Рассеянный склероз (РС) — аутоиммунное нейродегенеративное заболевание ЦНС, является одной из важнейших проблем современной неврологии. По данным Всемирной организации здравоохранения, за 5 лет число больных РС в мире увеличилось на 500 тыс. и в 2020 г. составляло около 2,8 млн [1]. Распространенность РС значительно варьирует в зависимости от пола и возраста [2]. РС одинаково распространен у мальчиков и девочек раннего возраста. В подростковом возрасте распространенность заболевания увеличивается у девочек, достигая соотношения 3:1; эта закономерность сохраняется примерно до конца шестого десятилетия. Среди пожилых распространенность снова имеет тенденцию к росту у женщин и медленному снижению у мужчин [2]. У мужчин более вероятно развитие тяжелого течения заболевания — первично-прогрессирующего РС [3]. Женщины, как правило, более склонны к аутоиммунным заболеваниям, чем мужчины, у них выше частота обострений ремиттирующего РС (РРС) [4].

Несмотря на достижения последних десятилетий в области молекулярной медицины, этиология и патогенез РС остаются до конца не выясненными. Интенсивно изучается роль микроРНК, малых регуляторных некодирующих РНК, участвующих на посттранскрипционном уровне в регуляции экспрессии их генов-мишеней. Проведенное нами недавнее исследование с использованием высокопроизводительного секвенирования (RNA-seq) выявило повышенную экспрессию большого количества генов микроРНК, гены которых колокализованы на хромосоме 14 в области импринтированного локуса DLK1-DIO3, в мононуклеарных клетках периферической крови (МНК) у больных РРС мужчин по сравнению со здоровыми мужчинами; у женщин этих изменений не наблюдалось [5]. Изменения в экспрессии нескольких микроРНК были валидированы на независимой выборке. В связи с кластерной организацией генов микроРНК внутри этого локуса возникает необходимость оценки вовлеченности и других, ранее не изученных, микроРНК в развитие РС. Кроме того, поскольку МНК представляют гетерогенную по клеточному составу популяцию клеток, включающую CD4⁺ T-клетки, CD14⁺ моноциты, CD8⁺ T-клетки, CD19⁺ B-клетки, NK-клетки и дендритные клетки, возникает вопрос о том, какие из клеточных субпопуляций ответственны за изменения, наблюдаемые в МНК больных РС. Изучение экспрессии микроРНК из локуса DLK1-DIO3 в этих клеточных субпопуляциях позволит приблизиться к пониманию этого вопроса, а также в будущем установить причинно-следственную связь между экспрессией микроРНК из исследуемого локуса и патогенезом РС.

В данном пилотном исследовании нами проведен анализ экспрессии 10 ранее не изученных микроРНК из локуса DLK1-DIO3 в МНК, а также в CD4⁺ T-лимфоцитах и CD14⁺ моноцитах — ключевых клеточных популяциях, запускающих патологические процессы в развитии РС, у больных РРС, а также здоровых индивидов, раздельно для мужчин и женщин.

Цель исследования — анализ экспрессии нескольких ранее не изученных микроРНК из локуса DLK1-DIO3 в МНК и клеточных субпопуляциях CD14⁺ и CD4⁺ больных РРС, а также здоровых индивидов.

Материал и методы

В исследование были включены 14 неродственных больных РРС в ремиссии и 14 здоровых контролей без неврологических и аутоиммунных заболеваний. В каждой из групп равно представлены мужчины и женщины. Подбор участников исследования выполнен в ФГБУ «Федеральный центр мозга и нейротехнологий» ФМБА. Диагноз РС был установлен согласно критериям МакДональда 2017 г. [6]. Средний возраст участников исследования в общей группе больных РРС составил 30,0±8,8 года; средний уровень инвалидизации по шкале EDSS — 2,4±1,5 года. Средняя длительность первой ремиссии составляла 15,6±23,3 года. При разделении группы больных по полу различий клинических и демографических показателей не наблюдали (табл. 1). Участвующие в исследовании больные РРС никогда не принимали иммуномодулирующих препаратов. Средний возраст в контрольной группе составил 31,2±6,0 года. От всех участников получено информированное согласие на проведение исследования в соответствии с разрешением этического комитета РНИМУ им. Н.И. Пирогова (№139 от 10.11.2014).

Таблица 1. Клинические характеристики участников исследования

Периферическую кровь всех индивидов, вошедших в исследование, собирали в вакуумные пробирки с ЭДТА. МНК получали из периферической крови путем центрифугирования на градиенте фиколл-гистопака («Sigma-Aldrich», США) и использовали для дальнейшего выделения из них CD4⁺ T-лимфоцитов и CD14⁺ моноцитов с помощью иммуномагнитных микрочастиц MACS («Miltenyi Biotec», Германия). Чистота полученных субпопуляций, проанализированных с помощью проточной цитометрии, во всех образцах составила более 97 и 95% соответственно. Очищенные CD14⁺ и CD4⁺ клетки лизировали при помощи QIAzol Lysis Reagent («Qiagen», Германия) и хранили при температуре –80 °C до дальнейших манипуляций.

Из клеточных лизатов выделяли тотальную РНК, содержащую фракцию микроРНК с использованием набора miRNeasy Mini Kit («Qiagen,» Германия). Все образцы РНК характеризовались показателем целостности РНК >8.

Экспрессию генов микроРНК miR-337-3p, -370, -655, -494, -323b-3p, -654-3p, -539, -668, -300 и -380 анализировали методом обратной транскрипции с последующей количественной ПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦР) с использованием дельта-дельта Ct (ΔΔCt) метода. Обратную транскрипцию и оценку уровней экспрессии методом ПЦР в реальном времени проводили с использованием набора TaqMan microRNA Reverse Transcription Kit и наборов TaqMan miRNA Assays соответственно (все реактивы производства «ThermoFisher Scientific», США). Экспрессию исследуемых микроРНК нормализовали на малую ядрышковую РНК RNU48 в качестве эндогенного контроля. Значимость различий в уровнях экспрессии микроРНК между сравниваемыми группами оценивали с помощью теста Манна—Уитни. МикроРНК считали дифференциально экспрессирующейся при p<0,05.

Для исследования согласованности экспрессии miR-337-3p, -665 (кластер 14q32.2 в составе локуса DLK1-DIO3) и miR-370, -494, 323b-5p, -654-3p, -539, -668, -300, и -380, (кластер 14q32.31) проводили корреляционный анализ с расчетом коэффициента ранговой корреляции Спирмена (ро) в программе GraphPad Prism.

Результаты

Выбор микроРНК из локуса DLK1-DIO3 для исследования проводили на основании данных полнотранскриптомного анализа экспрессии микроРНК в МНК, выполненного нами ранее [5]. В результате были отобраны 10 ранее не изученных микроРНК из локуса: miR-337-3p, -370, -655, -494, -323b-3p, -654-3p, -539, -668, -300 и -380, расположенные в разных его структурных единицах. Ввиду того, что высокопроизводительное секвенирование, с помощью которого был выполнен полнотранскриптомный анализ, отличается низкой чувствительностью, приводящей к появлению ложноотрицательных результатов, микроРНК были выбраны не только из числа выявленных при данном анализе, но и из тех, гены которых не были детектированы в локусе DLK1-DIO3 с помощью секвенирования.

Для оценки возможности использования собранной выборки при изучении экспрессии микроРНК из локуса DLK1-DIO3 в CD14⁺ и CD4⁺ клетках провели для начала анализ их экспрессии в неразделенных на субпопуляции МНК больных РРС по сравнению со здоровыми контролями (рис. 1 и табл. 2, левая панель). Анализ показал, что уровни экспрессии в МНК всех микроРНК, выбранных для исследования на основании различных критериев, а именно miR-337-3p, -665, -370, -380, -494, -654-3p, -300, -539, -668 и -323b-5p, у больных РРС мужчин были повышены по сравнению со здоровыми мужчинами; различия экспрессии (fold change, FC) находились в пределах от 2,00 до 8,08. Уровни исследуемых микроРНК у женщин не различались.

Рис. 1. Уровни miR-337-3p, -370, -655, -494, -323b-3p, -654-3p, -539, -668, -300 и -380 в МНК у больных РРС и здоровых контролей (у мужчин и женщин).

Результаты представлены в виде диаграммы размаха в логарифмической шкале, где обозначены медиана, минимальное и максимальное значения выборки, а также 25-й и 75-й процентили. * — p<0,05, ** — p<0,005, *** — p<0,0005.

Таблица 2. Количественное сравнение уровней экспрессии miR-337-3p, -370, -655, -494, -323b-3p, -654-3p, -539, -668, -300 и -380 в МНК между четырьмя группами, различающимися по полу и статусу «здоровый/больной»

Примечание. Здесь и в табл. 3 и 4: жирным шрифтом выделены значимые различия экспрессии микроРНК между двумя сравниваемыми группами (p<0,05).

У здоровых количественная оценка уровней экспрессии анализируемых микроРНК показала, что уровень экспрессии всех микроРНК у мужчин был ниже, чем у женщин (FC <0,66); различия в уровнях экспрессии miR-665 и miR-300 были статистически значимыми (p<0,043); при аналогичном сравнении больных РРС разных полов уровни экспрессии большинства микроРНК не отличались, однако у мужчин с РРС наблюдали значимое повышение уровня экспрессии miR-539 (FC=1,99; p=0,043) (см. табл. 2, правая панель).

Таким образом, результаты анализа экспрессии выбранных микроРНК в МНК подтверждают их вовлеченность в развитие РРС у мужчин и делают возможным использование этой выборки для изучения вопроса о том, какие именно клетки в составе МНК отвечают за наблюдаемый эффект. Анализ экспрессии генов выбранных микроРНК miR-337-3p, -370, -655, -494, -323b-3p, -654-3p, -539, -668, -300 и -380 в CD14⁺ и CD4⁺ клетках у мужчин и женщин показал различия в их паттернах экспрессии некоторых из них, однако массовых однонаправленных изменений не наблюдали (рис. 2).

Рис. 2. Уровни miR-337-3p, -370, -655, -494, -323b-3p, -654-3p, -539, -668, -300 и -380 в CD14+ (а) и CD4+ (б) клетках у больных РРС и здоровых контролей (мужчин и женщин).

Результаты представлены в виде диаграммы размаха в логарифмической шкале, где обозначены медиана, минимальное и максимальное значения выборки, а также 25-й и 75-й процентили. * — p<0,05.

Отмечали лишь дифференциальную экспрессию отдельных микроРНК при некоторых сравнениях. Так, в CD14⁺ клетках выявлены 2 дифференциально экспрессирующиеся микроРНК: miR-494 была значимо снижена у женщин при сравнении больных РРС и здоровых (FC=0,59; p=0,026) (рис. 2, а, правый, табл. 3), а miR-668 — значимо снижена (FC=0,46; p=0,026) при РРС у мужчин при сравнении с женщинами (см. табл. 3).

Таблица 3. Количественное сравнение уровней экспрессии miR-337-3p, -370, -655, -494, -323b-3p, -654-3p, -539, -668, -300 и -380 в CD14⁺ клетках между четырьмя группами, различающимися по полу и статусу «здоровый/больной»

В CD4⁺ клетках значимым было повышение экспрессии miR-337-3p при сравнении больных РРС мужчин и здоровых мужчин (FC=2,62; p=0,0082) (рис. 2, б, левый, и табл. 4), а также miR-539 и miR-300 у мужчин по сравнению с женщинами в группе больных РРС (FC=1,87; p=0,012 и FC=1,91; p=0,026 соответственно) (см. табл. 4). Уровни экспрессии остальных анализируемых микроРНК и в CD14⁺, и в CD4⁺ клетках не отличались между больными РРС и здоровыми контролями в группе как мужчин, так и женщин (см. табл. 3 и 4).

Таблица 4. Количественное сравнение уровней экспрессии miR-337-3p, -370, -655, -494, -323b-3p, -654-3p, -539, -668, -300 и -380 в CD4⁺ клетках между четырьмя группами, различающимися по полу и статусу «здоровый/больной»

Таким образом, можно предположить, что основной регуляторный эффект микроРНК из импринтированного локуса DLK1-DIO3, наблюдаемый в МНК при РРС у мужчин, определяется экспрессией микроРНК не в CD14⁺ и CD4⁺ клетках, а в других, пока не изученных клеточных субпопуляциях МНК.

Для оценки согласованности экспрессии всех исследуемых микроРНК в CD14⁺ и CD4⁺ клетках проводили корреляционный анализ. На рис. 3 изображены матрицы полученных корреляций для мужчин (слева) и женщин (справа), указаны их значимость и коэффициенты корреляции. Высокой согласованности изменений в экспрессии микроРНК в исследуемых клеточных субпопуляциях не наблюдалось. Однако следует отметить, что все значимые корреляции были положительными (r>0,79, p<0,05).

Рис. 3. Корреляционные матрицы уровней miR-337-3p, -370, -655, -494, -323b-3p, -654-3p, -539, -668, -300 и -380 в CD14⁺ и CD4⁺ клетках у мужчин (слева) и женщин (справа) из групп контролей и больных РРС.

В ячейках верхней половины матрицы (относительно диагонали с перечисленными микроРНК) представлены коэффициенты корреляции, рассчитанные при попарном сравнении экспрессии микроРНК у здоровых контролей, в нижней — у больных РРС. Статистически значимые корреляционные (p<0,05) выделены жирным шрифтом и светло-серым цветом. МикроРНК выделены темно-серым цветом.

При более подробном рассмотрении можно заметить, что в CD14⁺ клетках из 45 анализируемых пар 7 (miR-337-3p/miR-370, miR-323b-3p/miR-665, miR-654/miR-337-3p, miR-539/miR-337-3p, miR-539/miR-370, miR-539/654, miR-668/miR-323b-3p) коррелируют в группах здоровых мужчин, здоровых женщин и больных РРС женщин (табл. 5). При этом наблюдали 3 (43%) общие коррелированные пары микроРНК (miR-337-3p/miR-370, miR-654/miR-337-3p и miR-539/miR-370) как у здоровых мужчин, так и женщин. В то же время при сравнении индивидов по полу, 6 (86%) коррелированных пар оказались идентичными у больных и здоровых женщин (miR-337-3p/miR-370, miR-323b-3p/miR-370, miR-323b-3p/miR-337-3p, miR-323b-3p/miR-654, miR-654/miR-370 и miR-654/miR-337-3p). Таким образом, наблюдается гетерогенность по составу коррелированных пар при сравнении индивидов с одинаковым статусом «здоровый или больной», и, напротив, гомогенность — при сравнении индивидов одинакового пола. В CD4⁺ клетках коррелированных пар микроРНК в анализируемых группах обнаружено еще меньше, при этом качественный состав коррелированных пар между изучаемыми клеточными субпопуляциями различался: только 2 пары микроРНК (miR-337-3p/miR-654 у больных РРС женщин и miR-337-3p/miR-370 у здоровых женщин) из 23 и 15, выявленных в CD14⁺ и CD4⁺ клетках соответственно, были идентичными. У здоровых мужчин коррелированных пар микроРНК в CD4⁺ лимфоцитах не было выявлено. В остальных группах отмечали высокую корреляцию только для 5 пар микроРНК, которые можно назвать индивидуальными для анализируемых групп, поскольку качественный состав наборов в этих группах отличался.

Таблица 5. Количество коррелированных пар микроРНК, выявленных в CD14⁺ и CD4⁺ клетках при сравнении четырех анализируемых групп: больные РРС и здоровые контроли, мужчины и женщины

Следует отметить, что коэкспрессия наблюдалась как для генов микроРНК, как расположенных внутри одного кластера (14q32.31), так и для локализованных в разных кластерах локуса. В целом корреляционный анализ в отдельных популяциях клеток выглядит разрозненным, что может быть следствием меньшей выборки, используемой в исследовании, или включением различных посттранскрипционных механизмов регуляции их экспрессии.

Обсуждение

Исследование показало ассоциацию 10 ранее неизученных микроРНК miR-337-3p, -370, -655, -494, -323b-3p, -654-3p, -539, -668, -300 и -380 из локуса DLK1-DIO3 в МНК с развитием РРС. Все эти микроРНК, выбранные для анализа по разным, описанным выше критериям, характеризовались значимым повышением экспрессии у больных РРС мужчин по сравнению с мужчинами из контрольной группы. Наблюдаемые результаты свидетельствуют о необходимости воспроизведения данных полнотранскриптомных исследований более чувствительным методами. Вопрос о том, являются ли наблюдаемые изменения в экспрессии микроРНК причиной развития РРС или его следствием, остается открытым и нуждается в дальнейшем изучении. Полученные нами данные говорят также о необходимости использования гендерного подхода при изучении РРС.

Дальнейший анализ экспрессии микроРНК из импринтированного локуса в отдельных субпопуляциях МНК — CD14⁺ и CD4⁺ клетках — показал изменения экспрессии лишь отдельных микроРНК; вероятнее всего, наблюдаемый паттерн экспрессии микроРНК в МНК определяется другими клеточными субпопуляциями. Изучение механизмов регуляции экспрессии генов микроРНК с кластерной организацией позволит продвинуться в понимании наблюдаемой гетерогенности в экспрессии внутри импринтированного локуса. На данный момент существует предположение о существовании жесткой индивидуальной регуляции экспрессии микроРНК из локуса DLK1-DIO3. Так, было показано, что каждая микроРНК из локуса имеет свой собственный уникальный экспрессионный «отпечаток», паттерн экспрессии, по всей сосудистой сети; уровни этих микроРНК широко варьируют в разных типах сосудов [7]. Кроме того, разнонаправленные изменения уровней экспрессии микроРНК в пределах локуса DLK1-DIO3 были продемонстрированы при различных заболеваниях [8—10].

Описанные результаты могут объяснить наблюдаемую нами гетерогенность экспрессии микроРНК из импринтированного локуса DLK1-DIO3 в разных клеточных популяциях и делают необходимым анализ экспрессии отдельных микроРНК внутри кластеров. Это, вероятно, определяет феномен, который наблюдался для изучаемых микроРНК: корреляционный анализ в исследуемых клеточных субпопуляциях не показал высокой согласованности в экспрессии пар микроРНК вне зависимости от статуса «здоровый—больной» и пола. Различия в экспрессии некоторых микроРНК при РС в контексте полового диморфизма обсуждались нами ранее в работе [5].

Заключение

Данное исследование указывает на вовлеченность еще 10 генов микроРНК из локуса DLK1-DIO3 в развитие РРС на уровне МНК, однако основной наблюдаемый эффект более высоких уровней экспрессии микроРНК из данного локуса у мужчин с РРС по сравнению со здоровыми мужчинами достигается не за счет вклада CD14⁺ и CD4⁺ клеток. Это открывает возможности для исследования вовлеченности этих микроРНК из других клеточных субпопуляций в составе МНК в патологические процессы при РРС.

Работа поддержана грантом РНФ 20-75-00046.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.