Введение

Увеальная меланома (УМ) занимает второе место по частоте после кожной меланомы (КМ), встречается в западных странах примерно в 36 раз реже, чем кожная меланома [1, 2]. Однако меланома сосудистой оболочки глаза является самой распространенной внутриглазной злокачественной опухолью [3]. Одним из главных отличий УМ от КМ является минимальный ответ на иммунотерапевтические методы лечения. В первую очередь это обусловлено локализацией опухоли в особой иммунопривилегированной среде глаза [4], обеспеченной гематоофтальмическими барьерами и иммуносупрессивным действием различных агентов (TGF-β, IL-10, IDO), растворенных во внутриглазной жидкости [5]. В таких условиях опухоль практически не подвергается иммуноредактированию, что, во-первых, снижает ее чувствительность к иммунотерапии, а во-вторых, способствует выживанию опухолевых клеток с низкой мутационной нагрузкой [6]. К тому же, исходя из анатомических особенностей, УМ лучше защищена от УФ-лучей в отличие от КМ, что уменьшает вероятность случайных мутаций опухолевой ДНК [7].

Принципиальные различия этих двух видов опухолей определяются их молекулярно-генетическим профилем. При КМ выявляются драйверные мутации в генах BRAF и NRAS, тогда как при УМ они встречаются крайне редко. Напротив, ключевые мутации в GNAQ и GNA11 обнаруживаются у 80—90% пациентов с УМ, но не выявляются при КМ [8,9]. Таким образом, уникальный онкогенез УМ в иммунопривилегированной и защищенной от УФ-облучения среде глаза приводит к поддержанию низкой мутационной нагрузки в клетках УМ и как следствие — к меньшей экспрессии неоантигенов, способных запускать T-клеточный иммунный ответ [7].

Помимо слабого ответа на иммунотерапию, установлено, что такие элементы опухолевого микроокружения, как фибробласты, эндотелиальные клетки, T-клетки CD8+ и CD4+, естественные клетки-киллеры (NK), являются индикаторами неблагоприятного прогноза. С неблагоприятным прогнозом ассоциируются также и макрофаги M2, представляющие собой поляризованную субпопуляцию, характеризующуюся иммуносупрессивными свойствами [10, 11]. Напротив, при других видах злокачественных новообразований высокая инфильтрация иммунных клеток в опухолевом микроокружении, как правило, коррелирует с более благоприятным прогнозом [12, 13].

Параллельно с изучением прогностического значения опухолевого микроокружения в настоящее время пристальное внимание в данном контексте уделяется молекулярно-генетическому профилированию опухолевых клеток. Ключевым прогностическим генетическим фактором считается опухолевый супрессорный ген BAP1 [14, 15]. Наше недавнее исследование [16], посвященное значимости экспрессии белка BAP1 в клетках УМ, выявило значительный рост летального исхода в группе пациентов с опухолями, в клетках которых равномерно или гетерогенно отсутствовала экспрессия BAP1. Однако суммарное значение экспрессии BAP1 и опухолевого микроокружения на данный момент изучено недостаточно.

Цель исследования — определить прогностическое значение элементов опухолевого микроокружения и экспрессии белка BAP1 в оценке выживаемости пациентов с меланомой хориоидеи.

Материал и методы

Были проведены ретроспективный анализ историй болезни и изучение операционного материала 58 пациентов (58 глаз) с диагнозом увеальной меланомы (УМ) в стадии IIIA—IIIC, которым выполнено радикальное (ликвидационное) хирургическое лечение (энуклеация пораженного глаза) в офтальмологическом отделении ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского в период с 2014 по 2023 г. Стадирование заболевания проводилось в соответствии с системой UICC TNM (8-е издание, 2017).

В исследуемой группе пациентов количество мужчин и женщин было равным. Средний возраст составил 65,5 года, медиана — 68,0 лет. Все включенные в исследование пациенты находились под динамическим наблюдением. Средняя продолжительность наблюдения составила 44 мес (диапазон 5—105 мес), медиана — 35 мес. До летального исхода наблюдение продолжалось у 20 (34,5%) пациентов, тогда как у 38 (65,5%) данные были цензурированы в связи с продолжающимся наблюдением на момент исследования.

Для минимизации влияния прогностически значимых клинических факторов на ухудшение прогноза УМ была обеспечена однородность выборки по возрасту, полу, размеру опухоли и вовлечению в процесс цилиарного тела. В исследование не включались пациенты с экстрабульбарным ростом опухоли.

Морфологическое исследование энуклеированных глаз выполняли по стандартной методике. Материал фиксировали в 10% забуференном растворе формалина, после чего заливали в парафин. Серийные парафиновые срезы толщиной 3 мкм подвергали депарафинизации по стандартной схеме, затем окрашивали гематоксилином и эозином. Для выявления экспрессии белка BAP1 проводили иммуногистохимическое (ИГХ) исследование на серийных парафиновых срезах толщиной 2 мкм. Интенсивность экспрессии маркеров оценивали, принимая во внимание концентрацию антигена и его локализацию по ранее описанной нами стратификации [16]: равномерно или гетерогенно (очагово, мозаично) отсутствующая экспрессия BAP1 в сравнении с равномерно распределенными слабой, средней или интенсивной опухолевой экспрессией BAP1. Для определения опухолевого микроокружения применяли ИГХ-исследование с антителами к CD68, CD4, CD8, CD20.

Гистологический тип УМ определяли на основе критериев Международной гистологической классификации опухолей (8-е издание, 2018 г.): веретеноклеточная меланома характеризовалась наличием более 90% веретеновидных клеток, смешанно-клеточная — содержанием 11—89% эпителиоидных клеток, а эпителиоидно-клеточная — 90% и более эпителиоидных клеток.

Статистическую обработку данных проводили с использованием программ IBM SPSS Statistics, версия 27 (IBM Corp., Армонк, Нью-Йорк, США) и Microsoft Office Excel 2016 (Microsoft, США). Выживаемость за весь период наблюдения оценивали методом Каплана—Мейера с анализом значимости различий с помощью логарифмического рангового критерия. Для выявления влияния исследуемых факторов на выживаемость применяли модель пропорциональных рисков Кокса.

Результаты

Анализ полученных данных показал, что меланома хориоидеи диагностирована в 67,2% (39/58) наблюдений. Цилиохориоидальная локализация опухоли установлена в 27,6% (16/58) случаев, тогда как иридоцилиохориоидальный вариант встречался лишь в 5,2% (3/58) наблюдений. Среднее значение горизонтального размера опухоли составило 15,4 мм, колеблясь в пределах от 9,3 до 27,1 мм; средняя толщина новообразования достигала 10,1 мм (в интервале от 8,2 до 20,0 мм).

При морфологической верификации опухолей веретеноклеточный гистологический тип был установлен в 36,2% (21/58) случаев, эпителиоидно-клеточный — в 43,1% (25/58), а смешанный — в 20,7% (12/58) наблюдений. Статистически значимой зависимости между анатомической локализацией меланомы хориоидеи и ее гистологическим типом выявлено не было (p>0,05). Признаки коагуляционного некроза и геморрагий регистрировали с равной частотой — по 13,8% (8/58). Инфильтрацию склеры определяли у 51,7% (30/58) пациентов. В 98,3% (57/58) случаев статус краев резекции расценен как R0, и лишь в 1,7% (1/58) наблюдений выявлен положительный край резекции. В большинстве (91,4% (53/58)) случаев УМ характеризовалась выраженной пигментацией; амеланотическая форма встречалась в 8,6% (5/58) наблюдений.

Экспрессия белка BAP1. При ИГХ-исследовании экспрессия BAP1 была отрицательной равномерно или гетерогенно (очагово, мозаично) в 55,2% (32/58) случаев, а в 44,8% (26/58) наблюдалась равномерная экспрессия с различной степенью интенсивности — от слабой до выраженной.

Характеристика микроокружения опухоли. Опухолевое микроокружение меланомы хориоидеи было представлено рассеянными немногочисленными макрофагами (CD68⁺) и T-лимфоцитами (CD4+, CD8⁺). Экспрессия CD68 выявлена у 31 из 58 пациентов, представлена рассеянными макрофагами и в большинстве случаев — 27,6% (16/31) не превышала 5% в поле зрения. При исследовании субпопуляции опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов (ОИЛ) установлено, что они представлены в основном T-клетками и в 51,7% (30/58) наблюдений — CD4⁺. Следует отметить, что у 36,2% (21/58) пациентов полиморфно-клеточное микроокружение было представлено как макрофагами, так и T-лимфоцитами. В 25,9% (15/58) случаев были выявлены только опухоль-инфильтрирующие T-лимфоциты. B-лимфоциты в преобладающем большинстве наблюдений представлены рассеянными клетками, а в 10,3% (6/58) выявлены лимфоидные скопления без центра размножения.

Корреляция клеточного микроокружения с гистологическим типом УМ и экспрессией BAP1. При оценке взаимосвязи между гистологическим типом УМ и наличием CD4⁺/CD8⁺/CD68⁺ клеток статистической зависимости не выявлено: маркеры встречались с сопоставимой частотой как при эпителиоидно-клеточном, так и при веретеновидно-клеточном типе (p=0,436); аналогично, различий между экспрессией этих маркеров и экспрессией BAP1 также не установлено (p=0,937).

Анализ выживаемости пациентов в зависимости от микроокружения опухоли и экспрессии гена-онкосупрессора BAP1. При анализе выживаемости методом Каплана—Мейера значения B-клеточного микроокружения для прогноза УМ не выявлено (p=0,646) (рис. 1, а). Среднее время выживания пациентов с наличием ОИЛ составило 66,7 мес, в то время как в группе без ОИЛ — 77,8 мес (см. рис. 1, б). Медиана выживаемости у пациентов с лимфоцитарной инфильтрацией опухоли составила 70 мес. У пациентов без инфильтрирующих опухоль лимфоцитов медиана не была достигнута в связи с высокой долей цензурированных наблюдений. Конечная точка в данной группе не была достигнута на момент завершения наблюдения. Однако различия в показателях этих групп оказались статистически незначимыми (χ²=1,137; p=0,286).

Рис. 1. Кривые общей выживаемости пациентов с увеальной меланомой по методу Каплана—Майера.

а — без экспрессии CD20⁺ клеток в опухолевом микроокружении (зеленая кривая) и с экспрессией CD20⁺ клеток (красная кривая); б — без экспрессии маркеров опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов (CD4⁺ или CD8⁺) (зеленая кривая) и с их экспрессией (красная кривая); в — без экспрессии макрофагального маркера CD68⁺ (зеленая кривая) и с его экспрессией (красная кривая); г — с экспрессией BAP1 (от слабой до интенсивной) на всем протяжении опухоли (зеленая кривая) и с равномерно либо гетерогенно (очагово, мозаично) отсутствующей экспрессией (красная кривая).

При оценке макрофагального маркера среднее время выживания пациентов составило 65,6 мес против 75,1 мес у пациентов без экспрессии данного маркера (см. рис. 1, в). Медиана в CD68-положительной группе составила 70 мес, тогда как в CD68-отрицательной группе медиана не была достигнута. Различия между показателями групп не были статистически значимыми (χ²=0,824; p=0,364).

При анализе совокупного влияния элементов опухолевого микроокружения (CD4, CD8, CD68) выявлено, что наличие хотя бы одного из указанных маркеров ассоциировалось с ухудшением прогноза (рис. 2). Среднее время выживания в данной группе составило 64,8 мес, тогда как в группе сравнения — 84,6 мес. Медиана в группе с экспрессией иммунных клеток составила 70 мес, во 2-й группе медиана не достигнута. Различия оказались статистически значимыми (χ²=4,407; p=0,036).

Рис. 2. Кривые общей выживаемости пациентов с увеальной меланомой по методу Каплана—Майера.

Без экспрессии CD4⁺, CD8⁺ или CD68⁺ клеток в опухолевом микроокружении (зеленая кривая) и с экспрессией этих клеток (красная кривая).

При оценке выживаемости в зависимости от характера экспрессии белка BAP1 выявлено ухудшение прогноза у пациентов с равномерно или гетерогенно (очагово, мозаично) отсутствующей экспрессией по сравнению с группой, у которой экспрессия сохранялась на всем протяжении опухоли (от слабой до интенсивной). То есть, среднее время выживания в группе больных с УМ с отсутствием экспрессии ВАР1 даже на отдельных участках опухоли составило 57,2 мес, у пациентов с экспрессией ВАР1 в опухоли — 87,6 мес (см. рис. 1, г). Медиана выживаемости при нарушенной экспрессии BAP1 составила 48 мес, тогда как в группе с положительным статусом BAP1 медиана не была зафиксирована. Различия между показателями подгрупп оказались статистически значимыми (χ²=6,81; p=0,009).

Наихудшая выживаемость отмечена у пациентов с равномерно или гетерогенно (очагово, мозаично) отсутствующей экспрессией BAP1 в сочетании с наличием хотя бы одного из маркеров CD4⁺, CD8⁺ или CD68⁺ (рис. 3, а). Среднее время выживания в данной группе составило 52,9 мес, а в группе сравнения — 87,7 мес. Медиана выживаемости в исследуемой группе составила 44 мес, тогда как во 2-й группе медиана не достигнута. Различия между показателями групп были статистически значимыми (χ²=10,085; p=0,01).

Рис. 3. Кривые общей выживаемости пациентов с увеальной меланомой по методу Каплана—Майера.

а — с равномерно или гетерогенно (очагово, мозаично) отсутствующей экспрессией BAP1 в сочетании с экспрессией хотя бы одного из маркеров CD4⁺, CD8⁺ или CD68⁺ (красная кривая) и пациенты группы сравнения (зеленая кривая); б — с экспрессией BAP1 (от слабой до интенсивной) на всем протяжении опухоли и полным отсутствием CD4⁺, CD8⁺ и CD68⁺ клеток (зеленая кривая) и пациенты группы сравнения (красная кривая).

Особый интерес представляет подгруппа пациентов с равномерной положительной экспрессией BAP1 (любой интенсивности) и полным отсутствием CD4⁺, CD8⁺ и CD68⁺ клеток (см. рис. 3, б). В этой подгруппе не зарегистрировано ни одного летального исхода за весь период наблюдения. В группе сравнения среднее время выживания составило 66,3 мес, медиана — 70 мес. Различия между показателями групп достигли статистической значимости (χ²=3,439; p=0,044).

Для уточнения влияния указанных факторов на выживаемость применена модель пропорциональных рисков Кокса. Наличие отдельных маркеров CD20, CD4, CD8 или CD68 не оказывало достоверного влияния на риск летального исхода (p>0,05). Однако при наличии хотя бы одного из маркеров иммунных клеток (CD4, CD8 или CD68) риск смертности увеличивался в 6,45 раза, при этом статистической значимости достигнуто не было (HR=6,452; 95% CI: 1,862—48,31; p=0,07). У пациентов с УМ с равномерно или мозаично отрицательной экспрессией BAP1 риск летального исхода был в 3,89 раза выше, чем у пациентов с положительной экспрессией (HR=3,885; 95% CI: 1,292—11,682; p=0,016). Следует отметить, что у пациентов с наличием иммунного микроокружения и отрицательной экспрессией BAP1 риск летального исхода возрастал в 4,49 раза (HR=4,486; 95% CI: 1,627—12,371; p=0,004).

Обсуждение

Полученные результаты подтверждают важную роль утраты экспрессии белка BAP1 как независимого прогностического маркера неблагоприятного течения УМ. Иммуногистохимический анализ показал, что в 55,2% опухолей нарушена экспрессия ядерного белка BAP1, что косвенно указывает на наличие инактивирующих мутаций в одноименном гене, которые ассоциируются с плохим витальным прогнозом. Это согласуется с результатами международных исследований, согласно которым данное генетическое событие наблюдается в 40—50% случаев УМ [17, 18].

В отличие от результатов нашего исследования, где не было выявлено зависимости выживаемости от наличия ОИЛ, ранние работы других исследователей демонстрировали негативное влияние этих клеток на витальный прогноз пациентов [19]. При этом в структуре различных субпопуляций иммунных клеток отмечали преобладание CD8⁺ лимфоцитов [10, 20], которые играют ключевую роль в подавлении иммунной активности опухолевого микроокружения через продукцию иммуносупрессивных агентов, таких как FOXP3, TGF-β и IFN-γ. В то же время другие клетки, подавляемые CD8⁺ лимфоцитами, включая регуляторные T-клетки CD4⁺ FoxP3+ (Treg), T-хелперы CD4⁺, B-клетки и NK-клетки, встречаются значительно реже и, вероятно, не имеют прогностического значения. С другой стороны, в одной из работ отечественных авторов по результатам иммуногистохимического анализа отмечается значительное преобладание CD4⁺ клеток как в первичных опухолевых узлах, так и в метастатических очагах [21]. В нашем исследовании соотношение CD8⁺ и CD4⁺ клеток было примерно одинаковым, что противоречит результатам вышеупомянутых авторов, даже с учетом неспецифического поиска CD4⁺ клеток, которые могут включать как Treg, так и T-хелперы CD4⁺. Тем не менее в работе С.В. Саакян и соавторов показана схожая картина распределения данных клеток [22]. Кроме того, нами была выявлена статистически достоверная высокая условная вероятность нахождения CD4⁺ клеток при наличии CD8⁺, что подтверждается теоретическими механизмами регуляции иммунного ответа через хемокины-рекрутеры (CCL5, CXCL9/10) и ко-активации в лимфоидных органах. Однако подобные корреляции между опухолевыми макрофагами CD68⁺ и субпопуляциями T-лимфоцитов CD4⁺ и CD8⁺ не были выявлены, что указывает на более сложные взаимосвязи между этими клетками.

Мы не обнаружили прогностического значения для выживаемости пациентов отдельных субпопуляций T- и B-клеток, а также их соотношений, как и в других исследованиях. Инфильтрация опухоли макрофагами CD68⁺ как отдельный прогностический фактор также не оказала влияния на выживаемость, что может быть связано с использованием неспецифического маркера CD68⁺, который относится как к провоспалительным макрофагам M1, так и к противовоспалительным макрофагам M2, обладающими антагонистическим воздействием на выживаемость пациентов [23]. Тем не менее при УМ, как правило, преобладают макрофаги M2, которые способствуют прогрессии опухоли [24, 25]. Недавнее исследование с использованием транскриптомики одиночных клеток выявило 4 подтипа опухоль-ассоциированных макрофагов, один из которых, МФ-С4, характеризуется низкой экспрессией M1- и M2-маркеров, но связан с наихудшим витальным прогнозом и положительно коррелирует с наличием опухоль-инфильтрирующих «истощенных» T-клеток, которые характеризуются повышенной экспрессией молекул PD-1, CTLA-4 и TIM-3. Несмотря на упрощенный анализ макрофагов, ограниченный только маркером CD68, было выявлено существенное ухудшение выживаемости пациентов, если они имели положительную реакцию на один из маркеров или их сочетания: CD68, CD4 или CD8. Этот результат соответствует данным других исследований [20, 26].

В оценке выживаемости пациентов, проведенной I.H. Bronkhorst и соавт. [20], была выявлена положительная корреляция между наличием ОИЛ и моносомией хромосомы 3 в клетках УМ, что является хорошо известным предиктором неблагоприятного прогноза [27, 28]. Однако дальнейшие исследования [15] показали, что влияние этого фактора связано с инактивирующими мутациями гена BAP1, которые оказывают большее влияние на ухудшение прогноза. Потеря BAP1 в клетках УМ способствует активации ряда генов, связанных с подавлением иммунного ответа [29]. Анализ с использованием масс-цитометрии показал, что макрофаги и T-лимфоциты, отвечая на это генетическое событие, играют ключевую роль в поддержании иммуносупрессивной среды в опухолевом микроокружении. В другом исследовании было продемонстрировано, что инактивация гена BAP1 активирует путь NF-kB, что приводит к повышению экспрессии молекул HLA класса I и способствует привлечению иммунных клеток в опухоль [30]. Наши данные подтверждают эти наблюдения. Пациенты с опухоль-инфильтрирующими иммунными клетками (CD4⁺, CD8⁺ или CD68⁺) в сочетании с утратой экспрессии белка BAP1 имели значительно худшие показатели выживаемости, чем пациенты, у которых оценка выживаемости проводилась только на основе экспрессии белка BAP1.

Особое внимание заслуживает тот факт, что пациенты с равномерной экспрессией белка BAP1 и полным отсутствием исследуемых иммунных клеток в опухоли не достигли конечной точки за весь период наблюдения, что подчеркивает важность сочетанного воздействия факторов опухолевого микроокружения и экспрессии белка BAP1 на прогноз выживаемости.

Заключение

Настоящее исследование подтвердило значимость комплексной оценки клинико-морфологических и иммуногистохимических характеристик увеальной меланомы для прогноза заболевания. Данные об иммунных маркерах (CD4, CD8, CD68) могут быть полезны для дальнейших исследований, направленных на разработку иммунотерапевтических методов лечения. Нарушение опухолевой экспрессии BAP1 в сочетании с иммунным инфильтратом опухолевого микроокружения связано с повышенным риском летального исхода, что подчеркивает их значение для стратификации пациентов.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Гришина Е.Е., Ким И.Д.

Сбор и обработка материала: Сетдикова Г.Р., Ким И.Д.

Статистическая обработка: Ким И.Д.

Написание текста: Ким И.Д., Сетдикова Г.Р.

Редактирование: Гришина Е.Е.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.