛ с исходом в ДЦП нестабильность генома формируется на фоне активации свободнорадикальных процессов. Выраженные процессы свободнорадикального окисления провоцируют эндомутагенез, приводят к анеугенному эффекту в клетках организма больных ДЦП. Не исключено, что патологические изменения в перивентрикулярной области могут поддерживать и, возможно, даже инициировать эндомутагенез в организме детей с ПВЛ. Полученные результаты позволяют предположить, что окислительный стресс приводит к дестабилизации клеточного генома у детей с ПВЛ с исходом в ДЦП и поддерживает процессы, протекающие (а может и исходящие) в перивентрикулярной области. Эти процессы способствуют утяжелению имеющихся и появлению новых патологических звеньев метаболизма у больного. Вышеизложенное диктует необходимость поиска дополнительных путей фармакологической коррекции окислительного стресса и цитогенетических нарушений у детей с ПВЛ.

Учитывая активно протекающие процессы свободнорадикального окисления и эндомутагенеза в организме больных ПВЛ с исходом в ДЦП, дальнейшей тактикой нашего исследования была попытка коррекции этих нарушений. Для этого был выбран препарат, обладающий и нейротропным, и антиоксидантным действием, - кортексин. В результате рандомизации были выделены 20 больных ПВЛ с исходом в спастическую диплегию, которым была проведена монотерапия кортексином в течение 20 дней в дозе 0,5 мг/кг в сутки. Забор крови для исследования оксидантного статуса и уровня ЭМ осуществлялся в день начала терапии (до лечения) и через 20 дней проведенного лечения.

Исследование антиоксидантного статуса на фоне терапии кортексином показало достоверное снижение активности ферментов антирадикальной защиты по сравнению с показателями до лечения: СОД - на 33,3% (p<0,05) и КАТ - на 10% (p<0,05) (табл. 2).

Проведенное исследование продемонстрировало антирадикальное и антимутагенное действие кортексина, проявляющееся в уменьшении активности процессов свободнорадикального окисления и эндомутагенеза у больных.

Таким образом, окислительный стресс у детей с ПВЛ с исходом в ДЦП имеет важное значение как в инициации патологического процесса, так и в его прогрессировании. ПВЛ формируется на фоне гипоксического процесса в перинатальном периоде, который и запускает свободнорадикальное окисление. Не исключено, что окислительный стресс способствует развитию некроза белого вещества перивентрикулярных зон головного мозга. В дальнейшем, при отсутствии адекватной терапии, ингибирующей окислительный стресс, присоединяется дегенерация астроцитов с пролиферацией микроглии и скоплением липидсодержащих макрофагов в некротизированной ткани. Так как перивентрикулярная область является матричной областью для нервных клеток, ее некротические изменения приводят к нарушению дифференциации нервных клеток и, следовательно, к грубым неврологическим последствиям. Положительная динамика процессов свободнорадикального окисления на фоне терапии кортексином свидетельствует о том, что препарат снижает активность ПОЛ и замедляет процессы оксидантного эндомутагенеза в организме детей с ПВЛ. Антирадикальные и антимутагенные свойства кортексина уменьшают цитотоксическое действие свободных радикалов на геном клетки, снижая нестабильность генома у больных ПВЛ с исходом в ДЦП и соответственно препятствуя прогрессированию заболевания.