Введение
Для разработок методов лечения и профилактики метаболического синдрома успешно могут применяться естественные (природные) и искусственно созданные лечебные физические факторы, в частности питьевые минеральные воды (МВ) и низкоинтенсивное электромагнитное излучение (ЭМИ) сверхвысокой частоты (СВЧ), которые способны оказывать стимулирующее влияние на развитие адаптационно-защитных и компенсаторных реакций [1, 2]. Использование только одного из этих факторов — ЭМИ СВЧ — на модели метаболического синдрома выявило усиление активности белоксинтезирующих реакций и снижение уровня структурно-метаболических нарушений в печени и семенниках [3, 4]. Вместе с тем, с учетом многофакторности этиопатогенеза метаболического синдрома [5], представляется целесообразным оценить комплексное действие МВ и ЭМИ СВЧ, которое способно вызвать более широкий диапазон разнообразных ответных адаптационно-защитных реакций и, тем самым, повысить уровень противодействия патогенному фактору [6].
Цель исследования — выявить особенности развития адаптационных метаболических, светооптических и ультраструктурных реакций при комплексном действии питьевой МВ и низкоинтенсивного ЭМИ СВЧ на раннем этапе развития экспериментального метаболического синдрома.
Материал и методы
Эксперименты проведены на 28 нелинейных крысах-самцах массой 180—200 г. Исследования осуществляли в соответствии с правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных (приложение к приказу Минздрава СССР от 12.08.1997 №755) и требований Европейской конвенции по защите экспериментальных животных (Страсбург, 1986).
Моделирование метаболического синдрома выполняли с применением высококалорийной диеты, которая воспроизводит основные признаки этого заболевания [7—9]. Исследования проводили на раннем этапе развития модели: в начале эксперимента использовали питьевую МВ для повышения устойчивости механизмов адаптации и снижения уровня дезадаптационных расстройств, во второй половине эксперимента применяли ЭМИ СВЧ на поясничную область в зоне проекции надпочечников для включения (усиления) нейро-гормональных механизмов адаптации, связанных в основном с гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системой.
Модель метаболического синдрома воспроизводили в течение 60 сут с помощью высококалорийной диеты с избыточным потреблением насыщенных жиров и углеводов (добавление 20% маргарина к стандартному корму и 20% раствора фруктозы в качестве питья) [9]. Крысы были разделены на три группы: в 1-й группе (опытная) крысы получали питьевую сульфатную МВ и ЭМИ СВЧ на фоне применения высококалорийной диеты; во 2-й группе (контроль) — только высококалорийную диету; в 3-й группе (интактная) — стандартный корм.
Питьевую сульфатную МВ (концентрация сульфат-ионов 1,6 г/л, минерализация 3,6 г/л) начинали вводить на 8-е сутки от начала диеты, внутрижелудочно, 1 раз в сутки по 3 мл через иглу с оливой на конце в течение 24 сут. Через 7 сут после окончания курса поения МВ начинали проводить курс (12 процедур) низкоинтенсивного ЭМИ СВЧ от аппарата «Акватон-2» (плотность потока мощности менее 1 мкВт/см2, частота около 1000 МГц), ежедневно, по 2 мин на поясничную область (зона проекции надпочечников). Животных декапитировали на следующие сутки после окончания процедур. Объектами исследования являлись печень, тимус, кровь. В сыворотке крови определяли уровень глюкозы, инсулина и липопротеидов высокой плотности (ЛПВП) с помощью биохимического анализатора KONELAB PRIME 30i («Термофишер», Япония) и наборов «Вектор-Бест» (Россия). В печени перекисное окисление липидов (ПОЛ) определяли по реакции малонового диальдегида (МДА) [10]; для исследования антиоксидантной активности (АОА) использовали модельную систему в виде суспензии липопротеидов желтка куриного яйца [11]; содержание нуклеиновых кислот (РНК и ДНК) определяли двуволновым спектрофотометрическим методом в модификации [12]; содержание белка — биуретовым методом [13]. Для светооптических исследований кусочки печени фиксировали в нейтральном формалине, заливали в парафин, срезы окрашивали гематоксилином Эрлиха с докраской эозином. Подсчитывали число нормальных, дистрофических и некробиотически измененных гепатоцитов, число двуядерных гепатоцитов, количество ядрышек в ядрах гепатоцитов (100 клеток у каждого животного). Для электронно-микроскопических исследований кусочки печени фиксировали в 2,5% растворе глютаральдегида, постфиксировали в 1% растворе OsO4 и после обезвоживания заключали в смесь «эпон-аралдит». Исследование образцов проводили с помощью электронного микроскопа Libra 120 (Германия) с программой Carl Zeiss STM Nano Technology System Division. Осуществляли морфометрический анализ митохондрий (число, средняя и суммарная площади на стандартную площадь клетки). Функциональную активность тимуса оценивали по его массе, отношению массы тимуса к массе крысы, числу ядер тимоцитов на единицу массы тимуса и активности генома тимоцитов. Количество ядер подсчитывали на фотоэлектрическом счетчике частиц Picoscale. Структурно-функциональное состояние хроматина исследовали с помощью красителя акридинового оранжевого (АО) фотометрически при 492 нм [14]. Достоверность различий рассчитывали с помощью t-критерия Стьюдента.
Результаты и обсуждение
У животных контрольной группы наблюдалось увеличение массы тела на 54,2% по сравнению с исходным уровнем. В опытной группе масса животных по сравнению с контролем практически не изменялась (снижение на 3,8%), при этом масса тимуса повысилась на 7,9%, масса селезенки — на 21,2%, а масса надпочечников — на 7,8%. В крови крыс контрольной группы, получавших высококалорийную диету, отмечались тенденция к повышению содержания глюкозы и снижение уровня инсулина, резко возрастало содержание ЛПВП (на 60,0%; p<0,01). В печени были выявлены ослабление АОА и повышение уровня ПОЛ, снижение содержания нуклеиновых кислот (РНК и ДНК) и общего белка, развитие дистрофических и некробиотических процессов. В гепатоцитах определялись деструктивные изменения субклеточных органелл — дегрануляция и фрагментация мембран гранулярной эндоплазматической сети, уменьшение содержания рибосом и полисом, снижение численности митохондрий и деструкция их крист. Характерным являлось значительное увеличение содержания гликогена, который диффузно распределялся по всей цитоплазме, при этом происходило смещение органелл к ядру или на периферию клетки. Возрастало содержание липидных включений, что приводило к развитию процессов жировой дистрофии гепатоцитов. В тимусе наблюдались снижение численности ядер тимоцитов, ослабление активности их генома и функции органа в целом. Таким образом, развитие экспериментального метаболического синдрома сопровождалось нарушениями структурно-метаболических реакций и снижением резервных возможностей организма, что ограничивало развитие естественных полноценных адаптационно-защитных реакций в условиях постоянно действующего патогенного фактора — высококалорийной диеты.
Применение питьевой МВ и ЭМИ СВЧ на фоне действия высококалорийной диеты оказывало активирующее влияние на развитие ряда адаптационно-защитных реакций по сравнению с контролем. При этом в крови животных было зарегистрировано снижение уровня глюкозы (на 17,5%) и ЛПВП (на 9,2%). В печени отмечалось выраженное усиление АОА (на 69,1%; p<0,01) и в меньшей степени ПОЛ (на 15,5%; p=0,05), что приводило к снижению окислительного потенциала (ОП) ткани этого органа (табл. 1, рис. 1). Кроме того, при действии МВ и ЭМИ СВЧ проявлялась активация белоксинтезирующих процессов: содержание РНК и ДНК возрастало соответственно на 7,2% (p<0,01) и 11,2% (p<0,01) и общего белка на 24,5% (p=0,05). Выявленные адаптационные изменения со стороны антиоксидантной системы и белкового синтеза сопровождались усилением процессов клеточной и внутриклеточной регенерации. Об этом свидетельствовали увеличение численности нормальных (неизмененных) гепатоцитов и снижение содержания дистрофических и особенно некробиотических (апоптотических) клеток (p<0,05). Эти изменения коррелировали с увеличением размеров и повышенным числом двуядрышковых ядер (на 35,9%), что указывало на активацию синтеза РНК в этих клетках. Вместе с тем уменьшалась численность полиплоидных двуядерных гепатоцитов, которые путем деления пополняли состав нормальных одноядерных клеток. По данным ультраструктурного исследования гепатоцитов, выявлены улучшение состояния внутриклеточных ультраструктур и ослабление деструктивных процессов. Морфометрический анализ показал, что численность митохондрий достоверно возрастала по сравнению с контролем (на 48,7%; p<0,01). Однако при этом митохондрии становились более мелкими по своим размерам в связи с появлением молодых форм (средняя их площадь уменьшалась на 34,0%; p<0,01), а их суммарная площадь проявляла тенденцию к снижению (на 9,0%). В этих условиях многие митохондрии характеризовались конденсированным (электронно-плотным) матриксом с нередко расширенными кристами. Такие изменения во внутренней структуре митохондрий являются признаком усиления их функциональной активности, что можно рассматривать как адаптационную реакцию для усиления биоэнергетики клетки. В этой связи представляет интерес повышение содержания пероксисом, которые выполняют разные метаболические функции, участвуя, в частности, в углеводном и жировом обмене и, что важно отметить, в выработке энергии [15]. Их появление отражает, видимо, подключение дополнительного механизма адаптации для поддержки (усиления) биоэнергетики в ткани печени. Изменения претерпевали также белоксинтезирующие органеллы: в отдельных зонах клеток иногда наблюдалось повышенное содержание рибосом и полисом. Часто отмечались тесные контакты гранулярной эндоплазматической сети с митохондриями, местами выявлялось отчетливое расширение просветов ее цистерн, что связано с повышением функциональной активности этих органелл. Содержание гликогена в целом было неравномерно снижено, причем в отдельных гепатоцитах гликоген практически отсутствовал, в других его содержание оставалось умеренно высоким. Явления жировой дистрофии также носили гетерогенный характер, однако в целом они проявлялись слабее, чем в контроле. Во многих гепатоцитах обнаруживались жировые капли разных размеров, часть из них подвергалась процессам истощения. Активизировалась лизосомальная система: в разных гепатоцитах выявлялось повышенное число лизосом, фаголизосом, а также аутофагосом. Эти сдвиги были направлены на самоочищение клеток печени и были связаны с развитием внутриклеточной регенерации.
Таблица 1. Сочетанное воздействие МВ и ЭМИ СВЧ на метаболические процессы в печени крыс при метаболическом синдроме на фоне применения высококалорийной диеты
| Группа животных | МДА, мкмоль/л | АОА,% | ОП=ПОЛ/АОА | РНК, мкг/мл | ДНК, мкг/мл | Общий белок, г/л |
| Интактная | 8,67±0,39 | 24,86±2,43 | 0,35±0,03 | 7,98±0,22 | 7,87±0,34 | 4,27±0,40 |
| Контроль | 11,6±0,63* | 21,27±2,25 | 0,57±0,06* | 6,87±0,165* | 5,8±0,14* | 2,69±0,20* |
| МВ+ЭМИ СВЧ | 13,4±0,47 | 35,98±0,75** | 0,37±0,015** | 7,36±0,16** | 6,56±0,11** | 3,35±0,24 |
Примечание. Здесь и в табл. 2: * — p<0,01 по сравнению с интактной группой; ** — p<0,01 по сравнению с контрольной группой.
Рис. 1. Сочетанное воздействие МВ и ЭМИ СВЧ на метаболические процессы в печени крыс при метаболическом синдроме на фоне применения высококалорийной диеты.
Здесь и на рис. 2: 1 — интактная группа; 2 — контрольная группа (метаболический синдром); 3 — опытная группа (метаболический синдром + МВ + ЭМИ СВЧ). * — p<0,01 по сравнению с интактной группой; ** — p<0,01 по сравнению с контрольной группой.
В тимусе на фоне тенденции к повышению его относительной массы и численности ядер тимоцитов (на 21,5%) отчетливо увеличивалась интенсивность их связывания АО, что свидетельствовало об усилении клеточной и внутриклеточной регенерации. Эти сдвиги привели к повышению удельной активности генома тимоцитов на 60,0% (p<0,01) по сравнению с контролем и на 21,8% (p<0,01) по сравнению с интактными животными (табл. 2, рис. 2), что указывает на усиление функции этих клеток.
Таблица 2. Сочетанное воздействие МВ и ЭМИ СВЧ на функциональную активность тимуса крыс при метаболическом синдроме на фоне применения высококалорийной диеты
| Группа животных | Относительная масса тимуса (х∙10–5) | Число ядер тимоцитов на единицу массы тимуса, млн/мл | Связывание АО в ядре тимоцита, отн. ед. | Удельная активность генома тимоцитов, отн. ед. |
| Интакт | 77,24±10,80 | 39,66±3,80 | 0,52±0,06 | 20,62±0,14 |
| Контроль | 77,0±10,60 | 33,33±2,29 | 0,47±0,04 | 15,66±0,11* |
| МВ+ЭМИ СВЧ | 83,1±10,90 | 40,50±2,75 | 0,62±0,03** | 25,11±0,05** |
Рис. 2. Изменение функциональной активности тимуса при сочетанном воздействии МВ и ЭМИ СВЧ при метаболическом синдроме на фоне применения высококалорийной диеты.
A — относительная масса тимуса; B — число ядер тимоцитов на единицу массы тимуса; C — связывание АО в ядре тимоцитов; D — удельная активность генома тимоцитов.
Таким образом, сочетанное применение питьевой МВ и низкоинтенсивного ЭМИ СВЧ на раннем этапе развития метаболического синдрома способствовало усилению адаптационных метаболических и регенеративных процессов. Среди выявленных сдвигов в первую очередь следует отметить выраженное усиление активности антиоксидантной системы (при действии монофактора ЭМИ СВЧ она проявлялась значительно слабее), что повышало устойчивость мембран гепатоцитов и ослабляло возможность развития дистрофических и деструктивных процессов. Этот цитопротективный эффект сопровождался усилением белоксинтезирующих реакций, клеточной и внутриклеточной форм регенерации и, что важно отметить, повышением структурных резервов и функциональной активности клеток тимуса. Можно полагать, что выявленные адаптационные эффекты были обусловлены комплексом механизмов — антиоксидантным, мембраностабилизирующим, детоксицирующим, а также иммуномодулирующим действиями МВ и ЭМИ СВЧ. Из полученных данных следует, что нейроэндокринные и иммунные взаимодействия являются важным звеном в механизмах комплексного действия исследованных лечебных факторов. Применение МВ и ЭМИ СВЧ способно повысить устойчивость механизмов адаптации и предупредить (ослабить) развитие дезадаптационных нарушений и возникновение патологических процессов на раннем этапе экспериментального метаболического синдрома.
Заключение
На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что комплексное применение питьевой МВ и низкоинтенсивного ЭМИ СВЧ может быть перспективным методом в свете разработок новых подходов к способам лечения и профилактики метаболического синдрома на ранних стадиях его развития. Для оптимизации адаптационно-защитных и компенсаторных процессов следует использовать более адекватные режимы комплексного воздействия МВ и ЭМИ СВЧ.
Участие авторов: концепция и дизайн, написание текста и редактирование — Ю.Н. Королев; сбор материала, обработка данных — Л.В. Михайлик, Л.А. Никулина; статистическая обработка данных — Л.А. Никулина, Л.В. Михайлик.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare that there is no conflict of interest.