Рассеянный склероз (РС) — аутоиммунное заболевание, характеризующееся демиелинизацией, разрушением аксонов и гибелью нервных клеток [1]. Увеличение проницаемости гематоэнцефалического барьера при РС позволяет большому числу миелинспецифических Тh-клеток проникать в ЦНС, где они активируются антигенпредставляющими клетками и способствуют развитию воспаления и нейродегенерации [2]. За последние 20 лет разработаны и внедрены в клиническую практику более 10 препаратов, изменяющих течение РС (ПИТРС), более 50 новых препаратов находятся на разных стадиях клинических исследований [3]. Все имеющиеся в арсенале неврологов ПИТРС направлены на подавление аутоиммунного воспаления в ЦНС, воздействуя на различные звенья иммунопатогенеза Р.С. Отличия препаратов заключаются как в механизмах действия, так и в путях введения. Если первые ПИТРС (интерфероны-β, глатирамера ацетат — ГА) вводились парентерально (подкожно или внутримышечно), то в последние годы зарегистрировано несколько препаратов, принимаемых перорально, что значительно повышает удобство применения и комплаентность пациентов. Необходимо отметить, что все ПИТРС обладают ограниченной эффективностью, лишь снижая частоту обострений заболевания, но не способны полностью остановить развитие патологического процесса. Это связано с многофакторностью развития РС, а также с большим количеством механизмов аутоиммунитета, вовлеченных в патогенез заболевания, что требует поиска новых патогенетических мишеней и разработки методов терапевтического воздействия.

Важную роль в патогенезе РС может играть изменение состава кишечной флоры пациентов. Интерес к изучению состава микробиоты при аутоиммунных заболеваниях связан с исследованиями [4, 5], результаты которых выявили возможность ее влияния на иммунные функции организма хозяина. В частности, было обнаружено, что отдельные представители микробиоты направляют дифференцировку наивных Т-клеток в Th17 [6, 7], а Bacteroides spp. и некоторые клостридии, в том числе Faecalibacterium prausnitzii — в регуляторные Т-лимфоциты [8, 9]. Известно также действие микробиоты на эндокринную и нервную системы [10, 11]. В ряде исследований [12—15] показано, что состав микробиоты кишечника пациентов с РС отличается от такового у здоровых, и эти изменения характеризуются как дисбиоз.

Актуальность проблемы заключается в том, что наличие дисбиоза, с одной стороны, может провоцировать развитие аутоиммунных реакций или усугублять тяжесть заболевания, а с другой — сопровождается нарушениями функций желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) у 70—90% больных РС [12, 16] и проявляется в виде кишечных симптомов (запоры или недержание кала), которые снижают качество жизни пациентов [17, 18]. В то же время предполагается, что на состав микробиоты кишечника у пациентов с РС могут оказывать влияние как парентеральные препараты, в частности ГА [14, 19], так и препараты для приема внутрь, например финголимод (ФГ) [20]. Однако до настоящего времени не ясно, что является первичным — воздействие препарата на состояние иммунной системы и последующее влияние на состояние кишечной микробиоты или, наоборот, изменение иммунного статуса пациентов, обусловленное непосредственным воздействием ПИТРС на микробиоту.

Цель исследования — выявление особенностей состава микробиоты кишечника у пациентов с РС, получающих терапию ГА или ФГ, для уточнения вопроса причинно-следственных связей между кишечной флорой и аутоиммунными процессами у этих пациентов.

В исследовании приняли участие 34 пациента с РС, наблюдающиеся в ИМЧ им. Н.П. Бехтеревой (Санкт-Петербург), подписавшие информированное согласие на участие. Больные были разделены на равночисленные группы в зависимости от принимаемого ПИТРС. Пациенты 1-й группы получали в качестве ПИТРС ГА (копаксон, «Тева», Израиль), 2-й группы — ФГ (гилениа, «Новартис», Швейцария). Препараты использовали согласно инструкциям производителей: ГА 20 мг/кг вводился подкожно 1 раз в сутки, ФГ 0,5 мг принимали внутрь ежедневно.

На момент обследования все больные находились в стадии ремиссии. Характеристика обследуемых представлена в табл. 1.

Для оценки состава кишечной микробиоты образцы фекалий исследовали бактериологическим методом, по ранее описанной методике [22] и при помощи полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Для проведения ПЦР-РВ из фекалий выделяли ДНК с помощью набора ДНК-ЭКСПРЕСС Литех, а затем использовали набор Колонофлор-16 (ООО «АльфаЛаб», Россия).

Статистический анализ проводили с помощью t-теста Стьюдента для независимых выборок в программе Statistica 8. Нормальность распределения проверяли, используя тест Шапиро—Уилка. Для сравнения долей применяли тест χ². Достоверными считали различия при p<0,05.

По результатам анкетирования у 87% обследованных пациентов выявлены расстройства функций ЖКТ (табл. 2).

Культуральным методом в образцах фекалий пациентов выявлялись симбиотические (Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., Escherichia coli, Enterococcus spp.) и оппортунистические виды бактерий (атипичные E. coli, Enterobacter spp., Staphylococcus aureus, Clostridium spp., Klebsiella spр. и грибы Candida spp.). При этом были обнаружены характерные изменения состава микробиоты кишечника на фоне применения разных ПИТРС. Содержание Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp. и Enterococcus spp. существенно не различалось между группами и соответствовало норме (рис. 1).

Уровень E. coli с нормальной ферментативной активностью был ниже нормальных показателей (7,0 lg/КОЕ/г) в обеих группах. Однако в группе ФГ отмечалась более выраженная тенденция к снижению среднего уровня (до 2,3 lg/КОЕ/г), чем в группе ГА (до 4,5 lg/КОЕ/г) (р=0,07), поскольку у 71,0% пациентов, получающих ФГ, эти микроорганизмы вообще не выявлялись или определялись на низком уровне (4,0 lg/КОЕ/г), а в группе, получающей ГА, таких пациентов было в 2 раза меньше —35,0% (р=0,039).

На фоне уменьшения E. coli с нормальной ферментативной активностью у пациентов увеличивалась представленность атипичных форм, преимущественно со сниженной ферментативной активностью: у 82,3% пациентов из группы ФГ и у 47,1% — из группы ГА (р=0,037). Средние значения составили 5,7 lg/КОЕ/г и 3,1 lg/КОЕ/г в группах ФГ и ГА соответственно (см. рис. 1, а).

Кроме того, на фоне лечения ФГ увеличивалась частота выявления другого представителя условно-патогенных энтеробактерий — Enterobacter spp. Доля пациентов группы ФГ, имеющих Enterobacter spp. в составе микробиоты кишечника, составила 64,7% против 11,8% пациентов, получающих ГА (р=0,0015) (см. рис. 1, б).

Таким образом, пероральный препарат ФГ в большей степени, чем инъекционный ГА, влиял на соотношение симбиотических и патогенных энтеробактерий.

Клебсиеллы, клостридии и стафилококки высевались у отдельных пациентов каждой группы, но не было выявлено статистически значимых различий.

Методом ПЦР-РВ подтверждено отсутствие различий в уровне Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp. и Enterococcus spp., достоверно не различалось и количество Faecalibacterium prausnitzii у пациентов, получавших ГА или ФГ (рис. 2, а).

У пациентов обеих групп соотношение B. fragilis и F. prausnitzii превышало 100 относительных единиц, что характеризуется как анаэробный дисбаланс. Хотя в группе ФГ значение этого показателя превышало таковой в группе, получавшей ГА (354 против 135), это различие не достигало уровня статистической значимости (р=0,1).

Таким образом, рассматриваемые ПИТРС при терапии РС вызывали специфические дисбиотические нарушения, характеризовавшиеся чрезмерным ростом различных микроорганизмов: Proteus spp. и Parvimonas spp. (ГА), Enterobacter spp., атипичных E. coli и Candida spp. (ФГ) на фоне сохранения количественного содержания облигатных представителей микробиоты лактобацилл, бифидобактерий, энтерококков и фекалибактерий.

В настоящее время интенсивно изучается роль резидентных микроорганизмов, населяющих кишечник, в патогенезе многих заболеваний ЦНС (заболевания аутистического спектра, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, аутоиммунные демиелинизирующие заболевания, в том числе РС) [5, 23—25]. Опубликованные данные показывают, что при РС состав микробиоценоза кишечника существенно отличается от такового у здоровых. Выявлены увеличение актинобактерий и уменьшение доли продуцентов бутирата и бактероидов, возрастание представительства видов бактерий, продуцирующих метан [14]. Что приводит к таким изменениям состава микробиоты кишечника у данной категории пациентов и как это связано с течением РС, не известно.

Установленными факторами, влияющими на состав микробиоты кишечника, являются тип питания, а также использование антибиотиков [26, 27]. Имеются единичные работы [19], указывающие, что иммуномодулирующие препараты также могут обладать таким действием. Обнаружено, что у пациентов с РС, получающих терапию ГА, микробиоценоз кишечника отличается от пациентов, не получающих терапии. При сравнении состава микробиоты больных с РС, получающих в качестве ПИТРС ГА или интерферон-β, у последних выявлен более высокий уровень Prevotella spp. [28].

Это позволяет предположить, что разные иммуномодулирующие препараты могут иметь свои бактерии-мишени. В частности, показано [29], что ГА in vitro проявляет антимикробное действие по отношению к грамотрицательным бактериям E. coli и Pseudomonas aeruginosa.

В настоящем исследовании выявлено сниженное содержание E. coli у части пациентов, получающих ГА, что может быть связано с вышеописанным феноменом. Однако механизмы этого влияния не известны, тем более что пациенты получали препарат подкожно, следовательно непосредственного контакта препарата с бактериями, населяющими кишечник, как это происходит в системе in vitro или при пероральном способе поступления препарата, не возникало.

По-видимому, ФГ также обладает выраженным действием против E. coli, поскольку в группе ФГ было наиболее сильно снижено содержание этих микроорганизмов. Тем не менее почему именно E. coli с нормальной ферментативной активностью оказались наиболее чувствительны к действию препарата — не ясно. Возможно, использование ФГ приводит к нарушению адаптивного иммунного ответа в толстой кишке и создает условия для персистенции в кишечнике Enterobacter spp., как это происходит у мышей, инфицированных другим представителем семейства Enterobacteriaceae — Citrobacter rodentium [30]. Нельзя исключить, что увеличение популяции Enterobacter spp., конкурирующих с эшерихиями за питательные ресурсы, приводит к частичному вытеснению популяции E. coli из кишечного микробиоценоза.

Интересно, что при воспалительных заболеваниях кишечника отмечается увеличение численности E. coli [31], поскольку в присутствии оксида азота, продукта процессов воспаления, эти факультативно-анаэробные бактерии получают преимущество перед анаэробными, используя оксид азота в качестве терминального акцептора анаэробного дыхания [32].

Так как эшерихии способны синтезировать ряд колицинов, антибиотикоподобных веществ, конкурировать за сайты прикрепления и метаболиты, обеспечивая тем самым колонизационную резистентность [32], вполне логично, что на фоне их уменьшения ЖКТ пациентов с РС заселяются другими грамотрицательными энтеробактериями, такими как атипичные E. coli, Proteus spp., Enterobacter spp., Klebsiella spp. Причем у больных с РС, получающих ФГ, дефицит нормальных E. coli замещается атипичными формами и Enterobacter spp., а у пациентов, получающих ГА, — атипичными формами и Proteus spp. Видимо, с различием этих микроорганизмов связано то, что при приеме ФГ у пациентов отмечается диарея, а при использовании ГА — запор.

Преобладание в составе кишечного микробиоценоза грамотрицательных бактерий, в клеточной стенке которых содержатся липополисахариды, частично выделяющиеся в окружающую среду даже неповрежденными бактериальными клетками, может вызывать как локальное воспаление, ограниченное слизистой оболочкой кишечника, так и оказывать системное воздействие на организм.

В экспериментальных исследованиях показано, что C. albicans способствуют более тяжелому течению заболевания у животных [33]. Появление грибов рода Candida у пациентов с РС в ЦСЖ может также свидетельствовать о влиянии этих микроорганизмов на течение заболевания [34].

Поскольку в настоящем исследовании эти грибы были обнаружены в составе кишечной микробиоты пациентов с РС, можно предположить, что в ЦСЖ они попадают из кишечника вследствие транслокации из-за повышения проницаемости кишечного барьера [35]. Тяжелое инфицирование кожных покровов Candida spp. у пациентов с РС отмечено при лечении натализумабом [36].

B. fragilis и В. thetaiotaomicron способствуют дифференцировке регуляторных Т-клеток, являющихся продуцентами противовоспалительных медиаторов, в том числе интерлейкина-10 [37], поэтому при снижении их количества может отмечаться смещение иммунного ответа в сторону Тh1/Тh17, создающего благоприятные условия для развития воспаления и аутоиммунных процессов. Кроме того, В. thetaiotaomicron способствует поддержанию целостности кишечного барьера и стимулирует продукцию антимикробных пептидов клетками Паннета [38].

В исследовании не выявлено уменьшения уровня F. p. у пациентов с РС по сравнению с нормальными показателями и различий в их содержании при лечении разными ПИТРС. Относительно содержания фекалибактерий в составе кишечной микробиоты при РС имеются противоречивые данные. Ряд авторов, как и мы, не обнаружили снижения уровня F. prausnitzii [14, 15, 39], другие — отмечали их уменьшение [13, 19], что может быть обусловлено различиями используемых методов определения [39].

P. micra, как и F. nucleatum часто рассматриваются в качестве маркеров колоректального рака [40]. Выявление этих бактерий у пациентов с РС позволяет предположить, что эти микроорганизмы могут быть показателем иммунодисфункции. F. nucleatum относятся к филу Fusobacteria. Показано, что уровень фузобактерий положительно коррелирует с увеличением регуляторных Th-клеток и уменьшение общего содержания фузобактерий в составе кишечной микробиоты ассоциируется с риском обострения РС у детей [41]. Интересно, что наличие Fusobacterium spp. отмечалось в биоптатах мозга, полученных от пациентов с ремиттирующим течением РС [42], хотя не ясно, какое отношение они имели к патогенезу РС, а также является ли обнаружение F. nucleatum у пациентов с РС особенностью лечения именно ФГ.

Поскольку P. micra выявлялись преимущественно у пациентов с недостаточной эффективностью лечения ГА, возможно, эти бактерии стимулируют аналогичные иммунорегуляторные пути, что и Enterococcus faecium L-3, ингибируя протективное действие Г.А. Ранее подобный эффект наблюдали в экспериментальной модели у животных при совместном использовании ГА и пробиотических энтерококков [43].

Наличие более выраженных изменений микробиоценоза кишечника у пациентов, получающих в качестве терапии ГА, соответствует большему числу жалоб на дисфункции ЖКТ.

В целом настоящее исследование подтвердило ранее выявленное наличие дисбиоза разной выраженности у пациентов с РС с уменьшением симбиотических видов и увеличением условно-патогенных и патогенных микроорганизмов [12]. Поскольку современными учеными [44] признается наличие оси микробиоты кишечника — мозга с двунаправленными влияниями. Нельзя также исключить вклад патологических процессов в ЦНС, которые запускаются в ходе РС, в изменения видового состава и разнообразия микроорганизмов, населяющих кишечник.

Таким образом, у пациентов с РС на фоне приема ПИТРС с разными механизмами действия и способами введения выявлены общие и специфические изменения состава кишечной микробиоты, которые могут быть связаны с особенностями течения основного заболевания (РС), а также симптомами нарушений функций ЖКТ. Следует отметить, что помимо разных лекарственных средств при РС, на состав кишечной микробиоты могут влиять пищевой рацион, употребление антибиотиков и другие факторы [26, 27], что лимитирует интерпретацию полученных данных.

В настоящее время представляет большой практический интерес исследование микробиоты кишечника при РС, поскольку измененное сообщество микроорганизмов в кишечнике может не только способствовать дисфункции ЖКТ, но и влиять на клиническое течение заболевания и эффективность проводимой терапии. В представленной работе исследовано влияние ГА и ФГ на клинико-лабораторные особенности дисбиотических нарушений у пациентов при терапии Р.С. Результаты показали, что при использовании этих иммуномодулирующих препаратов у пациентов с РС отмечаются специфические изменения состава кишечного микробиоценоза и нарушения функций ЖКТ. Особенности действия ГА и ФГ, а также других ПИТРС на кишечную микробиоту целесообразно исследовать более подробно с помощью метагеномных и метаболомных подходов и в дальнейшем учитывать при терапии РС.

В целом мониторирование и коррекция микробиоты может представлять новую терапевтическую стратегию при ведении пациентов с РС, имеющих нарушения ЖКТ и получающих пероральные ПИТРС.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*e-mail: i_abdurasulova@mail.ru