Исследование содержания маркеров микробиоты в цельной крови и цереброспинальной жидкости пациентов с различными типами течения рассеянного склероза и лиц с радиологически изолированным синдромом

Рассеянный склероз (РС) — это воспалительное иммуноопосредованное и нейродегенеративное заболевание центральной нервной системы (ЦНС), характеризующееся демиелинизацией, повреждением аксонов и прогрессирующей инвалидизацией. Этиология и патогенез РС сложны и остаются неясными, хотя в этом участвуют как генетические факторы, так и факторы окружающей среды.

Кишечная микробиота как важный модулятор иммунного ответа и работы головного мозга может быть одной из причин повышения риска РС [1]. Предполагается, что нарушенная бактериальная и вирусная микробиота кишечника является важной составляющей патогенеза и опосредует аутоиммунный механизм заболевания через измененную ось «кишечник—иммунитет—мозг» [2, 3]. Ось «кишечник—иммунитет—мозг» можно определить как путь двусторонней связи между ЦНС, желудочно-кишечным трактом и кишечной микробиотой, опосредованный продуктами жизнедеятельности бактерий, действующими на системном уровне, вовлекая эндокринную и нервную системы [4—6]. ЦНС обладает способностью регулировать перистальтику кишечника, а также управлять местным иммунитетом с помощью нейромедиаторов посредством блуждающего нерва и гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы. В свою очередь пищеварительная система может регулировать нейропсихологические функции, оказывая влияние на аппетит или настроение [7].

Для классификации кишечной микробиоты с середины 1980-х годов используется ключевой идентификатор, ген 16s рРНК. Этот ген содержит постоянные и вариабельные участки, которые обеспечивают конструирование универсального праймера и определяют различие между разными видами. Ген 16s рРНК содержит приблизительно 1500 пар оснований. Постоянные участки этого гена позволяют амплифицировать его и маркировать в образце микроорганизма с использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) [8].

Изменения в комменсальной микробиоте кишечника связаны со многими воспалительными процессами. Многочисленные исследования показали как истощение, так и обогащение микробиоты кишечника определенными бактериями у пациентов с РС по сравнению со здоровыми лицами из контрольной группы. Предполагается, что определенные таксоны могут быть связаны либо с патогенезом, либо с прогрессированием заболевания. Остается неясным, является ли изменение кишечной микробиоты этиологическим фактором заболевания или же следствием патогенетических изменений при РС [1].

Одно из направлений исследований механизмов микробной регуляции работы мозга было сосредоточено на обнаружении и характеристике бактериальных токсинов, обладающих способностью проникать в кровоток и через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) достигать паренхимы головного мозга. Примером может служить выработка эпсилон-токсина (ETX) Clostridium perfringens, представителем семейства Clostridiales, которая, как было обнаружено, повышена у пациентов с РС или заболеваниями спектра оптиконевромиелита (ЗСОНМ). Однако ETX обнаруживается лишь у небольшого процента пациентов с РС, что позволяет предположить наличие других механизмов [6].

В рамках международного исследования микробиома при РС (iMSMS) был изучен микробиом кишечника 576 пациентов с РС (36% пациентов не получали лечения) и 1152 здоровых лиц контрольной группы. По результатам данного исследования в группе пациентов с РС без лечения наблюдалось значительное увеличение доли Akkermansia muciniphila, Ruthenibacterium lactatiformans, Hungatella hathewayi и Eisenbergiella tayi и уменьшение количества видов Faecalibacterium prausnitzii и Blautia. Путь деградации фитатов был значимо увеличен у пациентов с РС, не получавших лечение, в то время как пути метаболизма углеводов, продуцирующих пируват, были значительно снижены. Состав, функции микробиома и производные метаболиты также различались в зависимости от патогенетического лечения. Отчетливые микробные сети наблюдались у нелеченных пациентов с РС и здоровых лиц контрольной группы. Эти результаты убедительно подтверждают связь специфического микробиома кишечника с риском развития РС, течением и прогрессированием, а также ответом на терапию [1].

При изучении видового состава микробиома у пациентов с РС в стадии обострения обнаружены отличия от пациентов в стадии ремиссии или группы здоровых. Так, было показано, что при обострении РС кишечная микробиота менее обогащена актинобактериями родов Adlercreutzia и Collinsella. Обогащение бактероидами родов Pedobacter и Flavobacterium у больных РС было больше, тогда как бактероидами рода Parabacteroides — напротив, меньше. Содержание фирмикутных бактерий родов Blautia и Dorea было выше у больных РС, в то время как содержание других фирмикутов (Erysipelotrichaceae, Lachnospiraceae, Veillonellaceae) — ниже. Содержание протеобактерий Pseudomonas и Mycoplana было выше у больных РС, а содержание Haemophilus — в группе здоровых пациентов [9]. В исследовании, проведенном в 2018 г. среди населения Испании, была предпринята попытка продемонстрировать различия между пациентами с РС не получавшими и получавшими лечение, для чего исследование было гомогенизировано с участием 15 пациентов, получавших интерферон-β1b (ИФН-β1b), 15 — не получавших лечения, и 14 контрольных субъектов. В этом исследовании в дополнение к различиям в таксонах (типы Euryarchaeota, Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria и Lentisphaerae), связанным с наличием или отсутствием заболевания, были также обнаружены различия между пациентами с лечением и без него по присутствию одного вида, Prevotella copri, ранее считавшегося фактором защиты от РС. У пациентов с РС, получавших лечение, кишечная микробиота была сходной с таковой у лиц контрольной группы [4]. Полученные данные могут указывать на эффективность ИФН-β1b и его влияние на кишечную микробиоту, наблюдаемое у пациентов с РС, получающих это лечение [5].

Говоря о составе цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) пациентов с РС, нами ранее было обнаружено, что в ней содержится повышенное количество различных микробных маркеров, что может свидетельствовать о возможной ассоциации РС с полимикробной инфекцией. Было обнаружено увеличение микробной нагруженности у пациентов с РС, свидетельствующее о возможной ассоциации РС с полимикробной инфекцией. В частности, обнаружено увеличение содержания маркеров Streptococcus, а также тенденция трехкратного увеличения содержания кампестерола, маркера кампестерол-продуцирующих микрогрибов, в ЦСЖ пациентов с РС по сравнению с контрольной группой (диагностические пункции, различные заболевания нервной системы неаутоиммунного или воспалительного характера, неострые состояния) [10].

С целью идентификации нейротоксичных метаболитов, потенциально способных повлиять на аксональное повреждение, проведен функциональный ксеногенный анализ Achilles Ntranos, в ходе которого культивированные нейроны крыс подвергли воздействию образцов ЦСЖ, собранных у пациентов с РС до и после лечения диметилфумаратом, а затем провели метаболомный анализ образцов плазмы и ЦСЖ для выявления метаболитов с различным содержанием. Анализ взвешенной корреляционной сети выявил наличие метаболитов фенола и индольной группы бактериального происхождения (п-крезолсульфата, индоксилсульфата и N-фенилацетилглутамина) как потенциально нейротоксичных, которые уменьшаются при лечении РС. Хроническое воздействие этих метаболитов на культивируемые нейроны снижало скорость их возбуждения и индуцировало повреждение аксонов, независимое от митохондриальной дисфункции и окислительного стресса, тем самым выявляя новый путь нейротоксичности. Уровни идентифицированных метаболитов бактериального происхождения (п-крезолсульфат, индоксилсульфат и N-фенилацетилглутамин) были обратно пропорциональны показателю объема коры головного мозга, полученного с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ), и напрямую коррелировали с уровнями легких цепей нейрофиламентов — установленного биомаркера нейродегенерации. Полученные данные свидетельствуют о том, что производные фенола и индола, образующиеся в результате катаболизма триптофана и фенилаланина, являются метаболитами микробного происхождения, которые могут опосредовать связь между кишечником и мозгом и вызывать нейротоксическое влияние при РС [6].

Цель исследования — оценка уровня микробиотических маркеров в цельной крови и ЦСЖ пациентов с различными типами течения РС, лиц с радиологически изолированным синдромом (РИС) и контрольной группы.

В текущей работе мы выполнили первоначальную оценку маркеров микробиоты в крови и ЦСЖ пациентов с впервые диагностированным РС, ранее не получавших терапию препаратами, изменяющими течение РС (ПИТРС), среди которых пациенты с ремиттирующим РС (РРС) в стадии ремиссии (27 образцов), в стадии обострения (35), с первично-прогрессирующим РС — ППРС (7), лица с РИС (10) и контрольной группы (47 диагностических образцов — различные заболевания нервной системы неаутоиммунного или воспалительного характера, неострые состояния), с использованием хромато-масс-спектрометрического исследования [11]. Все образцы были собраны для диагностических целей в соответствии со стандартным протоколом и одобрением локального Этического комитета. Все пациенты подписали письменное информированное согласие для участия в исследовании. Пациенты с диагнозом РС имели ремиттирующее и первично-прогрессирующее течение, диагноз был установлен на основании клинических, нейровизуализационных и лабораторных данных.

Анализ микробных маркеров заключается в прямом извлечении ионов жирных кислот, альдегидов и стеринов из крови и ЦСЖ, их хроматографическом разделении и последующем масс-спектрометрическом обнаружении [12]. Для анализа образец ЦСЖ в количестве 80 мкл подсушивали в термостате при 80 °C с добавлением 80 мкл метанола для ускорения сушки, образец крови в количестве 40 мкл подсушивали в термостате при 80 °C с добавлением 40 мкл метанола для ускорения сушки. Анализ был проведен согласно методике, описанной Г.А. Осиповым и соавт. [13]. Жирные кислоты высвобождались в виде метиловых эфиров и диметилацеталей в результате метанолиза. Полученные продукты экстрагировали и подвергли дериватизации для улучшения хроматографической подвижности гидроксикислот и стеролов. На этапе пробоподготовки в пробу вводился внутренний стандарт — дейтерированная тридекановая кислота, по которому в дальнейшем происходил количественный расчет. Аналит в количестве 2 мкл вводили в систему ГХ-МС Maestro 7820 A с масс-селективным детектором (детектор серии 5975 «Agilent Technologies», США) [13]. Масс-спектрометр работал в режиме селективного сканирования ионов, регистрируя 37 спектральных линий (масс-ионов). Алгоритм определения масс-спектральных параметров биологического образца может обнаруживать около 200 известных микробных маркеров, что достаточно для выявления и анализа более 170 таксонов клинически значимых микроорганизмов на уровне рода или вида. Точный подбор временных интервалов и оптимизированный набор детектируемых ионов позволяет избирательно регистрировать минорные компоненты микробного происхождения на фоне подавляющих сигналов молекул биоматериала (биоматрицы) и химических соединений, содержащихся в средствах отбора. Это позволяет устранить эффекты хроматографического наложения пиков [14].

Для определения статистической значимости использовался U-тест Манна—Уитни. Значения p<0,05 принимались как статистически значимые.

Нами обнаружен ряд отличий между содержанием микробиотических маркеров в ЦСЖ контрольной группы и пациентов с РС. Данные по маркерам с наибольшими отличиями от контрольной группы представлены в табл. 1.

Таблица 1. Концентрация микробных маркеров в ЦСЖ пациентов с РС (РРС-ремиссия, РРС-обострение, ППРС), лиц с РИС и контрольной группы, нмоль/г

Примечание. * — различия между РС (РРС-ремиссия, РРС-обострение, ППРС), РИС и контрольной группой статистически значимы (p<0,05, двусторонний критерий Манна—Уитни). Данные представлены в виде медианы и интерквартильного размаха (25-й и 75-й процентили). i12 — изолауриновая, 2h12 — 2-гидроксилауриновая, 15:1d9 — 9,10-пентадеценовая, 19cyc — циклононадекановая, 20:1d11 — 11-эйкозановая, 14:1d7 — 7,8-тетрадеценовая, 20:1 — арахиновая, 3h12 — 3-гидроксилауриновая, i14a — изомиристиновый; а13 — антеизодекановая; i14 — изомирамистиновая; 15:1d9 — 9,10-пентадеценовая; 18:1d11 — цис-вакценовая кислота, 18:1d11a — 11-октадеценовый альдегид; 16:1d11 — 11,12-гексадеценовая; a15a — антеизопентадекановая; 20:1 — арахиновая.

У пациентов с РС в стадии ремиссии обнаружено статистически значимое увеличение содержания эндотоксина и плазмалогена, источником которых могут быть различные виды микроорганизмов. Так, уровень плазмалогена у пациентов с РС в стадии ремиссии повышен более чем в 4,5 раза по сравнению с контрольной группой. Бактериальный плазмалоген синтезируется, в частности, у многих анаэробных и некоторых факультативно анаэробных бактерий [15]. Эндотоксин представляет собой липополисахарид (ЛПС), составляющий большую часть наружной мембраны грамотрицательных бактерий [16]. Таким образом, увеличение уровня плазмалогена и эндотоксина, как правило, свидетельствует об увеличении содержания различных типов микроорганизмов.

Это увеличение может подтверждаться повышением уровня содержания в ЦСЖ различных маркеров, специфичных для определенных микроорганизмов. Наибольшее количество отличий в содержании маркеров, в отличие от контрольной группы, выявлено у пациентов с РС в стадии ремиссии. В частности, у таких пациентов выявлено статистически значимое повышение, примерно в 2 раза и более, уровня микробиотических маркеров, характерных для Peptostreptococcus anaerobius, Pseudomonas aeruginosa, Eubacterium, Bifidobacterium, Butirivibrio, Moraxella, Acinetobacter, Propionibacterium acnes, а также маркеры вируса Эпштейна—Барр. Помимо этого, характерна тенденция к повышению кампестерола, вероятным источником которого являются кампестерол-продуцирующие микрогрибы.

По разнообразию увеличения микробиотических маркеров пациенты с РИС находятся на втором месте после пациентов с РС в стадии ремиссии. Так, у пациентов с РИС выявлено статистически значимое увеличение уровня маркеров вируса Эпштейна—Барр, бактерий Propionibacterium acnes, а также Pseudomonas, Moraxella и Acinetobacter. Увеличение маркера 3h12, характерного для Pseudomonas, Moraxella, Acinetobacter показано нами для пациентов всех групп, за исключением группы пациентов с РС в стадии обострения.

Помимо анализа уровня микробиотических маркеров в ЦСЖ, нами выполнен анализ микробиотических маркеров в цельной крови пациентов с РС в стадии ремиссии, обострения и контрольной группы (табл. 2). Мы не обнаружили статистически значимых различий между указанными группами и контрольной группой.

Таблица 2. Концентрация микробных маркеров в цельной крови пациентов с РС в стадии ремиссии и обострения, и контрольной группы, нмоль/г

Примечание. Представлены данные по содержанию плазмалогена и эндотоксина. Данные представлены в виде медианы и интерквартильного размаха (25-й и 75-й процентили). Статистически значимых различий не обнаружено.

В настоящей работе нами исследовано содержание микробиотических маркеров в ЦСЖ и цельной крови у значительной группы пациентов с РС. Полученные данные во многом согласуются с результатами нашего предварительного исследования по анализу микробиотических маркеров в ЦСЖ у пациентов с РС в стадии ремиссии и РИС [10]. С одной стороны, полученные в наших работах данные свидетельствуют в пользу гипотезы о важности полимикробного инфицирования в развитии РС. С другой стороны, стоит отметить повышение в основном маркеров одних и тех же групп микроорганизмов в проведенных исследованиях, что может говорить о возможном определенном инфекционном паттерне, характерном для ЦНС при РС, механизм возникновения которого и патогенетическую роль еще предстоит определить. На данном этапе можно отметить возможные патогенетические последствия повышения уровня отдельных групп микроорганизмов и их компонентов, что будет рассмотрено ниже.

В настоящем исследовании наибольшее количество статистически значимых отличий от контрольной группы обнаружено в содержании маркеров в ЦСЖ пациентов с РС в стадии ремиссии. В стадии обострения, напротив, нами не обнаружено статистически значимых различий по сравнению с контрольной группой.

Крайне интересным представляется сопоставление данных по содержанию микробиотических маркеров в ЦСЖ и крови. В то время как содержание различных микробиотических маркеров в ЦСЖ увеличено у пациентов с РС по сравнению с контрольной группой, содержание этих маркеров в цельной крови, скорее, не изменяется. Таким образом, можно говорить об изменении показателей микробиотической нагрузки именно на уровне ЦНС (что показывает их увеличение в ЦСЖ), но не на уровне всего организма (так как в цельной крови увеличения микробиотических маркеров не обнаруживается).

Среди обнаруженных различий важное значение может иметь повышение маркера Pseudomonas aeruginosa у пациентов с РС в стадии ремиссии и лиц с РИС. В литературе имеются данные о возможной молекулярной мимикрии между антигенами Pseudomonas aeruginosa и компонентами миелиновой оболочки. Антитела к мимикрирующим пептидам Acinetobacter, Pseudomonas aeruginosa, основному белку миелина (MBP) и миелиновому олигодендроцитарному гликопротеину были значительно повышены у пациентов с РС по сравнению с контрольной группой. Антисыворотки против MBP реагировали как с пептидами Acinetobacter, так и с Pseudomonas [17]. Стоит отметить, что бактерии Acinetobacter локализованы на коже человека и в носовых пазухах [18].

Наблюдаемое повышение уровня эндотоксина в ЦСЖ пациентов с РС также может иметь важное патогенетическое значение. Эндотоксин как прямо, так и опосредованно активирует микроглию, которая может инициировать повреждение нейронов, продуцируя активные формы азота и кислорода путем фагоцитоза синапсов и нейронов, а также продуцируя провоспалительные цитокины. В связи с этим в литературе выдвинута эндотоксиновая гипотеза нейродегенерации [16]. Важно отметить, что как в нашем исследовании, так и в литературе не обнаружено повышения уровня эндотоксина в крови и сыворотке крови у пациентов с РС по сравнению с контрольной группой [19]. Однако нами обнаружено повышение уровня эндотоксина в ЦСЖ, что может свидетельствовать о его накоплении в структурах, более анатомически близких к нервной ткани.

Тенденция к увеличению содержания маркеров микрогрибов в ЦСЖ пациентов с РС, показанная в настоящей работе, также согласуется с полученными нами ранее данными [10]. В литературе показано, что грибковый компонент микробиома, как и бактериальный, нарушается у пациентов с РС [20]. Также было показано наличие грибковой инфекции в тканях ЦНС пациентов с РС [21].

Различные препараты, применяемые при РС, обладают противомикробным и противогрибковым действием. Так, показана фунгицидная активность диметилфумарата, которая может вносить вклад в его фармакологическую активность при РС [22, 23].

Также в настоящей работе нами выявлено увеличение маркеров, характерных для вируса Эпштейна—Барр, в ЦСЖ у пациентов с РС в стадии ремиссии. В литературе показана высокая распространенность вируса Эпштейна—Барр, ассоциированная с РС. В недавнем исследовании выдвинуто предположение, что хроническая инфекция вирусом Эпштейна—Барр является основной причиной РС. Риск РС увеличивался в 32 раза после инфицирования вирусом Эпштейна—Барр, но не увеличивался после заражения другими вирусами, включая цитомегаловирус, передающийся аналогичным образом [24].

Таким образом, нами показано достоверное увеличение содержания маркеров микробиоты в ЦСЖ пациентов с РС по сравнению с контрольной группой. Особый интерес вызывает то, что содержание различных микробиотических маркеров в ЦСЖ увеличено у пациентов с РС по сравнению с контрольной группой, в то время как содержание этих маркеров в цельной крови не изменяется. Это позволяет говорить об изменении показателей микробиотической нагрузки именно на уровне ЦНС, но не на уровне всего организма.

В целом результаты настоящей работы согласуются с гипотезой о возможной ассоциации РС и полимикробной инфекции. Также вероятно наличие определенного паттерна микробиотических и вирусных маркеров, характерного для ЦСЖ пациентов с РС, но не для плазмы крови.

Статья выполнена при финансовой поддержке РНФ, грант №22-15-00284.

This research was funded by the Russian Science Foundation, grant 22-15-00284.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare there is no conflict of interest.