Хаиндрава В.Г.

Институт нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАМН

Козина Е.А.

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Кучеряну В.Г.

Институт общей патологии и патофизиологии РАМН

Крыжановский Г.Н.

Кудрин В.С.

Институт фармакологии им. В.В. Закусова РАМН, Москва

Клодт П.Д.

Институт фармакологии им. В.В. Закусова РАМН, Москва

Бочаров Е.В.

Институт фармакологии им. В.В. Закусова РАМН, Москва

Раевский К.С.

Институт нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАМН; Институт фармакологии им. В.В. Закусова РАМН, Москва

Угрюмов М.В.

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, Москва

Моделирование преклинической и ранней клинической стадий болезни Паркинсона

Журнал: Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2010;110(7): 41-47

Просмотров : 27

Загрузок : 1

Как цитировать

Хаиндрава В. Г., Козина Е. А., Кучеряну В. Г., Крыжановский Г. Н., Кудрин В. С., Клодт П. Д., Бочаров Е. В., Раевский К. С., Угрюмов М. В. Моделирование преклинической и ранней клинической стадий болезни Паркинсона. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2010;110(7):41-47.

Авторы:

Хаиндрава В.Г.

Институт нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАМН

Все авторы (9)

Болезнь Паркинсона (БП) - хроническое нейродегенеративное заболевание, характеризующееся нарушениями двигательной активности - тремором, ригидностью, брадикинезией, а на поздней стадии и когнитивными расстройствами [2]. Высокая распространенность этого заболевания и большие финансовые затраты на реабилитацию и лечение больных делают это заболевание социально значимым [13, 15, 19]. Дегенерация дофаминергических нейронов черной субстанции (ЧС) приводит к деафферентации стриатума, что является ключевым звеном патогенеза БП [4, 14]. Этот процесс протекает у больных в течение десятилетий без клинических проявлений, что, вероятно, объясняется включением компенсаторных механизмов [42]. Действительно, первые симптомы появляются у больных БП только после дегенерации 50-60% дофаминергических нейронов в ЧС и снижения уровня дофамина в стриатуме на 70-80%, т.е. на поздней стадии развития заболевания [6, 23, 24, 32]. Поскольку лечение больного начинается только в это время, оно не настолько эффективно, как могло бы быть на ранних этапах развития болезни. Поэтому необходима разработка преклинической диагностики и превентивного лечения БП, чему должно предшествовать экспериментальное моделирование этого заболевания в преклинической (досимптомной) стадии. Создание такой модели позволит исследовать компенсаторные процессы, включающиеся в нигростриатной системе, а также идентифицировать эндогенные маркеры паркинсонизма и разработать методы его превентивной терапии.

Целью данной работы явилось моделирование преклинической и ранней клинической стадии БП (сразу же после появления изменений моторного поведения) на мышах путем системного введения 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МФТП) - специфического нейротоксина дофаминергических нейронов - и ее комплексный анализ.

Материал и методы

В работе использовано 80 мышей-самцов линии C57BL/6 в возрасте 2,5-3 мес, с массой тела 22-26 г. У всех животных за день до введения и на 14-й день после введения МФТП оценивали моторное поведение в тесте «открытое поле» в автоматизированном режиме с помощью системы Opto-Varimex-3 («Columbus instruments», США), измеряя в течение 3 мин пройденный путь, время без движений, число вертикальных стоек [22]. Дополнительно определяли длину шага, когда животное двигалось по прямой линии [39].

Животным подкожно вводили МФТП в дозе 12 мг/кг в 1-м эксперименте двухкратно (2x12 мг/кг), во 2-м - четырехкратно (4x12 мг/кг) с 2-часовым интервалом. В контроле вводили физраствор (0,9% NaCl). Все манипуляции с животными были проведены в соответствии с протоколом, утвержденным комитетом по охране животных Института биологии развития РАН, находящимся в соответствии с национальными и международными требованиями.

Через 2 нед после введения МФТП животных декапитировали, извлекали мозг, разрезали его по среднесагиттальной плоскости. Из правой половины мозга выделяли ЧС и стриатум. Кусочки взвешивали, охлаждали в жидком азоте и хранили при –70°С до проведения высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией моноаминов и метаболитов. Левую половину мозга фиксировали иммерсией в 4% параформальдегиде 12 ч при 4°С. Затем мозг промывали в фосфатно-солевом буфере, инкубировали в 20% сахарозе 48 ч и замораживали в гексане, охлажденном до –40°С. Замороженный материал хранили при –70°С до дальнейшего морфологического исследования.

Определение содержания дофамина, дигидроксифенилуксусной кислоты (ДОФУК), гомованилиновой кислоты (ГВК), серотонина (5-гидрокситрипатамина, 5-ГТ) и норадреналина в стриатуме и в ЧС проводили с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией по методике, описанной ранее [41]. В окончательном виде представлены изменения содержания этих веществ в ЧС и их концентраций в стриатуме в опыте по отношению к контролю, принятому за 100%.

Часть материала была использована для двойного иммунофлюоресцентного мечения нервных волокон стриатума, в которых выявляли тирозингидроксилазу (ТГ) и декарбоксилазу ароматических аминокислот (ДАА) на «плавающих» срезах (30 мкм) замороженного мозга. Иммуногистохимическую реакцию проводили в соответствии с методикой, описанной ранее [1].

Вторая часть материала была использована для пероксидазного моно-иммуномечения ТГ, первого скорость-лимитирующего фермента синтеза дофамина, в нейронах компактной части ЧС. На криостате Leica (Германия) приготавливали фронтальные серийные срезы в области ЧС толщиной 20 мкм и монтировали их на предметные стекла. На одно стекло монтировали срезы от контрольного и опытного животных. Далее иммуногистохимическое выявление ТГ проводили в соответствии с методикой, описанной ранее [5].

Срезы стриатума с двойным флюоресцентным иммуногистохимическим мечением ТГ и ДАА исследовали в конфокальном микроскопе Leica TCS 4D (Германия). На «оптических» срезах толщиной 0,12 мкм с помощью программы ImageJ подсчитывали количество биферментных терминалей ТГ(+)/ДАА(+) в 4 условно обозначенных областях дорсального стриатума, а именно в их центральной зоне площадью 900 мкм2. Срезы ЧС после пероксидазного моноиммуномечения ТГ исследовали в световом микроскопе Olympus BX51 (Япония), оснащенном цифровой камерой Olympus DP70 (Япония) при увеличении объектива x10. Анализ изображений срезов осуществляли с помощью программы АnalySIS 5.0. (Olympus, Япония). На каждом срезе обводили область «компактной части» ЧС, содержащей тела дофаминергических нейронов, в соответствие с атласом [30] и рекомендациями [28]. После этого подсчитывали количество нейронов, причем только с видимым ядром.

Полученные данные обрабатывали статистически с помощью F-теста для определения однородности выборки и теста Стьюдента для определения достоверности различий.

Результаты

Поведение. Через 14 дней после двухкратного введения МФТП в дозе 12 мг/кг (2x12 мг/кг) в опыте и физраствора в контроле у мышей отсутствовали различия по всем показателям моторного поведения (см. таблицу).

После введения МФТП в дозе 4x12 мг/кг показатели число стоек и время без движений не изменились, однако произошло уменьшение длины пробега на 42% и длины шага на 23% относительно контроля (см. таблицу).

Биохимический анализ дофамина и метаболитов в стриатуме и ЧС. При расчете содержания определяемых веществ в опыте по отношению к содержанию этих веществ в контроле, принятому за 100%, оказалось, что после введения МФТП в дозе 2x12 мг/кг в стриатуме происходило снижение уровня дофамина на 51%, ДОФУК на 36%, ГВК на 30%. При этом увеличилось соотношение ДОФУК/ДА на 52%, а ГВК/ДА - на 58% (р<0,05) (рис. 1, А).

Рисунок 1. Содержание дофамина (ДА), дигидроксифенилуксусной кислоты (ДОФУК), гомованилиновой кислоты (ГВК) и соотношения ДОФУК/ДА и ГВК/ДА (в усл. ед.) в стриатуме (А, В) и черной субстанции (Б, Г) через 14 дней после введения МФТП в дозах 2x12 мг/кг (А, Б) и 4x12 мг/кг (В, Г). По оси ординат - концентрация/содержание веществ в контроле (приняты за 100%). * - достоверность различий с контролем - р<0,05. Здесь и на рис. 3: белые столбцы - физиологический раствор (0,9% NaCl), черные - МФТП.
В ЧС не изменялось содержание ДОФУК и норадреналина, наблюдалась тенденция к увеличению уровня дофамина и происходило увеличение содержания ГВК на 50% и 5-ГТ на 67% (см. рис. 1, Б). После введения МФТП в дозе 4x12 мг/кг в стриатуме происходило снижение концентрации дофамина на 75%, ДОФУК на 40%, ГВК на 45% и увеличение соотношений ДОФУК/ДА на 155% и ГВК/ДА на 135% (р<0,05) (см. рис. 1, В). В ЧС не изменялся уровень дофамина, происходило снижение содержания ДОФУК на 27%, ГВК на 23%, и падение соотношений ДОФУК/ДА на 26% и ГВК/ДА на 21% (см. рис. 1, Г).

Количественный иммуноцитохимический анализ аксонов в стриатуме. В контроле в стриатуме обнаружены многочисленные терминали, содержащие оба фермента синтеза дофамина - ТГ и ДАА (рис. 2, А, Б).

Рисунок 2. ТГ-иммунореактивные (А, В) и ДАА-иммунореактивные (Б, Г) волокна в стриатуме в контроле (А, Б) и после введения МФТП в дозе 2x12 мг/кг (В, Г). ТГ-иммунореактивные нейроны в компактной части черной субстанции (пунктир) в контроле (Д) и после введения МФТП в дозе 2x12 мг/кг (Е). Стрелками показаны волокна, содержащие оба фермента синтеза дофамина - ТГ и ДАА. кччс - компактная часть черной субстанции, рччс - ретикулярная часть черной субстанции, вто - вентральная тегментная область. Масштаб для А-Г- 16 мкм, для Д, Е - 100 мкм.
Через 14 дней после введения МФТП в дозе 2x12 мг/кг плотность (количество волокон на единицу площади) биферментных терминалей уменьшилась на 59% (см. рис. 2, В, Г). После введения МФТП в дозе 4x12 мг/кг наблюдалось снижение плотности биферментных терминалей на 68% (рис. 3, А).
Рисунок 3. Количество ТГ-иммунореактивных нейронов в черной субстанции (А) и биферментных терминалей (Б) в стриатуме. По оси ординат - количество волокон на срезе (А) и нейронов в ЧС (Б). * - достоверность различий с контролем - р<0,05.

Количественный анализ дофаминергических нейронов в компактной части ЧС. При введении МФТП в дозе 2x12 мг/кг в ЧС наблюдалось снижение количества нейронов на 26%, а при дозе МФТП 4x12 мг/кг - на 43% (см. рис. 3, Б).

Обсуждение

Методологические вопросы. Задачей данного исследования являлась разработка экспериментальной модели досимптомной и ранней симптомной стадий паркинсонизма, вызванного путем многократных введений в малых дозах МФТП, специфического нейротоксина дофаминергических нейронов. МФТП после системного введения в организм поступает в общую систему циркуляции, проходит через гематоэнцефалический барьер, захватывается астроцитами, в которых превращается сначала с помощью моноаминооксидазы (МАО) Б в 1-метил-4-фенил-дигидроксипиридин (МФДП), а затем либо в самом астроците, либо за его пределами спонтанно окисляется в МФП+ - активный токсин. МФП+, обладая структурным сходством с дофамином, захватывается из межклеточной среды в дофаминергические нейроны с помощью мембранного транспортера дофамина [40], нарушает окислительное фосфорилирование и вызывает дегенерацию нейрона [27, 34].

Моделирование паркинсонизма с помощью МФТП было выбрано нами по нескольким причинам. Во-первых, МФП+ сходен по структуре с N-метил-норсалсолинолом, специфическим эндогенным нейротоксином, который был обнаружен в спинномозговой жидкости и ЧС у людей с БП и способен вызывать дегенерацию дофаминергических нейронов нигростриатной системы [26]. In vitro это вещество снижает активность ТГ в стриатуме крыс и оказывает повреждающее действие на ДНК нейронов [35], что может являться одной из причин гибели дофаминергических нейронов. Во-вторых, после введения МФТП возникают изменения моторного поведения (мышечная ригидность) у мышей, похожие по характеру на нарушения двигательной активности у человека при БП. В-третьих, на сегодняшний день существует несколько работ, доказывающих токсическое действие МФП+ одновременно на многие катехоламинергические системы мозга у мышей, а возможно, и на весь организм, что пока не показано на животных. Следует также отметить, что нарушения в работе всех систем организма являются важной характеристикой патогенеза БП у человека [8, 33].

Хотя моделирование паркинсонизма на мышах широко используется, в литературе в основном описано моделирование БП под действием больших доз нейротоксинов, при которых нигростриатная система быстро дегенерирует (для мышей - МФТП 40 мг/кг и более), что сопровождается грубыми изменениями моторного поведения [9, 12, 38]. При этом компенсаторные механизмы не успевают развиться в полной мере, а сами модели воспроизводят позднюю фазу клинической стадии БП у человека. Как мы обнаружили ранее при использовании гораздо более низких доз нейротоксина, введение МФТП в дозе 16 мг/кг приводит к развитию досимптомной стадии паркинсонизма, сопровождающейся дегенерацией аксонов дофаминергических нейронов в стриатуме, но не тел нейронов в ЧС. В незначительно более высокой дозе - 20 мг/кг - МФТП уже вызывает развитие симптомной стадии на фоне дегенерации не только аксонов в стриатуме, но и тел дофаминергических нейронов в ЧС [3]. Тем не менее нам не удалось получить адекватную модель БП в преклинической стадии, вызванную дегенерацией не только аксонов, но и тел дофаминергических нейронов, при однократном введении нейротоксина. Для достижения этого эффекта в данной работе была использована доза МФТП 12 мг/кг, при которой происходит дегенерация только дофаминергических аксонов в стриатуме [1], однако его действие пролонгировали за счет повторного введения через 2 ч.

Важно подчеркнуть, данная работа является одной из первых, в которой использован комплексный методический подход к анализу экспериментальной модели БП. Действительно, количество такого рода исследований крайне ограничено, причем до сих пор в них давалась оценка только поздней фазы клинической стадии БП [16, 21]. Анализ материала в данной работе проводили через 2 нед после введения МФТП, поскольку именно к этому времени заканчиваются спровоцированные нейродегенеративные процессы [25].

Поскольку нами моделируется дегенерация нигростриатных дофаминергических нейронов, для оценки их функционального состояния в качестве маркера была выбрана ТГ. Для тел нейронов в ЧС этот маркер является необходимым и достаточным, поскольку в этой области содержатся только дофаминергические нейроны. Для выявления дофаминергических волокон в стриатуме было использовано двойное мечение обоих ферментов синтеза дофамина - ТГ и ДАА. Хотя эти же ферменты содержатся и в норадренергических волокнах, их количество в стриатуме у мышей несоизмеримо меньше количества дофаминергических волокон [17], что позволяет ими пренебречь при дальнейшем подсчете дофаминергических волокон. ДАА также содержится в серотонинергических волокнах, количество которых в стриатуме довольно велико [31], однако эти волокна не содержат ТГ.

Досимптомная стадия паркинсонизма. Через 2 нед после введения МФТП в дозе 2x12 мг/кг изменения моторного поведения отсутствовали. При этом концентрация дофамина в стриатуме снизилась на 57%, т. е. не достигла порогового уровня снижения на 70-80%, при котором появляются первые нарушения моторики [7]. Интересно, что уровни ДОФУК и ГВК в стриатуме падают в меньшей степени, следовательно, увеличились отношения ДОФУК/ДА и ГВК/ДА. Эти данные косвенно свидетельствуют об увеличении активности основного фермента деградации дофамина - МАО, что плохо согласуется с литературными данными [20] и требует дальнейшего анализа. Исходя из того, что в опыте уровень дофамина и содержание дофаминергических аксонов снижаются на одну и ту же величину - 57% - следует, что среднее содержание дофамина в единичном аксоне не меняется в опыте по сравнению с контролем.

В отличие от стриатума, в ЧС уровень дофамина и его метаболитов (за исключением ГВК), а также отношения между ними остаются без изменений при введении МФТП в дозе 2x12 мг/кг. Увеличение уровня ГВК при неизменном уровне ДОФУК, возможно, связано с усилением активности катехол-О-метил-трансферазы, которая также расщепляет дофамин, но без образования ДОФУК. В отличие от аксонов в стриатуме, число нейронов в ЧС уменьшилось на 28% при неизменном общем содержании в них дофамина. Это означает, что содержание дофамина в сохранившихся в опыте дофаминергических нейронах выше, чем в контроле, на 77%.

С помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией определяется преимущественно внутриклеточное содержание дофамина. В досимптомной стадии паркинсонизма на фоне повышенного содержания дофамина в телах нейронов ЧС наблюдается его нормальный уровень содержания внутри аксонов стриатума, так как процент дегенерации волокон равен проценту падения дофамина. Это может быть результатом усиления деградации дофамина посредством МАО-А, о чем косвенно свидетельствуют увеличение отношений ДОФУК/ДА и ГВК/ДА, увеличение скорости выделения дофамина из сохранившихся в опыте аксонов или снижение скорости обратного захвата дофамина в нейроны из межклеточного пространства. В отличие от аксонов в стриатуме, в телах этих нейронов в ЧС в опыте увеличено содержание дофамина, что скорее всего является результатом усиления его синтеза за счет увеличения экспрессии и/или активности ТГ.

Симптомная стадия паркинсонизма. Через 2 нед после введения МФТП в дозе 4x12 мг/кг наблюдались изменения моторного поведения, причем только по 2 наиболее чувствительным тестам - по длине шага и длине пробега. Следовательно, при данной дозе моделируется ранняя фаза клинической стадии БП. Падение дофамина в стриатуме в этом эксперименте составило 75%, т.е. достигло порогового уровня, при котором у человека начинают проявляться симптомы БП [6]. При этом число дофаминергических волокон снизилось на 68%. В большей степени по сравнению с предыдущим опытом снизилась и концентрация продуктов деградации дофамина (ДОФУК и ГВК). При этом отношение продуктов деградации дофамина к самому дофамину возросло.

При введении МФТП в дозе 4x12 мг/кг в ЧС не изменяется общее содержание дофамина, а число нейронов уменьшается на 43%. Это означает, что как и при дозе МФТП 2x12 мг/кг, при дозе 4 12 мг/кг внутринейрональное содержание дофамина увелчивается более чем на 70%. В отличие от опыта с введением МФТП в дозе 2x12 мг/кг, при введении 4x12 мг/кг уменьшается концентрация продуктов деградации дофамина, что, возможно, обусловлено снижением активности МАО.

Результаты наших экспериментов показали, что дофаминергические волокна стриатума подвержены дегенерации в большей степени, чем тела нейронов ЧС. Очевидно, это является результатом более выраженного токсического влияния МФП+ на аксоны, чем на тела нейронов, и объясняется более высокой концентрацией мембранного транспортера дофамина в аксонах по сравнению с телами нейронов [29]. При таком распределении мембранного транспортера дофамина МФП+ должен в большей степени захватываться в аксоны, чем в тела нейронов [37]. Это означает, что дегенерацию тел нейронов, малочувствительных к действию нейротоксина, можно вызвать путем либо увеличения однократной дозы, либо пролонгирования действия токсина, используемого в относительно небольшой дозе. Последний подход и был использован в данной работе.

Предполагается, что после того, как МФП+ захватывается в дофаминергические нейроны на уровне терминалей аксонов, он путем ретроградного аксоплазматического транспорта может со временем достигать тел нейронов и также вызывать их гибель [10, 36]. Нельзя исключить и возможность того, что дегенерация нейронов, начавшаяся на уровне аксонов, может быть обратимой и со временем сопровождаться образованием новых аксонов. Приведенные данные позволяют предположить, что при относительно низкой межклеточной концентрации гипотетического эндогенного фактора - специфического нейротоксина дофаминергических нейронов у человека при БП, преклиническая стадия заболевания также, как и на экспериментальной модели, начинается с дегенерации аксонов, обладающих большей способностью к захвату этого токсина по сравнению с телами нейронов. Также в литературе имеются данные о том, что увеличение окисления дофамина в стриатуме вызывает повышение уровня свободных радикалов, которые запускают гибель клетки [11]. Кроме того, дофаминергические нейроны компактной части ЧС имеют дефицит антиоксидантной системы, например, таких ее компонентов, как Ca2+-связывающего протеина и глютатион-синтетазы [18]. Согласно существующим представлениям [23], при значительном повреждении нигростриатной системы могут включаться процессы запрограммированной клеточной гибели, в основе которых лежит вышеописанный механизм.

Таким образом, на мышах с помощью МФТП смоделирована преклиническая стадия БП, при которой наблюдается снижение числа дофаминергических аксонов в стриатуме и тел нейронов в ЧС без изменения моторного поведения, а также ранняя фаза клинической стадии, при которой усиливаются метаболические и органические изменения в нигростриатных дофаминергических нейронах, что сопровождается первыми проявлениями нарушения моторных функций.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail