Болезнь Паркинсона (БП) - хроническое нейродегенеративное заболевание, характеризующееся нарушениями двигательной активности - тремором, ригидностью, брадикинезией, а на поздней стадии и когнитивными расстройствами [2]. Высокая распространенность этого заболевания и большие финансовые затраты на реабилитацию и лечение больных делают это заболевание социально значимым [13, 15, 19]. Дегенерация дофаминергических нейронов черной субстанции (ЧС) приводит к деафферентации стриатума, что является ключевым звеном патогенеза БП [4, 14]. Этот процесс протекает у больных в течение десятилетий без клинических проявлений, что, вероятно, объясняется включением компенсаторных механизмов [42]. Действительно, первые симптомы появляются у больных БП только после дегенерации 50-60% дофаминергических нейронов в ЧС и снижения уровня дофамина в стриатуме на 70-80%, т.е. на поздней стадии развития заболевания [6, 23, 24, 32]. Поскольку лечение больного начинается только в это время, оно не настолько эффективно, как могло бы быть на ранних этапах развития болезни. Поэтому необходима разработка преклинической диагностики и превентивного лечения БП, чему должно предшествовать экспериментальное моделирование этого заболевания в преклинической (досимптомной) стадии. Создание такой модели позволит исследовать компенсаторные процессы, включающиеся в нигростриатной системе, а также идентифицировать эндогенные маркеры паркинсонизма и разработать методы его превентивной терапии.

Целью данной работы явилось моделирование преклинической и ранней клинической стадии БП (сразу же после появления изменений моторного поведения) на мышах путем системного введения 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МФТП) - специфического нейротоксина дофаминергических нейронов - и ее комплексный анализ.

В работе использовано 80 мышей-самцов линии C57BL/6 в возрасте 2,5-3 мес, с массой тела 22-26 г. У всех животных за день до введения и на 14-й день после введения МФТП оценивали моторное поведение в тесте «открытое поле» в автоматизированном режиме с помощью системы Opto-Varimex-3 («Columbus instruments», США), измеряя в течение 3 мин пройденный путь, время без движений, число вертикальных стоек [22]. Дополнительно определяли длину шага, когда животное двигалось по прямой линии [39].

Животным подкожно вводили МФТП в дозе 12 мг/кг в 1-м эксперименте двухкратно (2x12 мг/кг), во 2-м - четырехкратно (4x12 мг/кг) с 2-часовым интервалом. В контроле вводили физраствор (0,9% NaCl). Все манипуляции с животными были проведены в соответствии с протоколом, утвержденным комитетом по охране животных Института биологии развития РАН, находящимся в соответствии с национальными и международными требованиями.

Через 2 нед после введения МФТП животных декапитировали, извлекали мозг, разрезали его по среднесагиттальной плоскости. Из правой половины мозга выделяли ЧС и стриатум. Кусочки взвешивали, охлаждали в жидком азоте и хранили при –70°С до проведения высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией моноаминов и метаболитов. Левую половину мозга фиксировали иммерсией в 4% параформальдегиде 12 ч при 4°С. Затем мозг промывали в фосфатно-солевом буфере, инкубировали в 20% сахарозе 48 ч и замораживали в гексане, охлажденном до –40°С. Замороженный материал хранили при –70°С до дальнейшего морфологического исследования.

Определение содержания дофамина, дигидроксифенилуксусной кислоты (ДОФУК), гомованилиновой кислоты (ГВК), серотонина (5-гидрокситрипатамина, 5-ГТ) и норадреналина в стриатуме и в ЧС проводили с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией по методике, описанной ранее [41]. В окончательном виде представлены изменения содержания этих веществ в ЧС и их концентраций в стриатуме в опыте по отношению к контролю, принятому за 100%.

Часть материала была использована для двойного иммунофлюоресцентного мечения нервных волокон стриатума, в которых выявляли тирозингидроксилазу (ТГ) и декарбоксилазу ароматических аминокислот (ДАА) на «плавающих» срезах (30 мкм) замороженного мозга. Иммуногистохимическую реакцию проводили в соответствии с методикой, описанной ранее [1].

Вторая часть материала была использована для пероксидазного моно-иммуномечения ТГ, первого скорость-лимитирующего фермента синтеза дофамина, в нейронах компактной части ЧС. На криостате Leica (Германия) приготавливали фронтальные серийные срезы в области ЧС толщиной 20 мкм и монтировали их на предметные стекла. На одно стекло монтировали срезы от контрольного и опытного животных. Далее иммуногистохимическое выявление ТГ проводили в соответствии с методикой, описанной ранее [5].

Срезы стриатума с двойным флюоресцентным иммуногистохимическим мечением ТГ и ДАА исследовали в конфокальном микроскопе Leica TCS 4D (Германия). На «оптических» срезах толщиной 0,12 мкм с помощью программы ImageJ подсчитывали количество биферментных терминалей ТГ(+)/ДАА(+) в 4 условно обозначенных областях дорсального стриатума, а именно в их центральной зоне площадью 900 мкм². Срезы ЧС после пероксидазного моноиммуномечения ТГ исследовали в световом микроскопе Olympus BX51 (Япония), оснащенном цифровой камерой Olympus DP70 (Япония) при увеличении объектива x10. Анализ изображений срезов осуществляли с помощью программы АnalySIS 5.0. (Olympus, Япония). На каждом срезе обводили область «компактной части» ЧС, содержащей тела дофаминергических нейронов, в соответствие с атласом [30] и рекомендациями [28]. После этого подсчитывали количество нейронов, причем только с видимым ядром.

Полученные данные обрабатывали статистически с помощью F-теста для определения однородности выборки и теста Стьюдента для определения достоверности различий.

Поведение. Через 14 дней после двухкратного введения МФТП в дозе 12 мг/кг (2x12 мг/кг) в опыте и физраствора в контроле у мышей отсутствовали различия по всем показателям моторного поведения (см. таблицу).

Биохимический анализ дофамина и метаболитов в стриатуме и ЧС. При расчете содержания определяемых веществ в опыте по отношению к содержанию этих веществ в контроле, принятому за 100%, оказалось, что после введения МФТП в дозе 2x12 мг/кг в стриатуме происходило снижение уровня дофамина на 51%, ДОФУК на 36%, ГВК на 30%. При этом увеличилось соотношение ДОФУК/ДА на 52%, а ГВК/ДА - на 58% (р<0,05) (рис. 1, А).

Количественный иммуноцитохимический анализ аксонов в стриатуме. В контроле в стриатуме обнаружены многочисленные терминали, содержащие оба фермента синтеза дофамина - ТГ и ДАА (рис. 2, А, Б).

Количественный анализ дофаминергических нейронов в компактной части ЧС. При введении МФТП в дозе 2x12 мг/кг в ЧС наблюдалось снижение количества нейронов на 26%, а при дозе МФТП 4x12 мг/кг - на 43% (см. рис. 3, Б).

Методологические вопросы. Задачей данного исследования являлась разработка экспериментальной модели досимптомной и ранней симптомной стадий паркинсонизма, вызванного путем многократных введений в малых дозах МФТП, специфического нейротоксина дофаминергических нейронов. МФТП после системного введения в организм поступает в общую систему циркуляции, проходит через гематоэнцефалический барьер, захватывается астроцитами, в которых превращается сначала с помощью моноаминооксидазы (МАО) Б в 1-метил-4-фенил-дигидроксипиридин (МФДП), а затем либо в самом астроците, либо за его пределами спонтанно окисляется в МФП+ - активный токсин. МФП+, обладая структурным сходством с дофамином, захватывается из межклеточной среды в дофаминергические нейроны с помощью мембранного транспортера дофамина [40], нарушает окислительное фосфорилирование и вызывает дегенерацию нейрона [27, 34].

Моделирование паркинсонизма с помощью МФТП было выбрано нами по нескольким причинам. Во-первых, МФП+ сходен по структуре с N-метил-норсалсолинолом, специфическим эндогенным нейротоксином, который был обнаружен в спинномозговой жидкости и ЧС у людей с БП и способен вызывать дегенерацию дофаминергических нейронов нигростриатной системы [26]. In vitro это вещество снижает активность ТГ в стриатуме крыс и оказывает повреждающее действие на ДНК нейронов [35], что может являться одной из причин гибели дофаминергических нейронов. Во-вторых, после введения МФТП возникают изменения моторного поведения (мышечная ригидность) у мышей, похожие по характеру на нарушения двигательной активности у человека при БП. В-третьих, на сегодняшний день существует несколько работ, доказывающих токсическое действие МФП+ одновременно на многие катехоламинергические системы мозга у мышей, а возможно, и на весь организм, что пока не показано на животных. Следует также отметить, что нарушения в работе всех систем организма являются важной характеристикой патогенеза БП у человека [8, 33].

Хотя моделирование паркинсонизма на мышах широко используется, в литературе в основном описано моделирование БП под действием больших доз нейротоксинов, при которых нигростриатная система быстро дегенерирует (для мышей - МФТП 40 мг/кг и более), что сопровождается грубыми изменениями моторного поведения [9, 12, 38]. При этом компенсаторные механизмы не успевают развиться в полной мере, а сами модели воспроизводят позднюю фазу клинической стадии БП у человека. Как мы обнаружили ранее при использовании гораздо более низких доз нейротоксина, введение МФТП в дозе 16 мг/кг приводит к развитию досимптомной стадии паркинсонизма, сопровождающейся дегенерацией аксонов дофаминергических нейронов в стриатуме, но не тел нейронов в ЧС. В незначительно более высокой дозе - 20 мг/кг - МФТП уже вызывает развитие симптомной стадии на фоне дегенерации не только аксонов в стриатуме, но и тел дофаминергических нейронов в ЧС [3]. Тем не менее нам не удалось получить адекватную модель БП в преклинической стадии, вызванную дегенерацией не только аксонов, но и тел дофаминергических нейронов, при однократном введении нейротоксина. Для достижения этого эффекта в данной работе была использована доза МФТП 12 мг/кг, при которой происходит дегенерация только дофаминергических аксонов в стриатуме [1], однако его действие пролонгировали за счет повторного введения через 2 ч.

Важно подчеркнуть, данная работа является одной из первых, в которой использован комплексный методический подход к анализу экспериментальной модели БП. Действительно, количество такого рода исследований крайне ограничено, причем до сих пор в них давалась оценка только поздней фазы клинической стадии БП [16, 21]. Анализ материала в данной работе проводили через 2 нед после введения МФТП, поскольку именно к этому времени заканчиваются спровоцированные нейродегенеративные процессы [25].

Поскольку нами моделируется дегенерация нигростриатных дофаминергических нейронов, для оценки их функционального состояния в качестве маркера была выбрана ТГ. Для тел нейронов в ЧС этот маркер является необходимым и достаточным, поскольку в этой области содержатся только дофаминергические нейроны. Для выявления дофаминергических волокон в стриатуме было использовано двойное мечение обоих ферментов синтеза дофамина - ТГ и ДАА. Хотя эти же ферменты содержатся и в норадренергических волокнах, их количество в стриатуме у мышей несоизмеримо меньше количества дофаминергических волокон [17], что позволяет ими пренебречь при дальнейшем подсчете дофаминергических волокон. ДАА также содержится в серотонинергических волокнах, количество которых в стриатуме довольно велико [31], однако эти волокна не содержат ТГ.

Досимптомная стадия паркинсонизма. Через 2 нед после введения МФТП в дозе 2x12 мг/кг изменения моторного поведения отсутствовали. При этом концентрация дофамина в стриатуме снизилась на 57%, т. е. не достигла порогового уровня снижения на 70-80%, при котором появляются первые нарушения моторики [7]. Интересно, что уровни ДОФУК и ГВК в стриатуме падают в меньшей степени, следовательно, увеличились отношения ДОФУК/ДА и ГВК/ДА. Эти данные косвенно свидетельствуют об увеличении активности основного фермента деградации дофамина - МАО, что плохо согласуется с литературными данными [20] и требует дальнейшего анализа. Исходя из того, что в опыте уровень дофамина и содержание дофаминергических аксонов снижаются на одну и ту же величину - 57% - следует, что среднее содержание дофамина в единичном аксоне не меняется в опыте по сравнению с контролем.

В отличие от стриатума, в ЧС уровень дофамина и его метаболитов (за исключением ГВК), а также отношения между ними остаются без изменений при введении МФТП в дозе 2x12 мг/кг. Увеличение уровня ГВК при неизменном уровне ДОФУК, возможно, связано с усилением активности катехол-О-метил-трансферазы, которая также расщепляет дофамин, но без образования ДОФУК. В отличие от аксонов в стриатуме, число нейронов в ЧС уменьшилось на 28% при неизменном общем содержании в них дофамина. Это означает, что содержание дофамина в сохранившихся в опыте дофаминергических нейронах выше, чем в контроле, на 77%.

С помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией определяется преимущественно внутриклеточное содержание дофамина. В досимптомной стадии паркинсонизма на фоне повышенного содержания дофамина в телах нейронов ЧС наблюдается его нормальный уровень содержания внутри аксонов стриатума, так как процент дегенерации волокон равен проценту падения дофамина. Это может быть результатом усиления деградации дофамина посредством МАО-А, о чем косвенно свидетельствуют увеличение отношений ДОФУК/ДА и ГВК/ДА, увеличение скорости выделения дофамина из сохранившихся в опыте аксонов или снижение скорости обратного захвата дофамина в нейроны из межклеточного пространства. В отличие от аксонов в стриатуме, в телах этих нейронов в ЧС в опыте увеличено содержание дофамина, что скорее всего является результатом усиления его синтеза за счет увеличения экспрессии и/или активности ТГ.

Симптомная стадия паркинсонизма. Через 2 нед после введения МФТП в дозе 4x12 мг/кг наблюдались изменения моторного поведения, причем только по 2 наиболее чувствительным тестам - по длине шага и длине пробега. Следовательно, при данной дозе моделируется ранняя фаза клинической стадии БП. Падение дофамина в стриатуме в этом эксперименте составило 75%, т.е. достигло порогового уровня, при котором у человека начинают проявляться симптомы БП [6]. При этом число дофаминергических волокон снизилось на 68%. В большей степени по сравнению с предыдущим опытом снизилась и концентрация продуктов деградации дофамина (ДОФУК и ГВК). При этом отношение продуктов деградации дофамина к самому дофамину возросло.

При введении МФТП в дозе 4x12 мг/кг в ЧС не изменяется общее содержание дофамина, а число нейронов уменьшается на 43%. Это означает, что как и при дозе МФТП 2x12 мг/кг, при дозе 4 12 мг/кг внутринейрональное содержание дофамина увелчивается более чем на 70%. В отличие от опыта с введением МФТП в дозе 2x12 мг/кг, при введении 4x12 мг/кг уменьшается концентрация продуктов деградации дофамина, что, возможно, обусловлено снижением активности МАО.

Результаты наших экспериментов показали, что дофаминергические волокна стриатума подвержены дегенерации в большей степени, чем тела нейронов ЧС. Очевидно, это является результатом более выраженного токсического влияния МФП+ на аксоны, чем на тела нейронов, и объясняется более высокой концентрацией мембранного транспортера дофамина в аксонах по сравнению с телами нейронов [29]. При таком распределении мембранного транспортера дофамина МФП+ должен в большей степени захватываться в аксоны, чем в тела нейронов [37]. Это означает, что дегенерацию тел нейронов, малочувствительных к действию нейротоксина, можно вызвать путем либо увеличения однократной дозы, либо пролонгирования действия токсина, используемого в относительно небольшой дозе. Последний подход и был использован в данной работе.

Предполагается, что после того, как МФП+ захватывается в дофаминергические нейроны на уровне терминалей аксонов, он путем ретроградного аксоплазматического транспорта может со временем достигать тел нейронов и также вызывать их гибель [10, 36]. Нельзя исключить и возможность того, что дегенерация нейронов, начавшаяся на уровне аксонов, может быть обратимой и со временем сопровождаться образованием новых аксонов. Приведенные данные позволяют предположить, что при относительно низкой межклеточной концентрации гипотетического эндогенного фактора - специфического нейротоксина дофаминергических нейронов у человека при БП, преклиническая стадия заболевания также, как и на экспериментальной модели, начинается с дегенерации аксонов, обладающих большей способностью к захвату этого токсина по сравнению с телами нейронов. Также в литературе имеются данные о том, что увеличение окисления дофамина в стриатуме вызывает повышение уровня свободных радикалов, которые запускают гибель клетки [11]. Кроме того, дофаминергические нейроны компактной части ЧС имеют дефицит антиоксидантной системы, например, таких ее компонентов, как Ca²⁺-связывающего протеина и глютатион-синтетазы [18]. Согласно существующим представлениям [23], при значительном повреждении нигростриатной системы могут включаться процессы запрограммированной клеточной гибели, в основе которых лежит вышеописанный механизм.

Таким образом, на мышах с помощью МФТП смоделирована преклиническая стадия БП, при которой наблюдается снижение числа дофаминергических аксонов в стриатуме и тел нейронов в ЧС без изменения моторного поведения, а также ранняя фаза клинической стадии, при которой усиливаются метаболические и органические изменения в нигростриатных дофаминергических нейронах, что сопровождается первыми проявлениями нарушения моторных функций.