Одним из фундаментальных аспектов учения об инсульте является гетерогенность и разнообразие подтипов патогенетического развития ишемического поражения вещества головного мозга. Актуальность каждого момента, связанного с острыми нарушениями мозгового кровообращения обоснована высокой медико-социальной значимостью исходов и стоимостью лечения госпитального периода, а внедрение новых технологий влечет за собой необходимость решения проблем — инвалидизирующих последствий и качества жизни [1].

Повреждение головного мозга, вызванное ишемическим инсультом, представляет результат взаимодействия сложных патофизиологических процессов [2]. Кроме того, все бо`льшее количество публикаций свидетельствует о том, что эпигенетические механизмы являются связующим звеном между генетическим ландшафтом организма и факторами внешней среды, и развитием комплексных патологий, в том числе ишемии головного мозга [3—5].

В последние годы исследования эпигенетических и эпигеномных изменений при сердечно-сосудистых и цереброваскулярных патологиях начали быстро расширяться от биологических исследований и изучения на животных до масштабных эпидемиологических работ на различных когортах пациентов [6]. Например, уже установлено, что спектр эпигенетических процессов играет важную роль в патофизиологии церебральной ишемии, регулирует транскриптомные ответы на прекондиционирующую ишемию и ишемическую толерантность [7].

Следует отметить, что появление/исчезновение эпигенетических изменений (эпимутаций), в отличие от генетических мутаций, — достаточно динамичный процесс, который под воздействием внешних и/или внутренних факторов может изменять эпигенетический ландшафт клетки в ту или иную сторону с точки зрения развития патологии, характера/тяжести течения заболевания и/или ответа на лекарственную терапию. Кроме того, характерной особенностью эпигенетических модификаций является их клетка-, ткане- и органоспецифичность ответа на внутреннее и/или внешнее воздействие, что особенно важно при рассмотрении патофизиологии/этиологии различных заболеваний, в частности при ишемическом повреждении головного мозга [8]. Поскольку некоторые органы человека (головной мозг, сердце, нервы) недоступны для эпигеномного анализа in vivo, то сведения в данной области, полученные при экспериментальных исследованиях на лабораторных животных, становятся особенно актуальными.

Эпигенетические механизмы регуляции экспрессии генов внутри клеток (в ядре и митохондриях) могут осуществляться посредством метилирования ДНК, пост-трансляционных модификаций гистонов, посттранскрипционной инактивации гена, индуцированной микро-РНК [9]. При этом уже на протяжении нескольких десятилетий особое внимание уделяется исследованию метилирования ДНК как в норме, так и при различных патологиях [4, 5].

Метилирование ДНК представляет собой перенос метильной группы (-CH₃) от S-аденозилметионина в положение 5’-цитозинового кольца ДНК, с образованием 5-метилцитозина (5-meC) в CpG динуклеотидах. Большое количество потенциальных сайтов метилирования ДНК находится в CpG островках, расположенных преимущественно в промоторах и 5’-нетранслируемых районах генов (5’-UTR). Метилирование ДНК препятствует связыванию транскрипционных факторов и в большинстве случаев снижает транскрипцию, но в зависимости от микроокружения и положения в геноме, а также от типа клеток/тканей может, наоборот, способствовать экспрессии генов. Уровень метилирования ДНК регулируется балансом активности ДНК-метилтрансфераз (DNMT-1, DNMT-3a, DNMT-3b) и ДНК-деметилаз, которые осуществляют присоединение и удаление метильных групп (активное деметилирование ДНК) соответственно. Существует также пассивное деметилирование ДНК, которое характеризуется потерей метильной группы вследствие ингибирования или отсутствия ДНК-метилтрансферазы при репликации ДНК [10—13].

Методические подходы по количественной и качественной оценке метилирования ДНК включают два основных направления анализа: полногеномное и генспецифическое. При полногеномном анализе определяют уровень метилирования CpG динуклеотидов в различных сайтах (последовательностях), которые в большом количестве локализованы по всему геному, в частности это сайты узнавания для метилчувствительных эндонуклеаз рестрикции (например, MspI/HpaII), а также повторяющиеся последовательности ДНК (например, LINE-1, Alu) [14]. В случае генспецифического анализа исследуют уровень метилирования ДНК конкретного гена, чаще всего его промотора или некодирующих участков (5’-UTR, 3’-UTR, интроны) [15, 16]. При этом анализ метилирования генов-кандидатов позволяет исследовать роль их эпигенетических модификаций в соответствии с функциями при развитии патологического процесса.

В представленном обзоре внимание уделено анализу экспериментальных исследований на животных по изучению метилирования ДНК в ткани головного мозга при ишемическом повреждении, которое может играть важную роль в генетическом перепрограммировании клетки от фенотипа ишемической толерантности до непереносимости. Роль метилирования ДНК при ишемическом повреждении головного мозга остается неизученной, но представляет интерес, обусловленный несколькими фактами. Во-первых, в нейронах обнаружена высокая активность ДНК-метилтрансферазы, что подразумевает ее нейроспецифическую функцию в этих нереплицирующихся клетках [17]. Во-вторых, ишемия головного мозга может привести к генетическим мутациям, таким как замена метилированного цитозина на тимин, вызванным дезаминированием 5-meC, но в тоже время ДНК-метилтрансфераза может реметилировать вновь включенные цитозины после репарации ДНК в мозге [17, 18]. Кроме того, во время ишемии/реперфузии образовавшийся в результате повреждения кислородными радикалами 8-гидроксигуанин способен изменять паттерн метилирования соседних цитозинов [19].

Цель исследования — проведение систематизированного обзора современной научной литературы, посвященной изучению метилирования ДНК при экспериментальном ишемическом повреждении головного мозга у животных. Это поможет систематизировать данные о потенциальной роли метилирования ДНК в нервной ткани при церебральной ишемии и предоставить новые сведения для будущих фундаментальных и клинических исследований, а также обеспечить лучшее понимание этиологии, и, следовательно, способствовать разработке принципиально новых методов профилактики и лечения сосудистых заболеваний [20].

Материал и методы

Поиск литературы осуществляли в базе PubMed без ограничения по году публикации. Были использованы следующие ключевые слова: «DNA methylation», «stroke», «rats», «mouse», «gerbils», «rabbit», «pigs», «monkey».

Для анализа отбирали публикации, в которых оценивали связь между уровнем полногеномного метилирования ДНК или метилированием ДНК гена-кандидата и экспериментальным инсультом головного мозга у лабораторных животных. Обязательным условием было проведение эксперимента с использованием моделей ишемического повреждения головного мозга in vivo. Публикации были исключены из анализа, если: 1) были обзорами; 2) содержали не относящиеся к теме результаты, воздействия или сравнения.

Результаты были обобщены в повествовательной форме. Метаанализ данных не проводился из-за неоднородности исследований.

Результаты и обсуждение

Всего в ходе первоначального поиска было найдено 282 публикации. Далее 228 статей были исключены после анализа заголовков и резюме. После последующей полнотекстовой проверки для анализа были отобраны 14 публикаций из PubMed, из которых в 8 исследовалось изменение уровня полногеномного метилирования ДНК и в 6 — метилирование генов-кандидатов при моделировании ишемии головного мозга у лабораторных животных.

Полногеномное метилирование ДНК при экспериментальном ишемическом инсульте

Краткая характеристика исследований [21—28], посвященных изучению изменения полногеномного метилирования ДНК при ишемическом повреждении головного мозга у животных, представлена в табл. 1.

Таблица 1. Публикации, отобранные для анализа полногеномного метилирования ДНК при ишемическом повреждении головного мозга у животных

Примечание. ↑ и ↓ — увеличение и снижение уровня по сравнению с нормой (неишемизированной тканью).

Предполагается, что регуляция экспрессии генов, которые ассоциированы с гибелью нейронов после ишемически-реперфузионного повреждения, могут быть вызваны эпигенетическими изменениями в поврежденном мозге. Так, повышение полногеномного метилирования ДНК может сделать нервную ткань более уязвимой для ишемического повреждения. Кроме того, повышенное метилирование ДНК после ишемии мозга может быть связано с митотической активностью и репликацией ДНК в ненейрональных клетках, таких как глия или клетки-предшественники [29]. В связи с этим в последующих исследованиях необходимо принимать во внимание тип не только анализируемой ткани, но и клеток, ее составляющих.

Фармакологическое ингибирование ДНК-метилтрансфераз при фокальной ишемии головного мозга обладает нейропротективным эффектом и связано со снижением полногеномного метилирования ДНК головного мозга. Так, в ряде исследований было показано, что применение 5-аза-2’-дезоксицитидина, 5-азацитизина, зебуларина и блокатора RG108 в качестве ингибиторов DNMTs приводило к значительному уменьшению объема инфаркта головного мозга [21, 23—25, 27]. Механизм защитного действия предполагает, что снижение уровня DNMTs влияет на структуру хроматина и позволяет факторам транскрипции, например таким как индуцируемые гипоксией-1 (HIF-1a), связываться с генами, участвующими в нейрозащите, и увеличивать их экспрессию [30], поскольку сайт связывания HIF-1 (5’-RCGTG-3’) содержит CpG динуклеотид, чувствительный к метилированию [31]. Однако необходимо подчеркнуть, что и собственно факторы, индуцируемые гипоксией, способны в свою очередь приводить к эпигеномным изменениям [32]. Подавление полногеномного метилирования ДНК придает нервной ткани устойчивость к ишемии. Нельзя исключить, что здесь работает теория «хорошего гена против плохого», и это может быть связано со сверхэкспрессией защитных/антиапоптотических генов (например, c-fos, bcl-2, sod) или с репрессией вредоносных/проапоптотических генов (например, bad, bax). Однако необходимо учитывать, что существуют некротический и апоптотический пути гибели нервных клеток при церебральной ишемии, и при каком именно механизме ингибирование DNMTs будет обладать нейропротективным эффектом, еще предстоит выяснить.

Ишемия головного мозга вызывает гиперметилирование ДНК, которое, вероятно, играет ключевую роль в путях, ведущих к развитию тяжести ишемического повреждения головного мозга. Однако полное ингибирование метилирования ДНК не является биологически выгодным. Так, на модели мышей с выключенным геном DNMT1 при фокальной ишемии мозга было показано, что именно сниженный уровень белка DNMT1, но не его отсутствие, защищает от ишемического повреждения [33]. Следует отметить, что при фокальной ишемии уровень DNMT1 снижен в ткани сердца, при этом уровень DNMT3a в ткани почек повышен, а в печени не отмечалось изменения уровней этих метилтрансфераз при сравнении с органами животных без фокальной ишемии [28]. Обнаруженные тканеспецифичные изменения экспрессии метилтрансфераз могут лежать в основе побочных эффектов в соматических органах, вызванных инсультом. Эпидемиологические данные свидетельствуют о том, что острое повреждение почек вносит значительный вклад в смертность после инсульта головного мозга, однако механизмы постинсультного повреждения почек до конца не изучены [34]. Это указывает на то, что ишемическое повреждение головного мозга может не только влиять на изменение уровня и/или паттерна полногеномного метилирования ДНК и опосредованных с этим процессом ферментов в ткани головного мозга, но также играть определенную роль в контроле профиля экспрессии генов в органах.

Опубликованные результаты дают основание предполагать, что механизмы повреждения и нейропротекции, опосредованные полногеномным метилированием ДНК при ишемии головного мозга, достаточно сложны. Это подтверждается еще одним исследованием, в котором изучалась роль изменения полногеномного метилирования ДНК и влияние гомоцистеина на патогенез ишемического инсульта [26]. Повышенный уровень гомоцистеина признан мощным фактором риска ишемического инсульта [35]. Однако токсический потенциал гомоцистеина для клеток головного мозга при ишемическом повреждении не совсем ясен. В исследовании на крысах было показано, что применение гомоцистеина при фокальной ишемии подавляло способность нейрональных стволовых клеток к самообновлению в гиппокампе ишемизированного мозга. Также при применении гомоцистеина в ишемизированном полушарии отмечалось снижение активности DNMTs, уровня полногеномного метилирования ДНК и количества 5meC-позитивных нейронов. В исследовании было показано, что высокий уровень гомоцистеина приводит к гипометилированию ДНК и в конечном итоге подавляет нейрогенез в ишемическом мозге. Авторы высказали предположение, что снижение уровня гомоцистеина может способствовать формированию правильного паттерна метилирования ДНК во время нейрогенеза в тканях мозга в ответ на высокий уровень метилирования, вызванного ишемией [26].

Оценка уровня полногеномного метилирования ДНК может служить новым стандартизированным молекулярным маркером для оценки эффективности нейропротективных воздействий при ишемическом повреждении головного мозга как в поисковых научных работах, так и на этапе доклинических исследований. При этом необходимо учитывать, что метилирование промотора гена или некодирующих участков гена может по-разному влиять на его экспрессию. Оценка степени полногеномного метилирования ДНК позволяет выявить корреляции между метилированием и патологией для последующего поиска специфических генов-кандидатов. В связи с этим с целью понимания молекулярных механизмов обнаруженной связи между метилированием ДНК и развитием/течением заболевания при определенных воздействиях (изменениях) внешней и внутренней среды организма необходим анализ не только на уровне генома в целом, но и в определенных локусах/генах и в первую очередь в генах-кандидатах, ассоциированных с исследуемой патологией.

Метилирование ДНК генов-кандидатов при экспериментальном ишемическом инсульте

Влияние метилирования ДНК генов-кандидатов на патогенез развития ишемически-реперфузионного повреждения головного мозга изучается последние несколько лет. Как правило, изменение метилирования ДНК и соответственно последующее изменение экспрессии отмечались в генах, изменения в которых ранее рассматривались как факторы риска для развития ишемического инсульта, поскольку продукты этих генов участвовали в механизмах развития патологических процессов. Установлено, что церебральная ишемия может привести либо к усилению метилирования ДНК гена-кандидата, либо к снижению метилирования [22, 36—40].

Краткое описание публикаций, посвященных изучению метилирования ДНК генов-кандидатов при экспериментальном ишемическом инсульте, представлено в табл. 2.

Таблица 2. Публикации, отобранные для анализа метилирования ДНК генов-кандидатов при экспериментальном ишемическом повреждении головного мозга

Примечание. ↑ и ↓ — увеличение и снижение уровня по сравнению с нормой (неишемизированной тканью); STAT3 — транскрипционный фактор, который играет ключевую роль во многих клеточных процессах, таких как рост клеток и апоптоз.

Метилирование ДНК может влиять на пластичность нейрональных связей после ишемического повреждения головного мозга и быть вовлечено в механизмы формирования постишемической депрессии [37]. В клиническом исследовании у пациентов с постинсультной депрессией в периферической крови отмечалось повышенное метилирование ДНК промотора гена BDNF, и было высказано предположение, что это может быть использовано в качестве молекулярного маркера для прогнозирования тяжести инсульта и постинсультной депрессии [41].

Метилирование ДНК может участвовать в ГАМКергических механизмах головного мозга. В нейронах млекопитающих перенос ионов через мембраны осуществляется при помощи ионных транспортеров, в частности перенос внутрь клетки осуществляется транспортером типа 1, который кодируется геном Na⁺-K⁺-2Cl транспортера типа 1 (NKCC1). Предполагается, что нарушения экспрессии NKCC1, связанные с изменениями уровня метилирования CpG-островков в промоторе этого гена, играют ключевую роль в патогенезе различных заболеваний, в том числе инсультов, что было показано в экспериментах in vitro и in vivo [39, 42, 43].

Метилирование ДНК также может влиять на проницаемость гематоэнцефалического барьера путем разрушения базальной мембраны эндотелия, приводящего к увеличению постишемических реперфузионных геморрагий. Матриксная металлопротеиназа-9 (MMP-9) является известным маркером повреждения головного мозга при инсульте [44]. Показано, что тканевой ингибитор металлопротеиназы-2 (TIMP-2) ингибирует активность MMP-9. В исследовании на мышах при анализе ДНК митохондрий было обнаружено, что ишемическое повреждение головного мозга способствует повышению метилирования гена TIMP-2, снижающего его экспрессию, что приводит к повышению активности MMP-9 в ишемизированном головном мозге [22].

Изменение уровня метилирования ДНК при ишемическом инсульте может быть задействовано в активности внутриклеточного сигнального пути Nogo-A/RhoA/ROCK. Известно, что ингибитор роста аксонов типа A (Nogo-A) и его рецептор Nogo (NgR) через каскад RhoA/ROCK играют важную роль в восстановлении поврежденных нервов. Активирование сигнального каскада RhoA/ROCK в ткани головного мозга было показано у пациентов post vivo и у крыс при ишемическом повреждении головного мозга [45, 46]. В исследовании на крысах изучали влияние ишемии головного мозга на изменение уровня метилирования CpG-сайтов нескольких генов, белки которых задействованы в Nogo-A/RhoA/ROCK каскаде. Так, было показано, что уровень метилирования ДНК генов Nogo-A, NgR1, NgR2, RhoA и ROCK2 существенно увеличивался в коре головного мозга при ишемическом повреждении и сопровождался повышенной экспрессией этих генов и белков по сравнению с ложнооперированными животными [40].

Кроме того, при ишемическом повреждении головного мозга метилирование ДНК может быть задействовано также в процессе астроглиогенеза [36] и принимать участие в механизмах зависимого от пола развития тяжести инсульта, опосредованного уровнем эстрогенов [38].

Заключение

Эпигенетика произвела революцию в понимании механизмов, связанных с развитием патологических состояний, включая ишемический инсульт головного мозга.

Сегодня уже общепринято, что процесс дифференцировки нервных клеток регулируется присущими клетке эпигенетическими механизмами и механизмами, запущенными при ишемическом повреждении. И именно нацеливание на эпигенетические механизмы может привести к разработке новых терапевтических подходов в лечении и профилактике церебральной ишемии [47].

Исследования, проводимые на моделях ишемии головного мозга у животных, вносят вклад в понимание сложных генетических и молекулярных механизмов патогенеза ишемического повреждения. Эпигенетические механизмы становятся новыми фундаментальными факторами, участвующими в регуляции экспрессии генов, связанных с инсультом. При этом необходимо помнить, что эпигенетические модификации, в отличие от изменения последовательности генов, обратимы, и этот момент является многообещающим для разработки фармакологических ингибиторов с целью нейропротекции. Резистентность к ишемии представляет собой конечный результат взаимодействия многочисленных сигнальных путей, которые временно действуют согласованно, изменяя активность эпигенетических белков, которые в свою очередь изменяют профиль геномной экспрессии клетки, приводя к устойчивой нейропротекции. Следовательно, активация или ингибирование наборов генов в сравнении с отдельными сигнальными путями может представлять собой инновационный подход для терапевтического вмешательства при ишемии головного мозга. При этом необходимы дальнейшие исследования, поскольку во всех представленных в обзоре исследованиях анализировали ДНК из образцов нервной ткани животных, при этом не учитывали изменение уровня метилирования в крови животных, что не позволяет сопоставить данные значения между собой и экстраполировать полученные результаты в клиническую практику. Подходы к терапии экспериментального инсульта у животных, основанные на основе изменения метилирования ДНК, все еще находятся на начальных этапах изучения, однако предварительные результаты предполагают, что агенты, нацеленные на эти пути, могут регулировать развертывание стрессовых реакций, которые модулируют жизнеспособность нервных клеток и способствуют восстановлению мозга и его функциональной реорганизации.

Клиническое применение эпигенетических биомаркеров многообещающе. Метилирование ДНК участвует во многих патологических путях, связанных с хорошо известными факторами риска/защиты от инсульта. Такой эпигенетический биомаркер может стать инструментом для выявления людей с риском инсульта при бессимптомном течении заболевания. Кроме того, лучшее понимание того, как метилирование ДНК взаимодействует с метаболизмом, воспалением или другими патологическим путями, может стать помощником при принятии решений в терапии ишемического инсульта.

Инновационные стратегии будут помогать преодолеть ограничения неселективных подходов, используемых сейчас в терапии ишемического инсульта, и нацеливаться на различные молекулы, связанные с эпигенетическим регулированием в виде метилирования ДНК.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.